新的疏水蛋白釋放系統的制作方法

文檔序號：1293602閱讀：258來源：國知局

新的疏水蛋白釋放系統的制作方法
【專利摘要】本發明的目的是包含與具有主要是疏水性質的治療學和/或生物學活性蛋白質聯合的特定透明質酸酰胺的新釋放系統，用于隨時間推移的持續緩慢釋放，其提高了藥物功效和患者順從性。
【專利說明】新的疏水蛋白釋放系統
[0001] 本發明涉及包含與具有治療學和/或生物學活性的具有主要是疏水性質的蛋白質聯合的特定透明質酸酰胺的藥物組合物，用于制備持續緩慢的蛋白質釋放系統。
[0002] 發明背景
[0003] 通過將活（細菌）系統進行工程化而獲得的第一個藥物是胰島素，其在1982年由食品藥品管理局（FDA)批準。以前從尸體中提取的人生長激素也很快進行了工程化。在 1986年，FDA批準了第一個重組人疫苗，其對抗乙型肝炎。采用活系統作為生物反應器進行藥物的工業化生產從此變得普及，并且現在是很多藥物的優選合成方法，尤其是由于其相對低的生產成本。
[0004] 通過生物工程技術生產了很多被設計用于治療（和非治療）用途的人蛋白質，包括紅細胞生成素（用于治療貧血）、白細胞介素2 (用于治療腎癌）、IL-IRadL-I受體拮抗劑）、胰高血糖素、干擾素、人DNase酶、降鈣素和很多其它蛋白質。
[0005] 所述藥物主要具有蛋白質或多肽性質，通常經胃腸外施用，因為口服施用將引起活性成分快速降解。但是，胃腸外施用可引起患者順從性的問題，因為需要重復施用以確保治療效果。這些蛋白質通常具有非常短的半衰期；例如，生長激素hGH(通過基因生產）需要每天注射。因此，為了減少施用次數和增加患者順從性，已經進行了很多實驗來開發具有增加的半衰期的蛋白質/藥物釋放系統。
[0006] 所述釋放系統必須保證藥物的活性得以維持，因此必須確保蛋白質/藥物的三維結構保持完整；然而，在其制備期間可發生的應激狀態如有機溶劑的存在和/溫度和PH的變化可引起蛋白質鏈的脫酰胺化或氧化，從而導致變性和治療活性的喪失。
[0007] 例如，已知PLGA(聚乳酸/乙醇酸）微球的使用是用于小肽的釋放系統，其具有優良的結果（Hutchinson F.G.，Biochem. Soc. Trans.，1985, 13:520-523);然而，將其用于配制hGH釋放的貯庫制劑是不可能的，因為該蛋白質的變性產生了炎性問題。
[0008] 對不具有毒性、但是所遞送活性成分的功效未改變的蛋白質/藥物釋放系統所進行的持續尋找已經指向了使用用于配制的天然聚合物，其（由于它們與活性成分的聯合）可以改變與它們所聯合的藥物的動力學。
[0009] 透明質酸（HA)是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺的交替殘基組成的雜多糖。它是一種天然的直鏈聚合物，分子量范圍根據其獲得來源和所用的制備方法為50, 000 至 13xl06Da。
[0010] 它天然存在于細胞外凝膠中、存在于脊椎動物結締組織的基質（其為其中的主要組分之一）中以及存在于關節滑液、玻璃體液和臍帶中。
[0011] 因此，HA通過給很多組織如皮膚、腱、肌肉和軟骨的細胞提供機械支持而在活生物體中發揮重要的生物學作用。
[0012] 由于其性質，透明質酸保護組織免受自由基損害、控制炎性過程和刺激血管生成，并且已經證明在創傷愈合的所有主要階段的調控中特別有效（EP1196179)。
[0013] 在與透明質酸的簡單聯合或成鹽中，使用所述多糖作為多種藥物的載體是已知的，因為其生物相容性、生物降解性、無免疫原性、粘度和水合性的特性使得其特別適于用作局部和全身水平的藥物和分子釋放系統（EP197718、EP445255)。還已經研究了所述多糖用于特定蛋白質的藥物遞送，所述蛋白質例如有IL-IRa(US 6, 096, 728)、紅細胞生成素（Hahn SK?等人，Int J Pharm. ,2006, 28, 322:44-51)、胰島素（Nomura M?等人，J Pharm Pharmacol, 1994, 46:768-770)、生長激素（Kim SJ?等人，Journal of Controlled Release, 2005, 104:323-335)、干擾素和促卵泡激素（US8, 025, 900)。
[0014] 在所有這些情況中，藥物與所述多糖的聯合已經導致了所載蛋白質的"緩慢"釋放，但是不足以緩慢到減少藥物施用次數。
[0015] HA是完全天然的多糖，其被體內存在的酶（透明質酸酶）迅速降解，相對迅速地釋放出所聯合的藥物。由于這些原因，已經對HA的羧基和羥基進行了化學修飾以產生交聯衍生物（US 4, 582, 865、US 4, 713, 448、US 5, 676, 964、US 4, 957, 74、US 5,827,937)或者用其它天然或合成聚合物或用具有不同大小和物理化學特性的分子進行了衍生化（US 4, 851，521);然而，所述衍生物的制備方法往往損害所輸送藥理學物質的完整性。
[0016] 發明描述
[0017] 本發明的目的是包含與具有主要是疏水性質的治療學和/或生物學活性蛋白質聯合的特定透明質酸酰胺的新的釋放系統，用于隨時間推移持續緩慢釋放，其提高了藥物功效和患者順從性。
[0018] 下文列出了本發明的具有主要是疏水性質的治療學和/或生物學活性蛋白質的一些實例：
