他克莫斯fk506在制備治療非小細胞肺癌藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及他克莫斯逆轉非小細胞肺癌細胞對靶向性抗腫瘤藥物耐受的新用途。本發明公開了他克莫斯FK506在制備非小細胞肺癌細胞對腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體增敏劑中的應用。FK506聯用TRAIL可以上調細胞膜表面的DR4mRNA與受體水平。這些結果表明FK506能聯用TRAIL，增強TRAIL對耐受性腫瘤的治療效果。
【專利說明】他克莫斯FK506在制備治療非小細胞肺癌藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及他克莫斯逆轉非小細胞肺癌細胞對靶向性抗腫瘤藥物耐受的新用途。【背景技術】
[0002]惡性腫瘤是危害人類健康的重大疾病。江蘇省近幾年開展了以惡性腫瘤為主的全人口死因回顧性調查，結果顯示男女性第I位死因均為惡性腫瘤，其死亡率占全部死因的27.41%。資料顯示，2003年江蘇省城市地區位于惡性腫瘤死亡前4位的分別是肺癌、胃癌、肝癌、食管癌；而農村地區為肝癌、肺癌、食管癌、胃癌。肺癌和胃癌死亡率城市明顯高于農村。尤其是通過分析1973至2004年幾種主要惡性腫瘤的死亡情況發現，肺癌死亡率大幅上升，2004年肺癌死亡率是1973年的5.65倍。由此可見，肺癌已經成為我省惡性腫瘤數一數二的“殺手”，嚴重威脅著我省人民的生存健康。
[0003]為什么在短短的幾十年間，肺癌的發病率及死亡率有如此迅猛的發展趨勢？ 1:大樣品調查研究表明肺癌的主要危險因素為吸煙和大氣污染，而近年來吸煙人數有增加的趨勢，汽車尾氣和工業廢氣的大量排放，又加重了大氣環境污染的程度。因此，隨著我省經濟的發展，城市化、工業化進程的加快，空氣污染將會越來越嚴重，這將不可避免地導致肺癌死亡率進一步增加。2:肺癌在早期時往往沒有明顯的癥狀，當有癥狀被診斷出來時，常常已經是局部晚期或晚期無法手術切除的情形。一般而言，新診斷的肺癌僅約不到20%的病人屬于早期可以有機會接受手術切除的病患。而另外80%的晚期肺癌病人則失去了外科手術根治的最佳時機。3:到 目前為止，對肺癌的治療，尤其是晚期肺癌病人缺乏非常有效的治療干預手段。
[0004]臨床上，肺癌通常分為小細胞與非小細胞肺癌兩種類型，總的肺癌病例中，非小細胞肺癌(包括肺鱗癌，肺腺癌)約占80%。因此針對非小細胞肺癌的治療研究是攻克肺癌的一項極其重要的課題，引起了全世界醫學界的廣泛關注。
[0005]如上所述，雖然手術治療是治療非小細胞肺癌的重要手段，但對絕大部分晚期肺癌病人來說手術治療并不能有效解決腫瘤轉移的問題。因此對于這些晚期或已經有遠端轉移的肺癌病人，全身性的化學治療是非小細胞肺癌多學科綜合治療的主要策略之一。尤其是化療與手術、放射等療法綜合運用能明顯防止癌腫轉移、復發，提高長期生存率。現在，非小細胞肺癌化療已經初步形成共識，通常采用順鉬加泰索帝、紫杉醇、健擇、諾維本等中的一種。根據患者的具體情況，選擇不同的組合，可以達到提高療效，降低毒性反應的目的，特別是出現了一些極具前景的新型靶向藥物，其作用機制與傳統化療藥物不同。傳統化療藥物屬于細胞毒性藥物，是通過毒性殺死腫瘤細胞，但同時不可避免會傷害正常細胞。而靶向藥物進入腫瘤細胞后，可以通過特異性作用于腫瘤生長的細胞信號途徑，抑制腫瘤細胞的增殖、浸潤、轉移，不良反應輕，患者可以很好耐受。
[0006]是目前已知的一種腫瘤細胞凋亡誘導分子，對正常細胞一般無明顯作用，是一種極具前景的抗癌藥物。然而目前研究發現，許多惡性腫瘤細胞對TRAIL具有耐藥性，使TRAIL在臨床應用中遭遇瓶頸。在這些靶向藥物中，腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumornecrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)越來越受到人們的關注。TRAIL是由Wiley于1995年檢索EST時首次發現并克隆的，是一種II型糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子家族，與相應受體結合后，可以快速誘導細胞發生凋亡。但與其它凋亡誘導分子顯著不同的是，TRAIL主要殺傷轉化細胞和腫瘤細胞，而正常細胞可以逃逸它的殺傷作用。體內研究表明，TRAIL可以明顯抑制腫瘤生長，甚至徹底清除腫瘤。TRAIL的這種腫瘤細胞選擇性殺傷作用使該蛋白在抗腫瘤方面具有很強的開發價值與潛力。但是值得注意的是，并非所有的腫瘤細胞對TRAIL都具有很強的敏感性。體外研究表明，有些腫瘤細胞對TRAIL誘導凋亡作用具有很強的耐受性。這可能與腫瘤細胞表面缺乏TRAIL受體(DR4，DR5)，或分布有假受體(DcRl，DcR2)，或過度表達一些抗凋亡蛋白如bcl-2，FLIP，surViVin有關。因此TRAIL的抗腫瘤作用因不同的腫瘤類型而異。
