一種用于microRNA靶向傳遞的納米載體復合物及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于microRNA靶向傳遞的納米載體復合物及其制備方法與應用。所述載體復合物為由魚精蛋白硫酸鹽、透明質酸和目的microRNA組成納米復合體系，其中目的microRNA為具有癌癥抑制功能微小RNA類似物（microRNA?mimics）。帶正電荷的魚精蛋白硫酸鹽能通過靜電作用與帶負電荷的透明質酸自組裝形成納米載體，形成過程中包裹microRNA，給予microRNA有效的保護，避免microRNA被RNA酶降解。本發明以透明質酸和魚精蛋白作為microRNA載體，材料來源廣、價格低，同時制備過程簡單，溫和；同時納米載體中的組成成分透明質酸，具有主動靶向腫瘤的能力，在microRNA治療癌癥方面具有良好的應用前景。
【專利說明】—種用于microRNA朝向傳遞的納米載體復合物及其制備方法與應用
【技術領域】:
[0001]本發明屬于納米材料生物醫學領域。本發明涉及一種祀向遞送microRNA納米載體復合物，具體涉及一種用于靶向性治療乳腺癌的包裹腫瘤抑制功能的microRNA的透明質酸/魚精蛋白聚離子復合物納米載體的制備方法和應用。
【背景技術】:
[0002]MicroRNA是一類長度為18_25個核昔酸的單鏈非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，主要通過與靶mRNA的3’端非翻譯區(3’UTR)完全或部分互補配對結合，導致靶mRNA降解或翻譯受到抑制，從而在轉錄后水平負調控靶基因的表達。大量的科學研究表明，microRNA廣泛參與了生物體多種生理及病理過程，如個體發育，細胞增殖，調亡和分化，代謝，免疫與應激反應的調節，腫瘤形成等。
[0003]MicroRNA不穩定,極易被廣泛存在的核酸酶降解。開發microRNA分子藥物的主要障礙在于如何使microRNA通過細胞膜，并且傳遞到細胞內發揮降解靶基因mRNA的作用。目前，病毒型microRNA載體雖然傳遞效率高，但是生物安全性限制了它的應用。非病毒microRNA載體，包括合成納米顆粒聚合體和脂質體載體來進行運輸等方法在一定程度上改善了 microRNA的效果。microRNA能發揮良好效應的關鍵的是在把microRNA運到祀組織和靶細胞之前要保證其活性，不被降解。因此，如何選擇合適的載體提高目標microRNA攜帶進入相關組織細胞的效率，并且保護microRNA不被降解,是實現microRNA治療的難題。
[0004]乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率已躍居女性惡性腫瘤第一位，為女性的頭號殺手。乳腺癌具有易侵略性，易轉移和易復發的特點。目前化療是乳腺癌主要的治療手段，但眾所周知化療存在極大的副作用。CD44分子是細胞表面的一種跨膜糖蛋白，主要參與腫瘤細胞與宿主細胞和宿主基質的粘·附。研究發現CD44在腫瘤侵襲和轉移過程中⑶44發揮了重要的作用。⑶44的表達與乳腺癌的生長、浸潤、轉移和預后相關。研究顯示CD44在乳腺癌中過表達，為腫瘤細胞的增殖、分化、轉移和侵襲提供微環境。
[0005]聚合物非病毒載體成為目前基因載體的研究熱點。其中，聚離子復合物(Polyioncomplex)納米載體膠束也是近年來非病毒載體以及納米自組裝領域研究的一個熱點。它是由兩種帶相反電荷的聚合物或者生物大分子通過靜電作用復合而成的納米微球。作為納米載體，聚離子復合物膠束除了具有傳統聚合物膠束的特點外，還有其獨特的優勢:(I)載藥范圍廣泛，既可以通過靜電作用或氫鍵作用負載親水性藥物，也可以負載基因類藥物；
(2)納米載體形成過程基本在水溶液中進行，條件溫和，制備方法簡單，并且避免了有機溶劑的使用，可以消除溶劑殘留引發的毒副作用。
