本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域一個(gè)新型的腎細(xì)胞癌治療靶點(diǎn)，具體涉及阻斷ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾信號(hào)通路在腎細(xì)胞癌治療靶點(diǎn)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腎細(xì)胞癌（renalcellcarcinoma，rcc）是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，占腎臟惡性腫瘤的80％-90％，占成人惡性腫瘤的2％至3％。目前，外科手術(shù)（根治性腎切除手術(shù)和保留腎單位手術(shù)）是局限性腎癌的首選治療方法，可以達(dá)到完全治愈。對(duì)于局部進(jìn)展性腎癌則以手術(shù)治療為主，術(shù)后輔助細(xì)胞因子或分子靶向治療的綜合治療。而轉(zhuǎn)移性腎癌尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)治療方案，研究表明分子靶向藥物可以顯著延長(zhǎng)患者的生存期。2006年起，nccn和eau將分子靶向藥物（索拉菲尼、舒尼替尼、替西羅莫斯等）作為轉(zhuǎn)移性腎癌治療的一、二線臨床治療用藥。它們中的大多數(shù)屬于激酶抑制劑，通過抑制腫瘤血管的生長(zhǎng)，達(dá)到抗腫瘤的作用，延長(zhǎng)患者的生存期。但分子靶向藥物的毒副作用（手足皮膚反應(yīng)、乏力、白細(xì)胞減少、高血壓、貧血、口舌炎等）限制其在臨床治療中的廣泛應(yīng)用，部分患者因此需要調(diào)整藥物劑量，甚至終止治療。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)新的腎細(xì)胞癌治療靶點(diǎn)并據(jù)此研發(fā)新型的分子靶向藥物，對(duì)于腎細(xì)胞癌的治療具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

類泛素化修飾neddylation是一種新型的蛋白翻譯后修飾方式，通過類泛素樣蛋白nedd8（neuralprecursorcell-expresseddevelopmentallydownregulated8）特異性地與底物蛋白共價(jià)結(jié)合，調(diào)控多種蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能，在細(xì)胞正常生理活動(dòng)的多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)中具有重要的調(diào)控作用。然而，neddylation修飾的異常激活與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。所以靶向針對(duì)neddylation修飾信號(hào)通路有望成為新型的抗腫瘤靶點(diǎn)。neddylation修飾信號(hào)通路的關(guān)鍵酶主要包括nedd8活化酶e1、nedd8結(jié)合酶e2和nedd8連接酶e3。nedd8結(jié)合酶e2為高度保守的蛋白質(zhì)，目前研究?jī)H發(fā)現(xiàn)有2種，分別是ube2m(ubiquitin-bindingenzymee2m,ubc12)和ube2f(ubiquitin-bindingenzymee2f)。然而，neddylation修飾以及nedd8結(jié)合酶e2是否能夠作為腎細(xì)胞癌治療靶點(diǎn)及作用機(jī)制仍未知。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種阻斷ube2m介導(dǎo)neddylation修飾在腎細(xì)胞癌治療中的應(yīng)用，為研發(fā)新型的分子靶向治療藥物，提供一種阻斷ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾作為治療腎細(xì)胞癌的新靶點(diǎn)。本發(fā)明設(shè)計(jì)了sh-control、sh-ube2f和sh-ube2m等rna干擾相關(guān)質(zhì)粒，構(gòu)建穩(wěn)定敲低ube2m或者ube2f蛋白表達(dá)水平的腎癌細(xì)胞系，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低ube2m顯著抑制腎癌細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步通過neddylation修飾特異性小分子抑制劑mln4924對(duì)腎癌細(xì)胞的顯著殺傷作用,證明了阻斷ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾在抑制腎癌細(xì)胞增殖活力上起著關(guān)鍵作用。因此，阻斷ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾信號(hào)通路是一種潛在的治療腎細(xì)胞癌的新型靶點(diǎn)，具有很強(qiáng)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

阻斷ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾信號(hào)通路作為藥物靶點(diǎn)在制備抗腎細(xì)胞癌藥物中的應(yīng)用。

阻斷ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾信號(hào)通路作為藥物靶點(diǎn)在制備抑制腎細(xì)胞癌增殖試劑中的應(yīng)用。

通過靶向抑制ube2m的表達(dá)或功能，實(shí)現(xiàn)靶向抑制腎細(xì)胞癌的生長(zhǎng)。

靶向抑制ube2m表達(dá)的方法為：通過慢病毒介導(dǎo)shrna轉(zhuǎn)入腎癌細(xì)胞中，敲低腎癌細(xì)胞內(nèi)ube2m的表達(dá)。

抑制劑選自靶向于ube2m蛋白編碼序列，且能夠抑制ube2m基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)的shrna。

所述的shrna序列為gcggatccagaaggacataaa。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了通過阻斷ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾信號(hào)通路可抑制腎癌細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步通過neddylation修飾特異性小分子抑制劑mln4924對(duì)腎癌細(xì)胞的顯著殺傷作用，證明了阻斷ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾在抑制腎癌細(xì)胞增殖活力上起著關(guān)鍵作用。因此，阻斷ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾信號(hào)通路是一種潛在的治療腎細(xì)胞癌的新型靶點(diǎn)，具有很強(qiáng)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。