[0007]研究表明，非小細胞肺癌細胞對TRAIL有明顯的耐受性，但具體的機理目前并不清楚。為了充分發揮TRAIL對腫瘤細胞的選擇殺傷作用，有必要尋找新的策略以逆轉非小細胞肺癌細胞株對TRAIL的敏感性，從而達到運用TRAIL有效治療非小細胞肺癌的目的。
[0008]他克莫斯FK506是從鏈霉菌屬中分離出來的大環內酯類抗生素，廣泛應用于自身免疫疾病的治療以及器官移植導致的免疫排斥反應，但是到目前為止，將FK506用于腫瘤增敏劑治療肺癌并沒有相關報道。

【發明內容】

[0009]本發明的目的是提供他克莫斯FK506的一種新用途。
[0010]本發明公開了他克莫斯FK506在制備他克莫斯FK506在制備治療非小細胞肺癌藥物中的應用。
[0011]本發明公開了他克莫斯FK506在增強非小細胞肺癌細胞對腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)敏感 性中的應用。
[0012]基于上述應用，他克莫斯FK506用于制備非小細胞肺癌細胞對腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)增敏劑。
[0013]本發明公開了他克莫斯FK506與TRAIL —起制成藥物組合物，在制備治療非小細胞肺癌的藥物中應用。
[0014]本發明中，我們首次發現FK506能顯著增強TRAIL耐藥腫瘤細胞株，肺癌細胞株A549對TRAIL誘導凋亡的敏感性，且這種增強效應具有明顯的劑量效應和時效性。而FK506對TRAIL誘導凋亡的增敏性對PMBC以及非腫瘤細胞的正常肺支氣管細胞株HBE以及BEAS-2B無明顯作用。另外，FK506對TRAIL誘導細胞凋亡的增敏性還具有廣譜性，在對TRAIL耐藥的白血病細胞株中，FK506能明顯增強HL_60、U937對TRAIL誘導凋亡的敏感性。分子機制研究表明FK506聯用TRAIL處理的A549細胞中，參與凋亡調控的相關蛋白發生應答，其中TRAIL受體DR4的表達水平顯著增加，FK506聯用TRAIL可以上調細胞膜表面的DR4mRNA與受體水平。這些結果表明FK506能聯用TRAIL，增強TRAIL對耐受性腫瘤的治療效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1FK506劑量依賴性地增強A549細胞對TRAIL誘導的凋亡。[0016]圖2FK506時間依賴性地增強A549細胞對TRAIL誘導的凋亡。
[0017]圖3BEAS-2B與A549細胞對FK506聯用TRAIL誘導凋亡的敏感性比較。
[0018]圖4PBMC與A549細胞對FK506聯用TRAIL誘導凋亡的敏感性比較。
[0019]圖5HBE與A549細胞對FK506聯用TRAIL誘導凋亡的敏感性比較。
[0020]圖6FK506聯用TRAIL對白血病細胞U937的凋亡的影響。
[0021]圖7FK506聯用TRAIL對白血病細胞HL-60的凋亡的影響。
[0022]圖8FK506聯用TRAIL對白血病細胞K562的凋亡的影響。
[0023]圖9FK506聯用TRAIL對白血病細胞CCRF-CEM的凋亡的影響。
[0024]圖10FK506聯用TRAIL增強A549細胞促凋亡蛋白的應答。
[0025]圖11FK506聯用TRAIL增強A549細胞表面DR4的水平。
[0026]圖12不同劑量的FK506聯用TRAIL對DR4mRNA水平的影響。
[0027]圖13FK506聯用TRAIL時間依賴性地上調DR4mRNA水平。
[0028]圖14FK506聯用TRAIL DR4mRNA轉錄后調控水平的影響。
【具體實施方式】
[0029]1、實驗材料、試劑
[0030]細胞:A549(ATCC，CCL_185，由中國科學技術大學生命科學學院吳清發課題組惠贈)用含10%的FBS、1%的鏈霉素青霉素雙抗的DMEM培養基培養，HBE、BEAS-B、U937、HL-60、K562 (該5株細胞系由南京大學生命科學學院徐強課題組惠贈)、CCRF-CEM (由南京大學化學化工學院朱俊杰課題組惠贈)以及從新鮮抗凝血(來自江蘇省南京市省腫瘤醫院)分離的PBMC細胞用含10%的FBS、1%的鏈霉素青霉素雙抗RPMI1640培養基培養。