[0019] 胰島素是具有合成代謝性質的蛋白質激素，由胰腺內的胰島P細胞產生；它由兩條通過兩個硫橋連接的鏈組成。其最知名的功能是調控血糖水平。因此，該蛋白質用于治療產生非常少胰島素或不產生胰島素的1型或2型糖尿病。該激素通過皮下注射施用（因為如果將其直接注射到血流中，則藥物吸收過快，可能導致低血糖）。該治療方法基于由患者進行的血糖測試的不同每日次數，隨后施用校準劑量（3個或更多）的胰島素。
[0020] 牛長激素（GH)是垂體前葉的肽激素，由191個氨基酸組成，分子量為22, 005Da。其主要功能是通過促進幾乎所有身體組織的細胞的生長和有絲分裂來刺激人體（和很多其它脊椎動物的身體）發育（特別是其促進骨、軟骨和結締組織的生長）。
[0021] 在嬰幼期，GH分泌不足引起垂體性侏儒癥，而分泌過多則引起垂體性巨人癥。如果分泌過多是在生長結束后開始（通常是由于腫瘤），則出現肢端肥大癥，其中面部、手和足的骨頭相當大程度地增大。
[0022] 因此，其被用于仍處于生長階段的患者和患有垂體腫瘤的成人。
[0023] GH還用于治療不是由GH缺乏引起的障礙，例如特納綜合征、慢性腎臟疾病、 ISS(特發性身材矮小癥）和多發性硬化，以及用于增加肥胖患者的體重減輕，用于纖維肌痛、節段性回腸炎和潰瘍性結腸炎。
[0024] 在骨關節炎（OA)的治療中，對hGH關節內施用進行的實驗獲得了極好的結果，這也證明了所述激素在修復由OA造成的軟骨損傷中的功效（EP1153607 ;Kim SB等人，J Korean Med Sci. ,2010, 25:776-80)。
[0025] 降鈣素（CT)是一種由32-氨基酸多肽組成的激素，其在人中由甲狀腺濾泡旁細胞 (也稱為C細胞）產生。降鈣素的主要功能是通過抵消甲狀旁腺激素甲狀旁腺素的作用而降低血液中的鈣濃度。已經在魚、爬行動物、鳥和哺乳動物中發現了這種鈣調節機制。降鈣素激素也在腎臟水平發揮作用，刺激腎小管消除鈣。sCT(鮭魚CT)通常被用于治療骨質疏松癥、高鈣血癥、骨轉移和佩吉特病。
[0026] 同樣，最新實驗數據已經證實了降鈣素在骨關節炎治療中的有效性：已經證明它的施用保護關節面免于OA引起的侵蝕（Manicourt DH等人，J Musculoskelet Neuronal Interact, 2005, 5(3):285-293)。
[0027] ILl-Ra是細胞因子IL_1的受體拮抗劑，細胞因子IL_1是局部和全身炎性過程的強誘導劑。IL-I主要由B和T淋巴細胞以及巨噬細胞在細菌刺激或其它細胞因子刺激后產生；它也由肺泡巨噬細胞、內皮細胞、上皮細胞和平滑肌細胞、成纖維細胞、破骨細胞、滑膜細胞和很多其它細胞類型分泌。IL-I尤其牽涉在嚴重障礙如銀屑病和敗血癥性休克中以及牽涉在某些類型腫瘤的發病機制中。IL-I與其它細胞因子組合地代表了炎性過程的主要介質之一，因此牽涉在多種障礙如骨質疏松癥、類風濕性關節炎（RA)、銀屑病性關節炎和骨關節炎（OA)中：實際上，已經在患有類風濕性關節炎和/或骨關節炎的患者的滑液中發現了大量IL_l〇
[0028] IL-I的表達對于OA的發病機制是關鍵的，因為IL-I促進金屬蛋白酶（MMP)的合成、分泌和活化，所述MMP是由軟骨細胞產生的蛋白酶，其負責軟骨基質的降解。
[0029] 所有有關OA過程的實驗數據均有力地支持如下概念：IL_1和TNFa代表了參與關節組織破壞的主要代謝系統；實際上，已經證明，通過阻斷IL-I的產生和/或活化能夠阻止和 / 或減少關節基質的破壞（Caron J. P?等人，Arthritis Rheum, 1996, 39:1535-1544)。
[0030] 目前，含有受體拮抗劑IL-IRa的新藥物用于抵消這種細胞因子的影響，因為已經證明阻斷該受體是治療其中牽涉IL-I的障礙的有效方法（Burger D.等人，Cytokine Reference, Oppenheim JJ 和 Feldmann M,編輯，紐約，倫敦，Academic Press，2000，p. 31-336; Jiang Y?等人，Arthritis Rheum, 2000, 43 (5): 1001-9)。
[0031] IL-IRa是作為所述白細胞介素的抑制劑的蛋白質；然而，含有IL-IRa的藥物（如基于阿那白滯素的JBlMref魏阿那白滯素是人蛋白質IL-IRa的重組非糖基化形式）具有非常短的半衰期，這往往損害臨床結果。因此，重要的是，配制含有IL-IRa的新藥物組合物以便以持續緩慢的方式遞送藥物，保證了較長的半衰期，以確保加強的臨床結果。
[0032] 粒細朐集落刺激閔子（G-CSF)是174-180個氨基酸糖蛋白，其刺激骨髓產生粒細胞和干細胞，所述粒細胞和干細胞隨后釋放至血液中。已經證明這種生長因子具有神經營養蛋白活性，因此目前正被研究用于治療大腦局部缺血和肌萎縮性側索硬化癥。它通常用于腫瘤患者，以消解與化療相關的中性白細胞減少癥；最后，最近實驗研究已經證明，G-CSF 靜脈治療促進了受損心臟細胞的再生。
[0033] 血小板衍牛牛長閔子（PDGF)是一種由二聚物鉬成的牛物活件蛋白質，所沭二聚物由兩個通過二硫橋連接的多肽（稱為A和B)組成。其主要在巨核細胞中合成，在人中代表了間充質來源的細胞的主要血清有絲分裂劑。它被用于促進創傷/潰瘍的愈合，因為它是基質結締組織形成的介質，由于所有這些原因，其目前還被用于促進新骨組織的形成。