[0006]透明質酸(Hyaluronic acid, HA)是一種天然的聚陰離子聚合物,具有無毒性、無免疫原性、無致炎性、生物相容性好、生物可降解等優點，其作為藥物和基因載體已成為抗腫瘤藥物研究熱點之一。透明質酸還可以和CD44分子特異性結合，具有靶向乳腺癌的能力。魚精蛋白硫酸鹽(Protamine sulfate),是一種陽離子性多肽,其生物安全性好,常用于DNA濃縮和轉染。帶負電荷的透明質酸和帶正電荷的魚精蛋白通過靜電相互作用形成納米載體并且包裹microRNA。這種通過靜電相互作用自組裝形成的納米顆粒，避免了有機溶劑和復雜制備過程造成的microRNA生物活性的降低，同時，納米載體中的組成成分透明質酸是一種天然的靶向基團，有利于靶向運輸microRNA，提高靶細胞和靶組織的攝取，并進行抗腫瘤效果的研究，迄今為止，尚未見報告。

【發明內容】
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[0007]本發明的目的是提供一種透明質酸和魚精蛋白硫酸鹽通過靜電相互作用，自組裝形成聚離子納米顆粒，同時包裹microRNA,形成具有microRNA遞送功能的納米載體,該載體具有制備過程安全快捷簡單，納米粒徑均勻，表面電位合適，microRNA包載效率高，基因遞送效果好，基因沉默效率聞等優點。
[0008]本發明包裹microRNA的透明質酸/魚精蛋白聚離子納米載體，是由透明質酸和魚精蛋白硫酸鹽兩個組分按照一定的質量比，在水中通過靜電相互作用，自主裝形成多聚離子復合物。
[0009]優選的，上述的透明質酸分子量為23萬，其具有靶向乳腺癌MDA-MB-231細胞⑶44跨月吳蛋白的功能，魚精蛋白硫Ife鹽來源于娃魚，microRNA為乳腺癌中低表達的，具有抑制乳腺癌發生和發展的miR-34a，其序列為:
[0010]MiR-34a: Sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT
[0011]Antisense:ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT
[0012]其中，透明質酸在水溶液中濃度配制為2mg/mL，魚精蛋白硫酸鹽在水溶液中的濃度配制為lmg/mL，透明質酸溶液與魚精蛋白溶液都按照ImL相互緩慢的混合，其中在混合之前,microRNA加入到透明質酸相中,microRNA使用量為20 μ g,形成透明質酸與魚精蛋白質量比為2:1。結合本發明實施例中的實驗結果表明，采用上述質量配比，能夠使本發明的透明質酸/魚精蛋白聚離子納米載體粒徑小并且分散均勻，納米產率最高，microRNA包裹效率最高。
[0013]一種包載腫瘤抑制功能microRNA的透明質酸/魚精蛋白多聚離子納米復合載體的制備方法，包括以下步驟:
[0014](1)將透明質酸加入到無RNA酶的水中，使透明質酸質量濃度為2mg/mL，過220nm的生物濾膜。
[0015](2)將魚精蛋白硫酸鹽加入到無RNA酶的水中，使透明質酸質量濃度為lmg/mL,過220nm的生物濾膜。
[0016](3)將microRNA溶解于無RNA酶的水中，配制成20 μ g/mL的濃度。
[0017](4)將ImL步驟(3)中的microRNA溶液與ImL步驟(1)中的透明質酸溶液混合，渦旋震蕩均勻，得混合液。
[0018](5)將ImL步驟⑵中的魚精蛋白溶液，緩慢的滴加到步驟⑷中得到的混合液中，并且渦旋震蕩均勻，孵育20-30分鐘。
[0019]本發明制備過程中，步驟(4)中優選的透明質酸和microRNA溶液體積為ImL,步驟(5)中ImL的魚精蛋白溶液加入到上述混合溶液中，使得透明質酸與魚精蛋白質量比為2:1.[0020]本發明制備過程中，所用的microRNA是在乳腺癌中低表達的miR_34a，具有特異性的針對⑶44和notch-?的腫瘤抑制功能的microRNA。
[0021]優選地，透明質酸與魚精蛋白質量比控制為2:1，上述形成的納米顆粒的平均粒徑為201.4nm，表面zeta電位為-23.6mV，納米顆粒產率為39%，microRNA-34a包裹效率為87.2%。