圖1為本發(fā)明的阻斷ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾可顯著抑制腎癌細(xì)胞786-0的增殖。(a)構(gòu)建穩(wěn)定敲低ube2m或者ube2f蛋白表達(dá)水平的腎癌細(xì)胞786-0后，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法檢測(cè)腎癌細(xì)胞增殖(p<0.001)。(b)通過westernblot分析檢測(cè)敲低ube2m或ube2f情況。

圖2為本發(fā)明的mln4924顯著抑制腎癌細(xì)胞786-0的增殖(p<0.001)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容及其具體實(shí)施方式，通過具體實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明。

參見圖1及圖2所示，本發(fā)明的目的是為研發(fā)新型的分子靶向治療藥物，提供一種阻斷ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾作為治療腎細(xì)胞癌的新靶點(diǎn)。

第一方面，本發(fā)明提供了阻斷ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾信號(hào)通路作為藥物靶點(diǎn)在制備抗腎細(xì)胞癌藥物中的應(yīng)用。

第二方面，本發(fā)明提供了阻斷ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾信號(hào)通路作為藥物靶點(diǎn)在制備抑制腎細(xì)胞癌的增殖試劑中的應(yīng)用。

所述的抑制劑選自靶向于ube2m蛋白編碼序列，且能夠抑制ube2m基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)的shrna。通過慢病毒介導(dǎo)shrna轉(zhuǎn)入腎癌細(xì)胞中，敲低腎癌細(xì)胞內(nèi)ube2m的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)靶向抑制腎細(xì)胞癌的生長(zhǎng)。所述的shrna序列為gcggatccagaaggacataaa。

實(shí)施例1：

阻斷ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾可顯著抑制腎癌細(xì)胞786-0的增殖

分別將質(zhì)粒(sh-control、sh-ube2f和sh-ube2m)加入dh5α感受態(tài)中，冰上放置20分鐘后置于42℃加熱模塊中，熱激90秒。將熱激后的感受態(tài)置于冰上5分鐘。向感受態(tài)中加入500μl液體lb培養(yǎng)基，37℃下200rpm搖40分鐘。收集菌液300rcf離心5分鐘，棄去400μl上清。用剩余的菌液將沉淀重懸，均勻涂布在固體lb培養(yǎng)基中（含氨芐抗生素100μg/ml），倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中。24小時(shí)后挑取清晰的單菌落，加入至液體lb培養(yǎng)基中（含氨芐抗生素100μg/ml），37℃下200rpm搖24小時(shí)。24小時(shí)后收集菌液，提取質(zhì)粒。將獲得的質(zhì)粒與prsv-rev、pmdlg/prre和pcmv-vsv-g以3:3:3:1的比例轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為：5％co2；溫度為37℃），6小時(shí)后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小時(shí)后收獲含假病毒顆粒的上清液，1000rpm離心5分鐘，將收獲的上清液用0.45μm濾膜過濾。4℃條件下，在20%蔗糖中30000rpm超速離心2小時(shí)。將超離后的病毒沉淀用無菌pbs重懸。將4×10⁵個(gè)786-0細(xì)胞接種至6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為：5％co2；溫度為37℃）。24小時(shí)后將細(xì)胞上清液棄去，加入混有相應(yīng)病毒的無血清培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為：5％co2；溫度為37℃），6小時(shí)后補(bǔ)加含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基。感染48小時(shí)后，換為含有嘌呤霉素(4ug/ml)的培養(yǎng)基。觀察細(xì)胞死亡情況，將存活的細(xì)胞進(jìn)行傳代。

分別將相應(yīng)穩(wěn)定腎癌細(xì)胞786-0(sh-control、sh-ube2f、sh-ube2m和sh-ube2f+sh-ube2m)以每孔2×10⁴個(gè)細(xì)胞接種至24孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為：5％co2；溫度為37℃），在不同時(shí)間段應(yīng)用胰蛋白酶進(jìn)行消化，收集細(xì)胞懸液并應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

通過westernblot分析進(jìn)行分析。使用針對(duì)目標(biāo)蛋白的一級(jí)抗體，包括actin（ab8227，abcam），ube2m（ab109507,abcam）和ube2f（ab185234，abcam）。二級(jí)抗體包括抗兔igg和抗小鼠igg（jacksonimmunoresearchlaboratories）。

實(shí)施例2：

mln4924顯著抑制腎癌細(xì)胞786-0的增殖

將腎癌細(xì)胞786-0以每孔2×10⁴個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為：5％co2；溫度為37℃），待細(xì)胞貼壁后，應(yīng)用dmso或mln4924（0.5μm和1μm）進(jìn)行處理，在不同時(shí)間段應(yīng)用胰蛋白酶進(jìn)行消化，收集細(xì)胞懸液并應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

綜上所述可知，阻斷ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾信號(hào)通路后可抑制腎癌細(xì)胞的增殖。并通過mln4924對(duì)腎癌細(xì)胞的顯著殺傷作用，從側(cè)面證明了ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾在腎癌細(xì)胞增殖活力中的關(guān)鍵作用。因此，阻斷ube2m介導(dǎo)的neddylation修飾信號(hào)通路是一種潛在的治療腎細(xì)胞癌的新型靶點(diǎn)，具有很強(qiáng)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡對(duì)本發(fā)明所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。