[0034] 轉化牛長閔子3 (TGF-P)是一種在調節免疫系統和在組織再生、細胞分化和胚胎發育中發揮關鍵作用的肽。其主要用作創傷愈合劑，因為它增強皮膚創傷/潰瘍的愈合和促進骨折的閉合；出于這些原因，其也用于治療骨質疏松癥和0A。最后，實驗數據證明：在心臟缺血損傷后，TGFP還具有心臟保護性質。
[0035] 表皮牛長因子（EGF)是在調節牛長以及在細胞增殖和分化中發揮重要作用的生長因子。人EGF是6045道爾頓的蛋白質，由53個氨基酸殘基和三個分子內二硫橋組成。它發現于血小板、巨噬細胞、尿液、唾液、乳汁和血漿中。
[0036] 其為用作胃保護劑的蛋白質，因為它刺激胃腸粘膜細胞的增殖；其用于促進皮膚組織再生，因為其在皮膚、靜脈和其它類型的創傷/潰瘍的處理中刺激新肉芽組織的形成。最后，EGF的局部應用已經在受損角膜組織的再生中得到了極好的結果，例如在角膜手術后或在退行性疾病如角膜炎的情況下。
[0037] 血管內皮牛長閔子（VEGF-B)是參與血管生成（即胚胎期循環系統的從頭發生）、神經發生和血管形成的蛋白質生長因子。它也是一種保護神經元免受NMDA介導的缺血性損傷的神經保護劑。
[0038] 紅細胞牛成素（EPO)是在人中由腎臟以及在較小稈度上由肝和腦產牛的一種糖蛋白激素，其主要功能是調節紅細胞生成（由骨髓生產血紅細胞）。
[0039] 也已經在實驗室中產生了 EP0,并用作藥物以治療罹患腎臟疾病或血液疾病的患者的貧血或用于在給癌癥患者施用化療后加速恢復。在最近的研究中，已經觀察到EPO作為抗炎劑發揮神經保護作用。
[0040] 紅細胞生成素是一種分子量為約30000D的糖蛋白分子。最后，自1989年以來， EPO已經可作為藥物獲得，用于進行透析的貧血患者。隨后，其應用也擴展到接受保守治療的慢性腎功能衰竭患者，幫助改善他們的生活質量。通過重組DNA方法進行紅細胞生成素的藥物生產。
[0041] 神經牛長因子（NGF)是下丘腦中由甲狀腺和垂體分泌的蛋白質;它也由平滑肌細胞和成纖維細胞產生。其活性形式是26KDa的NGFP，NGFP是具有兩個二硫橋連接兩個 118-氨基酸蛋白質鏈的同二聚體。其負責外周NS神經元和CNS膽堿能神經元的分化和功能。因此，其用于治療神經變性疾病如癡呆；還已經證明NGF可用于治療青光眼。
[0042] 轉鐵蛋白是血流中的主要鐵轉運蛋白。轉鐵蛋白由肝和單核細胞-巨噬細胞系統合成，其以非常穩定但可逆的方式結合在腸水平吸收的和源自紅血細胞降解的鐵，將其攜帶至使用部位（特別是骨髓）和儲存部位（特別是肝臟）。
[0043] 從結構的觀點來看，它是由分子量為約80KD的679-氨基酸多肽鏈形成的糖蛋白，具有兩個對亞鐵離子（Fe2+)沒有親合力的鐵離子（Fe3+)結合位點；其半衰期為約8天。
[0044] 轉鐵蛋白主要由肝臟合成，其在血液中的參考值為200_360mg/dL。轉鐵蛋白水平在使用避孕藥期間、妊娠期間、鐵缺乏事件中增加。相反地，它們在腎病綜合征、肝臟疾病、營養不良、慢性炎性疾病、腫瘤以及鐵或可的松治療的情況中下降。生理性減少可發生于新生兒或老年。
[0045] IIIE是抑制金屬蛋白酶（即參與軟骨基質降解的酶）的蛋白質；TMP家族包括由軟骨細胞、成纖維細胞、滑膜細胞、成骨細胞、神經元、巨噬細胞、平滑肌細胞、肝細胞及其它細胞生產的TMP-2、HMP-3和TMP-4形式。
[0046] 因此，它們對軟骨細胞和OA引起的軟骨侵蝕發揮了保護作用。
[0047] 發明詳述
[0048] 本發明涉及包含與具有治療學和/或生物學活性的具有主要是疏水性質的蛋白質聯合的特定透明質酸酰胺的新藥物組合物，用于制備持續緩慢的蛋白質釋放系統。
[0049] 本發明的系統導致了：
[0050] ?所述蛋白質的持續釋放，持續很長時間（與"原樣"施用的相同蛋白質相比）。這種連續釋放增加了藥物的治療窗，因為緊接施用后的時間不會（如在施用"原樣"藥物的情況下通常的那樣）大量釋放所述蛋白質。作為與特定HA酰胺聯合的釋放系統的施用調節了藥物的釋放量（相對于時間）和釋放期（因此獲得了蛋白質釋放量隨時間推移逐漸增力口，導致最終釋放期超過當其"原樣"施用時的釋放期）；總之，蛋白質的動力學釋放曲線被顯著改變，如同其治療功效特征那樣。
[0051] ?新的釋放系統是無毒的，因為它是生物相容的和生物可降解的，并且其決定了所載蛋白質/藥物的緩慢釋放，保證了治療活性得以維持；活性成分的三維結構未經過任何變性，因此其完整性得以確保。
[0052] ?本發明的釋放系統未導致所載蛋白質發生任何化學改變，因為它是通過特定HA 酰胺與所載蛋白質的聯合而形成的，所述蛋白質與特定HA酰胺合并/混合。因此，在載體和藥物之間沒有建立共價化學鍵，由此保證了蛋白質/藥物的結構完整性。
[0053] ?這些新特征極大地提高了患者順從性，因為藥物可以根據新的藥代動力學和因此以不同劑量進行施用：施用之間的時間間隔更長，并且改變了藥物的施用量，從而導致功效更強和副作用更少。