[0022]從分子結構上分析，本發明提供的microRNA納米載體是由帶負點荷的透明質酸與帶正電荷的魚精蛋白，通過電荷相互作用，形成納米顆粒，在形成納米顆粒的過程中，包裹進了同樣帶負電荷的microRNA。其中,透明質酸與魚精蛋白分子相互纏繞,形成球形納米顆粒，從得到的納米顆粒的表面zeta電位-23.6mV可以分析出，納米顆粒表面主要由帶負電荷的透明質酸組成。負電荷透明質酸在納米顆粒的外圍，一方面能夠減小毒性，提高納米載體在生物體內的穩定性，另一方面，透明質酸能夠提供很好的靶向性，靶向表面CD44跨膜蛋白豐富的乳腺癌細胞MDA-MB-231。
[0023]本發明的microRNA納米顆粒具有良好的生物相容性,細胞毒性較小。能通過自組裝方式形成納米顆粒，具有合適的理化性質，較好的穩定性，制備方法簡單，可重復性高，作為納米載體可保護microRNA免受降解,又能結合納米材料特有的尺寸效應，是一種良好的microRNA基因載體。
[0024]另一方面，本發明提供了一種用于腫瘤基因治療的新型靶向復合物，以解決腫瘤治療特別是三陰性乳腺癌的生物靶向治療中的難題。其中魚精蛋白起到橋梁作用，它具有結合核酸的功能，可以將另外兩種帶負電荷成分結合起來形成復合物，透明質酸具有識別靶向細胞表面特異性受體的作用，而所攜帶的miCToRNA則可以起到沉默目的基因的作用，所以該新 型復合物可以靶向識別腫瘤細胞并且沉默關鍵基因從而起到疾病腫瘤治療的作用。
[0025]本發明的優點
[0026]本發明所用到的納米載體原材料透明質酸和魚精蛋白，都是生物安全性能好，生物可降解的天然高分子，其以廣泛應用于生物行業。同時，包裹miCToRNA納米載體制備過程簡單，方便，沒有引入任何復雜的合成和有機溶劑，能有效的保護microRNA受這些復雜因素的影響。同時，能夠以簡單的方式，引入祀向運輸microRNA的功能。通過本發明制備的腫瘤抑制功能的包裹microRNA納米載體,其能夠包裹可特異性針對各種疾病的microRNA以及小干擾RNA(SiRNA)，可以通過尾靜脈注射的方式，進行疾病特別是癌癥的治療。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1在最優條件下形成的納米載體的動態光閃射和透射電鏡圖。
[0028]圖2A是包裹miR_34a透明質酸/魚精蛋白納米顆粒轉染細胞后，證明miR_34a轉入細胞內的結果圖，熒光顯微鏡下拍照，DAPI將細胞核染成藍色，紅色熒光標記的miR-34a出現在細胞質內。
[0029]圖2B是包裹miR_34a透明質酸/魚精蛋白納米顆粒轉染細胞前，先用透明質酸孵育細胞使細胞表面的⑶44受體中和，熒光顯微鏡下拍照，DAPI將細胞核染成藍色，紅色熒光標記的miR-34a出現在細胞質內數量明顯減少。可見包裹miR_34a透明質酸/魚精蛋白納米顆粒具與CD44相互接觸，從而具有靶向功能。[0030]圖3是包裹miR_34a透明質酸/魚精蛋白納米顆粒對細胞增殖的抑制的結果圖。與PBS對照相比，納米載體明顯抑制細胞增殖。
[0031]圖4是包裹miR_34a透明質酸/魚精蛋白納米顆粒對細胞遷移抑制的結果圖。與PBS對照相比，納米載體明顯抑制細胞遷移。
[0032]圖5是包裹miR_34a透明質酸/魚精蛋白納米顆粒對細胞中靶蛋白的抑制效果。【具體實施方式】
[0033]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0034]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0035]實施例1空白的透明質酸/魚精蛋白納米顆粒的制備。
[0036]將2mg分子量為23萬的透明質酸(江蘇東元生物有限公司)溶于ImL無RNA酶的水中，配制成2mg/mL的液體，將該溶液通過200nm濾膜，去除雜質，從而得到2mg/mL的工作液。將Img魚精蛋白硫酸鹽(產品目錄號:PS4020, SigmaAdrich公司)溶于ImL無RNase的水中，通過200nm濾膜,去除雜質,從而得到lmg/mL的工作液。為了制備空白透明質酸/魚精蛋白納米顆粒(以下簡稱Blank HA/PS)，按照不同的質量比(HA:PS=1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:1.5,2:1,3:1,4:1)緩慢的混合透明質酸溶液和魚精蛋白溶液，攪拌混合溶液20min，讓二者的充分的相互作用并且穩定形成的納米顆粒。之后將得到的混合溶液以13000rpm的離心速度離心15min，去除上清液，得到離心后留下的納米顆粒。將最終得到的離心產物凍干，稱重，與加入的原材料質量進行比較計算，得到納米顆粒產率。