[0031]分子試劑:單核細胞分離液(TBD，LDS1075)、全血及組織稀釋液(TBD，2010X1119)、MLV 反轉錄試劑盒(MBI，K1621)、Taq 酶(sangon, SC0010) )、Trizol (sangon, SK1312)、Annexin V-eGFP、碘化丙旋(PI)、放線菌素(ActD, sigma,A14105mg), PARP antibody(Oncogene, AM30-100ug) >caspase3antibody (CST, #8610)、caspase8antibody(CST, # I C I 2)、caspase9antibody(CST, #5902)> FLIP L ant ibody (santa cruz，H-1 50)、FLIP s/L antibody ( santa cruz, H-202)、BCL_2antibody (CST, #2876)、BCL-xLantibody (CST, #2762)、BAX antibody (BD, 556467)、DR4antibody (IMGENEX, IMG-141A),DR5antibody (IMGENEX, IMG-120A)、Alexa Fluor488Goat Ant1-Mouse IgG (invitrogen,A11029)> Goat Ant1-Mouse IgG(santa cruz, SC-2005)、Goat Ant1-rabbit IgG(santacruz, SC-2004) > normal IgG (santa cruz,SC-2025)
[0032]2、PCR 引物
[0033]用于半定量檢測DR4mRNA表達水平的引物為
[0034]RT DR4F:5’ -CTGTGCTGATTGTCTGTTGTTGC-3’ (SEQ ID N0.1);
[0035]RT DR4R:5’-GCCTCCTCCTCTGAGACCCTT-3’ (SEQ ID N0.2)
[0036]內參引物為 RT GAPDH F:5’ -CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3’ (SEQ ID N0.3);
[0037]RT GAPDH R:5’ -GCAGGAGGCATTGCTGAT-3’ (SEQ ID N0.4)。
[0038]3實驗方法:[0039]3.1PBMC 分離
[0040]取新鮮的抗凝血10mL，與全血及組織稀釋液1:1混勻，將混合液小心疊加于分離液的液面上(混合液:分離液=2:1),可以分成3個15mL離心管，500g, RT離心15min,小心取出離心管，此時離心管分為4層，最上層為血漿層，其次是乳白色的淋巴細胞層，第三層是透明分離液層，最下面是紅細胞層，吸掉第一層，小心將第二層取出，加入IOmL的RPMI1640培養基(含有10%的FBS和1%的鏈霉素青霉素雙抗)重新懸浮細胞，2000rpm離心lOmin，再重復一次。用少量RPMI1640培養基懸起，按照實驗需求進行相應稀釋，并轉移入細胞培養板中進行培養。
[0041]3.2.流式細胞儀檢測細胞凋亡
[0042]3.2.1樣品制備
[0043](I)細胞培養和刺激誘導凋亡，對于貼壁細胞，則更換掉原培養基，換成加藥培養基；對于懸浮細胞則不用換液，直接將按比例稀釋的加藥培養基加到原細胞培養基中；
[0044](2)貼壁細胞收集:先去培液，用預冷的PBS洗滌一遍，加胰酶消化2min，用含血清的培液終止胰酶作用，收集細胞，每樣本細胞數控制在(I~10) X 106/mL, 2000rpm/min, 4°C離心5min,棄去培養液；
[0045](3)用預冷的PBS洗漆細胞I次，4°C 2000rpm/min離心5min,棄上清；
[0046](4)用結合緩沖液洗漆細胞I次，4°C 2000rpm/min離心5min,棄上清；
[0047](5)配制標記溶液:用結合緩沖液稀釋至終濃度為I μ g/mL的Annexin V_eGFP,用400 μ I的標記溶液重懸細胞，冰上避光孵育15min。
[0048](6)每管再加入碘 化丙碇(PI)終濃度為I μ g/mL，將細胞轉移到流式試管。細胞在I小時內用流式細胞儀分析。
[0049]3.2.2流式細胞儀分析
[0050](I)先打開電源開關啟動儀器本體，再打開計算機。流式細胞儀激發光波長采用Ex.=488nm的氬離子雷射，eGFP綠色熒光用FLlchannel檢測，FLlPMT熒光光譜峰值落在綠色范圍(波長515-545nm)，PI紅色熒光用FL3channel檢測，FL3PMT熒光光譜峰值落在深紅色范圍(波長>650nm)；
[0051 ] (2)建立對數FL1-FL3散點圖，收集樣品細胞，并對上一步中圈出的細胞進行分析，調節參數，使絕大部分細胞處在左下象限中心區域；接著通過凋亡陽性細胞確定FLl凋亡象限的劃分。
[0052](3)依次上樣待檢測樣品并分析結果。