[0054] 形成本發明的目標的藥理學和/或生物學活性蛋白質必須具有根據GRAVY(平均親水性）指數測定主要是疏水的特性；肽或蛋白質的GRAVY值計算為蛋白質中存在的所有氨基酸的親水值總和除以蛋白質序列中它們的殘基數目。每個氨基酸具有給定的親水指數，其范圍是從異亮氨酸（具有由芳香烴基團形成的殘基的氨基酸，該芳香烴基團賦予分子明確的非極性并因此是疏水性的）的4. 5至精氨酸（具有帶正電荷殘基的氨基酸）的-4. 5 (Kyte J.等人，J. Mol. Biol. ,1982, 157:105-132)。該標尺表明，所分析氨基酸的親水指數越高，則其疏水性就越強（圖1)。為了容易地確定所分析蛋白質的GRAVY值，通常使用 ProtParam(Gasteiger E.等人，Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server, JM Walker 編輯，The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press，2005, 571-607)程序，其通過分析所研究蛋白質的序列提供了它們的各種理化性質；當輸入所述氨基酸序列后，程序將計算其疏水性程度待測量的蛋白質的GRAVY值。
[0055] 根據本發明，"具有主要是疏水性質的蛋白質"指具有不低于-0. 5至正值的GRAVY 指數的那些蛋白質：同樣，所分析蛋白質的GRAVY指數越高，則其疏水性越強。
[0056] 下文列出了本發明涉及的具有主要是疏水性質的蛋白質的一些實例：
[0057] ?胰島素：GRAVY 指數=0? 2
[0058] ?人生長激素，hGF =GRAVY 指數=-0. 3
[0059] ?降鈣素，sCT (鮭魚 CT) :GRAVY 指數=-0? 5
[0060] ? IL-I，IL-IRa 受體拮抗劑：GRAVY 指數=-0? 4
[0061] ?粒細胞集落刺激因子，G-CSF =GRAVY指數=0. 2
[0062] ?血小板衍生生長因子，PDGF :GRAVY指數=-0. 5, PDGF-BB = -0. 1是優選的
[0063] ?轉化生長因子TGF- @ :GRAVY指數=-0? 3
[0064] ?表皮生長因子，EGF :GRAVY指數=-0? 5
[0065] ?血管內皮生長因子B，VEGF-B :GRAVY指數=-0? 2
[0066] ?紅細胞生成素（人）或EPO :GRAVY指數=-0? 03
[0067] ?神經生長因子或NGF P :GRAVY指數=-0. 3
[0068] ?轉鐵蛋白（人）：GRAVY指數=-0? 2
[0069] ?金屬蛋白酶-2 (人）組織抑制劑，TMP-2 :GRAVY指數=-0? 2
[0070] ?金屬蛋白酶_3 (人）組織抑制劑，TMP-3 :GRAVY指數=-0? 3
[0071] ?金屬蛋白酶_4(人）組織抑制劑，TMP-4 :GRAVY指數=-0? 18。
[0072] 本申請人:已經證明下文列出的形成本發明目的的透明質酸酰胺形成了這樣的釋放系統：該釋放系統決定了包含在其中的疏水性蛋白質的持續緩慢釋放，而與相同酰胺聯合的具有主要是親水性質的蛋白質不形成適于隨時間推移持續緩慢釋放它們的釋放系統。
[0073] 形成本發明目的的適于形成所述釋放系統的HA酰胺有：
[0074] ? HA十六烷基酰胺：具有十六烷基胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比（通過IH-NMR 測定）為7%至14%、優選8%至9% ;
[0075] ? HA辛基酰胺：具有辛胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比(通過IH-NMR測定）為 10%至 15%、優選 10%至 11% ;
[0076] ? HA十二烷某酰胺：具有十二烷某胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比（通過IH-NMR 測定）為10%至15%、優選10%至11% ;
[0077] ? HA叔丁基酰胺：具有叔丁基胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比(通過IH-NMR測定）為7%至12%、優選7%至8% ;
[0078] ? HA芐基酰胺:具有芐胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比（通過IH-NMR測定）為 7%至15%、優選8%至9%。
[0079] 本發明中用于制備所述酰胺的HA可以從任意來源獲得，例如從雞冠花 (cockscombs)提取（EP138572)或發酵（例如來自馬鏈球菌（Streptococcus equi)，如本領域技術人員已知的那樣）或者通過工藝方法（例如來自芽孢桿菌屬（Bacillus)， W02012/032154)，具有 400 至 3xl06Da、優選 50 至 730KDa、750 至 1230KDa 或 1500 至 2500Kda、甚至更優選150至250KDa和/或500至730KDa的重均分子量（通過有限粘度值測定：Terbo jevich 等人，Carbohydrate Research, 1986, 149:363-377 方法）。
[0080] 具有150至250KDa或500至730KDa的重均分子量的HA十六烷基酰胺是優選的。