[0037]實施例2空白的透明質酸/魚精蛋白納米顆粒粒徑大小，表面zeta電位以及多分散系數的表征。·
[0038]將I中得到的納米產物，重新溶解于水中，配制成0.lmg/mL的濃度，通過Zetasizer Nano ZS (Malvern, Worcestershire, U.K.)測試復合物的粒徑和表面zeta 電位。測試粒徑的參數為25°C，173°散射角。表面電位的測定是基于納米粒子在溶液中的電泳遷移率，在自動模式下測定。
[0039]實施例3優選出最合適的比例，用來包裹microRNA。
[0040]將I中各個比例的納米顆粒的產量和2中粒徑，表面zeta電位以及多分散系數的比較分析，結果如表1所示。表1為透明質酸與魚精蛋白溶液混合比例的測試，以及各種比例下的粒徑，表面zeta電位，多分散系數以及納米產率的表征，優化出最合適的納米載體形成比例。
[0041]得出在HA:PS=2:1的條件下，得到了納米粒徑合適(201.4nm左右)，分散均勻(PDI=0.2左右)，以及相對較高的納米顆粒產率。在HA:PS〈2:1的情況下，納米顆粒粒徑大且分散不均與，在HA:PS>2:1的情況下，納米顆粒粒徑合適，但是納米產量較低。因此，在后續包裹microRNA的實驗以及生物實驗中，選取HA:PS=2:1的條件下進行。
[0042]實施例4包裹miR_34a透明質酸/魚精蛋白納米顆粒(以下簡稱miR-HA/PS)的制備
[0043]將20 μ g miR-34a (廣州銳博生物技術公司)溶于ImL無RNase的水中，制成濃度為20 μ g/mL的工作液。將microRNA工作液與lmL2mg/mL的透明質酸工作液混合，再將lmLlmg/mL的魚精蛋白工作液緩慢的滴加到mici^RNA和透明質酸工作液中，緩慢攪拌20-30min。同樣的，將得到的納米顆粒離心，保留上清液留作后續試驗。將離心產物重新分散在水中，即得到包裹microRNA的納米顆粒。
[0044]實施例5MicroRNA包載效率的測試
[0045]將實施例中的上清液分析,用紫外分光光度計(Perkin Elmer, Fremont, CA, USA)在260nm波長下測試上清液中microRNA的殘余量，與投入量進行比較，進而計算出microRNA的包裹效率。
[0046]實施例5細胞攝取包裹miR-HA/PS的透明質酸/魚精蛋白納米顆粒能力檢測
[0047]1、細胞培養及接種
[0048]本發明使用乳腺癌細胞系MDA-MB-231做為細胞實驗對象，由中國科學院細胞中心提供，使用含10%胎牛血清，DMEM培養基(Invitrogen公司)，于37°C，5%C02 (v/v)，70%濕度的培養箱(賽默飛世爾科技公司)中培養。將2X IO5個MDA-MB-231細胞接種于直徑20mm，玻片厚度0.13-0.17mm的培養皿(無錫耐思生物科技有限公司)中，過夜培養。
[0049]2、miR-HA/PS納米顆粒加入細胞培養基及觀察
[0050]將miR-HA/PS納米顆粒與Iml無血清DMEM培養基于1.5ml無RNase道夫管中混勻，加入MDA-MB-231細胞貼壁生長的培養皿中，miR-34a的終濃度為ΙΟΟηΜ，以加入PBS為陰性對照，置于37°C，5%C02 (v/v)，70%濕度的培養箱中培養，6h后將培養基換成含10%胎牛血清、DMEM完全培養基，于37°C，5%C02 (v/v)，70%濕度的條件培養24h后，去除舊培養基，PBS洗滌細胞3遍，每個培養皿加入lml4%多聚甲醛固定液，固定20min，去除固定液，PBS洗滌3遍，每個培養皿加入 1ml DAPI染色液(碧云天生物技術研究所)，染色5min，去除DAPI染色液，PBS洗滌3遍，每次2min。熒光倒置顯微鏡(德國萊卡公司)觀察miR_34a在MDA-MB-231細胞內的分布情況。結果如圖2A所示，表明使用miR-HA/PS材料能夠將標記了Cy3的miR-34a輸送至細胞內。圖2B是miR-HA/PS納米顆粒如上方法轉染細胞前，先用透明質酸孵育細胞I小時使細胞表面的CD44受體中和，紅色熒光標記的miR-34a出現在細胞質內數量明顯減少。說明魚精蛋白-透明質酸_miR-34a納米顆粒具有良好的靶向性。