[0053]3.3.流式細胞儀分析檢測細胞表面受體
[0054]3.3.1樣品制備
[0055]( I)細胞培養和刺激誘導凋亡；
[0056](2)貼壁細胞收集:先去培液，用預冷的PBS洗滌一遍，加胰酶消化2min，用含血清的培液終止胰酶作用，收集細胞，每樣本細胞數控制在(I~10) X 106/mL, 2000rpm/min, 4°C離心5min,棄去培養液；
[0057](3)用預冷的PBS洗漆細胞I次，4°C 2000rpm/min離心5min,棄上清；
[0058](4)用1%(W/V)的BSA (PBS配制)稀釋抗體DR4 (mouse)抗體(1:100稀釋)，終濃度為5ug/mL, control為同種屬(mouse)的IgG冰上標記細胞lh, PBS洗兩遍,4°C 2800rpm/min離心5min,棄掉；
[0059](5)用 1% 的 BSA 稀釋 Alexa Fluor488Goat Ant1-Mouse IgG (1:200 稀釋)，冰上標記細胞0.5h,注意避光,標記后PBS洗兩遍,4°C 2800rpm/min離心5min,準備上機。
[0060]3.3.2上機進行流式細胞儀分析
[0061](I)先打開電源開關啟動儀器本體，再打開計算機。
[0062](2)啟動 cell quest 程序,建立直方圖 FLl-cell counter。
[0063](3)通過陽性細胞樣品和陰性細胞樣品設定Ml陰性值邊界。
[0064](4)依次上樣待檢測樣品并分析結果。
[0065]3.4.Western blot
[0066](I)電泳:根據《分子克隆》配制不同濃度的SDS-PAGE下層分離膠，5%的上層濃縮膠，將制備好的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳；
[0067](2)轉膜(濕法):在轉膜塑料夾上從負極到正極依次鋪轉膜緩沖液浸濕的濾紙、SDS-PAGE膠、PVDF膜(使用前在甲醇中泡約lOsec)、濾紙，用玻璃棒輕輕排去氣泡，在預冷的轉膜液中恒流300mA轉膜，轉膜時間按蛋白分子量而定。；
[0068](3)封閉:用5%脫脂牛奶室溫搖床包被約0.5h ；
[0069](4)包被一抗:用合適大小雜交袋封膜，加入用5%脫脂牛奶稀釋的一抗，室溫搖床包被約2h或4°C過夜；
[0070](5)洗一抗:用IXPBST洗PV`DF膜5minX3次(根據不同抗體選擇合適的洗膜時間和次數);`
[0071](6)包被二抗:用合適大小雜交袋封膜，加入5%脫脂牛奶稀釋的二抗，室溫搖床包被Ih左右；
[0072](7)洗二抗:用 1\卩851'洗？￥0?膜51^1^3次；
[0073](8)底物反應:PVDF膜控干后正面向上放在保鮮膜上，滴加合適體積的化學發光液鋪勻，反應約Imin后用吸水紙吸去PVDF膜多余水分，放入化學反光檢測儀檢測，其中曝光時間根據蛋白表達量而設定。
[0074]3.5.細胞mRNA的提取
[0075]實驗用品都要提前用DEPC處理并滅菌，整個過程主要防止RNA酶的污染。鋪細胞于六孔板，培養并處理細胞后，收細胞。用PBS洗滌，然后加入Iml/孔的Trizol，用槍吹打至細胞完全溶解并收集到EP管中。室溫放置5min后每個樣中加入0.2倍體積的氯仿，振蕩15秒后放置2-3min，離心12000rpmX 15min,4°C。小心吸取上層轉移到干凈的EP管中，加入上清體積0.8-1倍體積的異丙醇,混勻后放置IOmin7VC離心12000rpmX IOmin,。可見RNA沉淀,棄去上清,用lml75%乙醇洗漆，8000rpm離心5min后，晾干RNA沉淀,加入30 μ I預熱的DEPC水溶解。待RNA溶解后對RNA進行定量，記錄提取的RNA樣品的濃度以及 Α260/Α280 值。
[0076]3.6.半定量 RT PCR
[0077](I)采用MBI反轉錄試劑盒進行反轉錄。取一個干凈的1.5mL EP管，依次加入下列各組分，混勻，微離心，65°C , 5min,4°C冷卻5min。
[0078]
【權利要求】
1.他克莫斯FK506在制備非小細胞肺癌細胞對腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體增敏劑中的應用。
2.他克莫斯FK506與腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體聯用在制備治療非小細胞肺癌藥物中的應用。`
【文檔編號】A61P35/00GK103622957SQ201310674818
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月11日 優先權日:2013年12月11日
【發明者】殷武, 馬林 申請人:南京大學