[0081] 形成本發明目的的上文所列的HA酰胺可以如EP1095064中所述制備，EP1095064 還描述了其不同的用途，包括形成用于藥理活性物質的釋放系統，但是對所用藥物的化學類型和所選的酰胺類型沒有做出任何區分，并且最重要的是沒有描述所獲得的效果。然而，現在已經發現：與具有治療學和/或生物學活性的具有主要是疏水性質（和因此超過-0. 5 的GRAVY指數）的蛋白質聯合的、具有特定酰胺化百分比和所選麗范圍的特定HA酰胺如十六烷基酰胺、辛基酰胺、十二烷基酰胺、叔丁基酰胺和芐基酰胺可用于制備用于所述蛋白質的新的持續緩慢釋放系統。
[0082] 以下蛋白質是優選的：
[0083] ?胰島素
[0084] ? hGH
[0085] ? sCT
[0086] ? IL-IRa
[0087] ? G-CSF
[0088] ? PDGF，優選 PDGF-BB
[0089] ? TGF- 3
[0090] ? EGF
[0091] ? VEGF-B
[0092] ? EPO
[0093] ? NGF 旦
[0094] ?轉鐵蛋白
[0095] .Hmpumpump-L
[0096] 所述蛋白質可通過重組DNA技術或通過從組織中提取而制備。
[0097] 本發明的另一目的是新的釋放系統，其包含：
[0098] I. HA十六烷基酰胺、辛基酰胺、十二烷基酰胺、叔丁基酰胺或芐基酰胺，與如下聯合：
[0099] 2?胰島素、hGH、sCT、IL-IRa、G-CSF、PDGF、優選 PDGF-BB、TGF- P、EGF、VEGF-B、 EPO、NGFP、轉鐵蛋白、TMP-2、TMP-3和TMP-4,可能與穩定劑（當需要時）和賦形劑聯合。
[0100] 特別地，本發明的目的是包含如下的系統：
[0101] I. HA十六烷基酰胺，優選具有150至250KDa或500至730KDa的重均分子量的HA 十六烷基酰胺；
[0102] 2.hGH 或 sCT，
[0103] 3.可能與穩定劑和賦形劑聯合。
[0104] 該新系統可用于持續緩慢地釋放它們所含的活性劑，因為它們改變了與它們聯合的蛋白質/藥物的治療窗：因此，不同的劑量方案是可能的，導致了較好的患者順從性。
[0105] 存在于釋放系統中的蛋白質將決定系統的用途。例如，包含HA十六烷基酰胺與 hGH或sCT的釋放系統將優選通過關節內施用來治療0A、類風濕性和銀屑病關節炎以及骨質疏松癥。
[0106] 本申請人:已經證明：這種新釋放系統決定了 hGF在所治療關節的滑液中持續釋放，產生了更好的治療效果，但是沒有允許活性劑進入血漿中（由此降低其在關節中的濃度），因而預防了藥物的全身副作用。
[0107] 本發明的目的還有包含如下的系統：
[0108] ?如前文所列和所述的一種或多種HA酰胺，以及胰島素；本申請人:將這種新系統描述為緩慢釋放胰島素的新貯庫制劑，其用于治療需要較低藥物施用的糖尿病。
[0109] 本發明的目的還有包含如下的系統：
[0110] ?如前文所列和所述的一種或多種HA酰胺，優選十六烷基酰胺，與蛋白質如 I3DGF(優選TOGF-BB)、TGF-P、EGF或VEGF-B聯合，用于注射、關節內或局部應用或用于口服施用。
[0111] 上述蛋白質因子（PDGF、TGF-0、EGF和VEGF-B)是已知其存在的生長因子，特別集中于人的富血小板血漿（PRP)中。含有它們的新釋放系統將優選可用于治療由OA導致的關節損傷、腱炎中和用于修復心肌損傷、修復骨撕裂傷/骨折/空腔以促進新骨組織形成和最后可用于皮膚潰瘍/創傷/撕裂傷愈合以促進新結締組織形成。
[0112] 本發明的目的還有包含如下的系統：
[0113] ?如前文所列和所述的一種或多種HA酰胺，優選十六烷基酰胺，與金屬蛋白酶抑制劑TIMP-2、TIMP-3或TIMP-4聯合，用于注射應用、優選關節內應用。
[0114] 新釋放系統將優選可用于治療由OA引起的關節軟骨損傷和修復骨軟骨侵蝕。
[0115] 下文描述了新釋放系統的制備實施例和申請人:所進行的用于證明本發明的所述系統的功效的實驗。
[0116] 實施例1 :重詢MW為500至730kDa的HA十六烷某酰胺衍牛物Hvadd4的合成，具有8%至9%的靡爾酰胺化百分比
[0117] 將5. OOg發酵來源的具有500至730KDa麗的透明質酸鈉鹽溶于250ml水中，將所得溶液通過玻璃柱滲濾，所述玻璃柱預填裝有IOOml四丁基銨形式的Dowex樹脂。洗脫 TBA鹽形式的HA溶液，收集并冷凍干燥。
[0118] 將2g如此獲得的產物溶于200ml二甲亞砜（DMSO)中，加入64 ii 1甲磺酸；加入 53mgl，1' -羰二咪唑，將混合物在緩慢攪拌下于室溫放置1小時。然后加入998mg十六烷基胺，于42°C進行酰胺化反應24小時。
[0119] 加入5ml飽和NaCl水溶液停止該反應，30分鐘后加入1. 5倍體積的無水乙醇以分離所得衍生物。將沉淀物在乙醇/H2080:20中以及最后在無水乙醇中洗滌，然后在高真空下于40°C干燥。
[0120] 得到I. 3g衍生物，通過IH-NMR測定了其酰胺化程度。
[0121] 實施例2 :重詢MW為500至730kDa的HA辛某酰胺衍牛物Hvadd2的合成，具有 10%至11 %的靡爾酰胺化百分比
[0122] 將5. OOg發酵來源的具有500至730KDa MW的透明質酸鈉鹽溶于250ml水中，將所得溶液通過玻璃柱滲濾，所述玻璃柱預填裝有IOOml四丁基銨形式的Dowex樹脂。洗脫 TBA鹽形式的HA溶液，收集并冷凍干燥。