[0051 ] 實施例6miR_HA/PS納米顆粒對細胞增殖的抑制
[0052]本發明采用CCK-8細胞活力試劑盒(東仁化學科技有限公司)檢測納米顆粒對細胞增殖的抑制。具體實施步驟如下:以每孔I X IO4個/100 μ I的接種量將MDA-MB-231接種于96孔板(Greiner Bio-one公司)，使用含10%胎牛血清，DMEM培養基(Invitrogen公司)，于37°C，5%C02 (v/v)，70%濕度的培養箱(賽默飛世爾科技公司)中培養過夜。去除96孔板中的舊培養基，加入100 μ I無血清、DMEM培養基。按終濃度為200ηΜ的量加入miR-HA/PS納米顆粒至每個孔中，每個濃度設置6個復孔，以PBS為對照。37°C，5%C02培養6h后換成含10%胎牛血清，DMEM培養基，繼續培養24h，48h，72h，分別將CCK-8以每孔培養基體積的10%的量加入每個孔中，即100 μ I培養基中加入10 μ I CCK-8，37°C孵育lh。使用多功能微孔板檢測儀測定每孔在450nm處的吸光度。結果如圖3所示miR_34a透明質酸/魚精蛋白納米顆粒明顯抑制細胞生長。
[0053]實施例7miR_HA/PS納米顆粒對細胞遷移的抑制
[0054]MDA-MB-231細胞用上述方法轉染24小時后，從6孔板消化下來，并用無血清高糖DMEM培養基重懸，按IxlO5個/孔接種在Transwell (coring公司)小室的上室，在下室加入500ul含10%胎牛血清的DMEM培養基誘導其遷移穿過8 μ m孔徑的聚碳酸醋膜。37°C，5%C02培養12小時。取出小室，用棉簽輕輕擦去上室面細胞。4%多聚甲醒室溫下固定下室面細胞lOmin。PBS洗3次，棉簽擦干上室面。0.1%結晶紫染色15min，PBS洗3次，室溫下風干。置于顯微鏡下觀察拍照。結果如圖4所示，miR-HA/PS納米顆粒相比PBS對照明顯抑制細胞遷移。
[0055]最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護范圍的限制。凡采用等同替換或等效變換形成的技術方案，均落在本發明要求的保護范圍。表1
[0056]
【權利要求】
1.一種用于microRNA祀向傳遞的納米載體復合物的制備方法,其特征在于,包括以下步驟: (1)將透明質酸加入到無RNA酶的水中，使透明質酸質量濃度為2mg/mL； (2)將魚精蛋白硫酸鹽加入到無RNA酶的水中，使魚精蛋白硫酸鹽溶液質量濃度為lmg/mL ；(3)將microRNA溶解于無RNA酶的水中，配制成20μ g/mL濃度的microRNA溶液； (4)將ImL步驟(3)中的microRNA溶液與ImL步驟(1)中的透明質酸溶液混合,潤旋震蕩均勻，得混合液； (5)將ImL步驟⑵中的魚精蛋白硫酸鹽溶液，滴加到步驟⑷中得到的混合液中，并且渦旋震蕩均勻，孵育20-30分鐘。
2.根據權利要求1所述的一種用于microRNA祀向傳遞的納米載體復合物的制備方法，其特征在于所用的microRNA是在乳腺癌中低表達的
miR-34a, MiR_34a: Sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT
Antisense:ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT。
3.根據權利要求1所述的一種用于micix)RNA靶向傳遞的納米載體復合物的應用，作為用于腫瘤基因治療的靶向 復合物。
【文檔編號】A61P15/14GK103849652SQ201310714331
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2013年12月22日 優先權日:2013年12月22日
【發明者】盛望, 王世華, 鄧雄威, 曾毅, 肖向茜, 胡秦, 張芳 申請人:北京工業大學