[0123] 將2g如此獲得的產物溶于200ml二甲亞砜（DMSO)中，加入64 ii 1甲磺酸；加入 61. 4mgl，1'-羰二咪唑，將混合物在緩慢攪拌下于室溫放置1小時。然后加入330mg辛胺，于42°C進行酰胺化反應24小時。
[0124] 加入5ml飽和NaCl水溶液停止該反應，30分鐘后加入1. 5倍體積的無水乙醇以分離所得衍生物。將沉淀物在乙醇/H2080:20中以及最后在無水乙醇中洗滌，然后在高真空下于40°C干燥。
[0125] 得到I. 2g衍生物，通過IH-NMR測定了其酰胺化程度。
[0126] 實施例3 :重詢MW為500至730kDa的HA十二烷某酰胺衍牛物Hvadd3的合成，具有10%至11 %的靡爾酰胺化百分比
[0127] 將5. OOg發酵來源的具有500至730KDa MW的透明質酸鈉鹽溶于250ml水中，將所得溶液通過玻璃柱滲濾，所述玻璃柱預填裝有IOOml四丁基銨形式的Dowex樹脂。洗脫 TBA鹽形式的HA溶液，收集并冷凍干燥。
[0128] 將2g如此獲得的產物溶于200ml二甲亞砜（DMSO)中，加入64 ii 1甲磺酸；加入 54. 2mgl，1' -羰二咪唑，將混合物在緩慢攪拌下于室溫放置1小時。然后加入448mg十二烷基胺，于42°C進行酰胺化反應24小時。
[0129] 加入5ml飽和NaCl水溶液停止該反應，30分鐘后加入I. 5倍體積的無水乙醇以分離所得衍生物。將沉淀物在乙醇/H2080:20中以及最后在無水乙醇中洗滌，然后在高真空下于40°C干燥。
[0130] 得到I. 25g衍生物，通過IH-NMR測定了其酰胺化程度。
[0131] 實施例4 :重詢MW為500至730kDa的HA叔丁某酰胺衍牛物Hvadd6的合成，具有 7%至8%的靡爾酰胺化百分比
[0132] 將5. OOg發酵來源的具有500至730KDa MW的透明質酸鈉鹽溶于250ml水中，將所得溶液通過玻璃柱滲濾，所述玻璃柱預填裝有IOOml四丁基銨形式的Dowex樹脂。洗脫 TBA鹽形式的HA溶液，收集并冷凍干燥。
[0133] 將2g如此獲得的產物溶于200ml二甲亞砜（DMSO)中，加入64 ii 1甲磺酸；加入 53mgl，1' -羰二咪唑，將混合物在緩慢攪拌下于室溫放置1小時。然后加入178mg叔丁基胺，于42°C進行酰胺化反應24小時。
[0134] 加入5ml飽和NaCl水溶液停止該反應，30分鐘后加入1. 5倍體積的無水乙醇以分離所得衍生物。將沉淀物在乙醇/H2080:20中以及最后在無水乙醇中洗滌，然后在高真空下于40°C干燥。
[0135] 得到I. 25g衍生物，通過IH-NMR測定了其酰胺化程度。
[0136] 實施例5 :重詢MW為500至730kDa的HA芐某酰胺衍牛物Hvaddl的合成，具有8% 至9%的靡爾酰胺化百分比
[0137] 將5. OOg發酵來源的具有500至730KDa MW的透明質酸鈉鹽溶于250ml水中，將所得溶液通過玻璃柱滲濾，所述玻璃柱預填裝有IOOml四丁基銨形式的Dowex樹脂。洗脫 TBA鹽形式的HA溶液，收集并冷凍干燥。
[0138] 將2g如此獲得的產物溶于200ml二甲亞砜（DMSO)中，加入64 ii 1甲磺酸；加入 54. Omgl，1' -羰二咪唑，將混合物在緩慢攪拌下于室溫放置1小時。然后加入260mg芐基胺，于42°C進行酰胺化反應24小時。
[0139] 加入5ml飽和NaCl水溶液停止該反應，30分鐘后加入1. 5倍體積的無水乙醇以分離所得衍生物。將沉淀物在乙醇/H2080:20中以及最后在無水乙醇中洗滌，然后在高真空下于40°C干燥。
[0140] 得到L 25g衍生物，通過IH-NMR測定了其酰胺化程度。
[0141] 實施例6 :以10:1和20: lw/w的比例含有HA和hGF的制劑的制各
[0142] 將8mg發酵來源的具有150至250KDa(LMW)和500至730kDa(MMW)MW的透明質酸鈉鹽溶于Iml pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖液中。完全溶解后，加入0. 8mg hGH得到10:1的多糖/蛋白質重量比和加入〇.4mg hGH得到20:1的多糖/蛋白質重量比。將兩種成分適宜混合，使組合物均勻。如下計算裝載量：將混合物以1:10稀釋于緩沖液中，在280nm處測定 UV吸光度，所述吸收度通過使用校準曲線提供了 GH濃度值。
[0143] 實施例7 :含有由10: lw/w比例的HA十六烷某酰胺和hGF形成的釋放系統的制劑的制各
[0144] 將8mg如實施例1中所述制備的HA十六燒基酰胺衍生物HyadcM溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中。完全溶解后，加入預溶于水溶液中的hGHO. 8mg并適宜混合，以便使組合物均勻并且蛋白質被捕獲入凝膠中。如下計算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖液中，在280nm處測定UV吸光度，所述吸收度通過使用校準曲線提供了 GH濃度值。
[0145] 實施例8 :含有由10: lw/w比例的HA叔丁某酰胺和hGF形成的釋放系統的制劑的制各
[0146] 將8mg如實施例4中所述制備的Hyadd6溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中 (8mg/ml)。完全溶解后,加入預溶于水溶液中的hGHO. 8mg并適宜混合，以便使組合物均勻并且蛋白質被捕獲入凝膠中。如下計算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖液中，在 280nm處測定UV吸光度，所述吸收度通過使用校準曲線提供了 GH濃度值。
[0147] 實施例9 :含有由10: lw/w比例的HA辛某酰胺和hGF形成的釋放系統的制劑的制備
[0148] 將8mg如實施例2中所述制備的Hyadd2溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中 (8mg/ml)。完全溶解后,加入預溶于水溶液中的hGHO. 8mg并適宜混合，以便使組合物均勻并且蛋白質被捕獲入凝膠中。如下計算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖液中，在 280nm處測定UV吸光度，所述吸收度通過使用校準曲線提供了 GH濃度值。
[0149] 實施例10 :含有由10: lw/V比例的HA十二烷某酰胺和hGF形成的釋放系統的制劑的制各
[0150] 將8mg如實施例3中所述制備的Hyadd3溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中 (8mg/ml)。完全溶解后,加入預溶于水溶液中的hGHO. 8mg并適宜混合，以便使組合物均勻并且蛋白質被捕獲入凝膠中。如下計算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖液中，在 280nm處測定UV吸光度，所述吸收度通過使用校準曲線提供了 GH濃度值。
[0151] 實施例11 :含有由10: lw/w比例的HA芐某酰胺和hGF形成的釋放系統的制劑的制各
[0152] 將8mg如實施例5中所述制備的Hyaddl溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中 (8mg/ml)。完全溶解后,加入預溶于水溶液中的hGHO. 8mg并適宜混合，以便使組合物均勻并且蛋白質被捕獲入凝膠中。如下計算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖液中，在 280nm處測定UV吸光度，所述吸收度通過使用校準曲線提供了 GH濃度值。
[0153] 實施例12 :含有由10: lw/w比例的HA十六烷某酰胺和sCT形成的釋放系統的制劑的制各
[0154] 將8mg如實施例1中所述制備的HyadcM溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中。完全溶解后，加入預溶于磷酸鹽緩沖液中的鮭魚降鈣素（sCT)0. 8mg以獲得10:1的w/w比例，適宜混合以便使組合物均勻并且蛋白質被捕獲入凝膠中。如下計算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖液中，在280nm處測定UV吸光度，所述吸收度通過使用校準曲線提供了降鈣素濃度值。
[0155] 實施例13 :含有由10: lw/w比例的HA十六烷某酰胺和IL-IRa形成的釋放系統的泡丨齊I丨的泡丨備
[0156] 將8mg如實施例1中所述制備的HyadcM溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中。完全溶解后，加入預溶于水溶液中的IL-IRaO. 8mg，適宜混合以便使組合物均勻并且蛋白質被捕獲入凝膠中。如下計算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖液中，在280nm處測定 UV吸光度，所述吸收度通過使用校準曲線提供了 IL-IRa濃度值。
[0157] 實施例14 :基于10: lw/w的HA十六燒基酉先胺和RNase的制齊[j的制備
[0158] 將8mg如實施例1中所述制備的HyadcM溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中。完全溶解后，加入預溶于磷酸鹽緩沖液中的RNaseO. 8mg，適宜混合以便蛋白質被捕獲入凝膠中。如下計算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖液中，在280nm處測定UV吸光度，所述吸收度通過使用校準曲線提供了 RNase濃度值。
[0159] 實施例15 :含有由10: lw/V比例的HA十六烷某酰胺和胰島素形成的釋放系統的泡丨齊I丨的泡丨備
[0160] 將8mg如實施例1中所述制備的HyadcM溶于Iml pH = 6. 9的磷酸鹽緩沖液中。完全溶解后，加入預溶于磷酸鹽緩沖液中的胰島素0. 8mg，適宜混合以便蛋白質被捕獲入凝膠中。如下計算凝膠的裝載量：將其以1:10稀釋于緩沖液中，在280nm處測定UV吸光度，所述吸收度通過使用校準曲線提供了 IL-IRa濃度值。
[0161] 實施例16 :用HA或HA酰胺配制的hGH的釋放研究
[0162] 將如實施例6-11所述制備的制劑引入具有IOOkDa截留的透析管中，浸入溫和攪拌的PH7磷酸鹽緩沖液中，監測從供體隔室的釋放。為了比較，將0.8mg hGH與Iml磷酸鹽緩沖液（PBS)混合，將制劑引入透析管中。
[0163] 在所有實驗中始終維持漏槽狀態。在預設時間，從供體隔室取50 iU等分試樣并 1:10稀釋以確定隨時間推移的蛋白質含量。通過在280nm的UV讀數和220nm的RP-HPLC 平行進行分析，以確定剩余蛋白質及其降解（如果有的話）的量。還進行了散射測量以研究所配制蛋白質的聚集。最后，從接收隔室取出樣品以檢查蛋白質的釋放量對應于從供體隔室中消失的量，并且進行質譜測量（Esi-Tof)以證實所釋放的GH未經歷任何結構降解。通過顯示隨時間推移釋放的蛋白質百分比構建了釋放曲線。圖2、3、4和5。
[0164] 結果
[0165] 圖2顯示了通過由HyadcM和hGH形成的系統確定的hGH釋放特性對比于通過在 PBS中制備的相同蛋白質代表的對照。
[0166] Ml顯示了與LMW-HA和MMW-HA聯合配制的hGH蛋白質的釋放特性：在兩種情況下，測試了兩種不同的HA和hGH重量比(10:1和20:1)，因為申請人:通過該實驗旨在證實：對比于通過在PBS、即在水性溶劑中制備所獲得的特性，具有疏水性質的蛋白質即使與大量具有不同MW的HA聯合也不會使蛋白質的釋放特性產生任何變化。
[0167] 圖4將由本發明的酰胺和hGH形成的釋放系統的hGH釋放特件與由hGH在PBS中所代表的對照進行了比較。
[0168] 圖5顯示了由本發明的酰胺形成的釋放系統的50% hGH釋放時間，同樣對比于如上文所述的對照。
[0169] 如果將圖3與圖2和4相比較，可以看出：對比于由在PBS中分析的蛋白質所代表的對照以及對比于在具有不同MW的HA中以不同重量比配制的蛋白質，由HA酰胺（如上文所述和所要求）與具有主要是疏水性質的蛋白質（在此情況中為hGH)形成的釋放系統以顯然顯著的方式引起了蛋白質隨時間推移持續緩慢釋放。因此，決定所研究的疏水性蛋白質的釋放特性改變的不是所述多糖的濃度和/或MW，而是該聚合物的化學性質。所有這些在圖5中更清楚，圖5比較了 50% hGH釋放時間：該圖顯示，對比于對照（在PBS中的hGH)，本發明涉及的新釋放系統使釋放時間升高一直到3倍。
[0170] 實施例17 :sCT、ILl_Ra和胰島素的釋放對比于親水件蛋白質RNase A的釋放特件的研究
[0171] 將如實施例12-15所述制備的制劑各自引入具有IOOkDa截留的透析管中，浸入溫和攪拌的PH7磷酸鹽緩沖液中。為了比較，將0. 8mg降鈣素、IL-IRa、胰島素或RNase與Iml 磷酸鹽緩沖液混合，將制劑引入透析管中，以監測其隨時間推移從供體隔室的釋放。
[0172] 在所有實驗中始終維持漏槽狀態。在預設時間，從供體隔室取IOiU等分試樣并 1:10稀釋以確定隨時間推移的蛋白質含量。通過在280nm的UV讀數平行進行分析，以確定剩余蛋白質的量。還進行了散射測量以研究所配制蛋白質的聚集。最后，從接收隔室取出樣品以檢查蛋白質的釋放量對應于從供體隔室中消失的量。構建了釋放曲線，對比于對照顯示了隨時間推移釋放的蛋白質百分比。
[0173] 蛋白質RNase A的GRAVY指數=-0. 67,因此不能歸類為主要為疏水性的蛋白質，而是親水性蛋白質。下文進行了描述以將其釋放特性與由聯合有主要具有疏水性質的蛋白質的Hyadd釋放系統所得到的特性相比較，從而證實存在差異。
[0174]
[0175] 圖6-8顯示了所分析的三種具有主要是疏水性質的蛋白質的釋放曲線：在所有三種情況中，由HA十六烷基酰胺聯合所述蛋白質形成的系統決定其持續緩慢釋放達到比對照長得多的時間。
[0176] 相反，圖9證實：相同的十六烷基酰胺以相同重量比（10:lw/w)與蛋白質 RNase(具有主要是親水的性質且GRAVY指數=-0.67)的聯合決定了與由相同蛋白質在 PBS中配制所產生的釋放特性相同的釋放特性。
[0177] 實施例18 :hGH釋放入源自骨關節炎患者的人滑液（LS)的研究
[0178] 首先，將激素hGH與熒光探針（Cy5. 5)共價結合，從而可以在其它滑液蛋白質存在的情況下清楚地識別出激素hGH。為此目的，將1.5mg hGH溶于2ml pH8硼酸鹽緩沖液中，向其中加入2mg預溶于60 ill DMSO中的Cy5. 5。在遮光和溫和攪拌下進行標記反應18小時。然后通過針對磷酸鹽緩沖液透析4天和針對MilliQ水透析1天進行純化。然后通過凝膠過濾分析經標記的蛋白質，以驗證其純度。
[0179] 如實施例7所述以10:1重量比制備基于HyadcM和hGH_Cy5. 5的制劑。將兩種成分適宜混合，以便使組合物均勻并且蛋白質被捕獲入凝膠中。將如此獲得的凝膠引入具有 IOOkDa截留的透析管中，浸入由PBS和源自骨關節炎患者的滑液組成（v/vl:l)的介質中，維持在溫和攪拌下。
[0180] 在預設時間測定隨時間推移釋放到接收隔室的蛋白質量。該分析通過具有熒光檢測器的RP-HPLC進行，不僅確定hGH含量，而且還檢查了該蛋白質未經歷降解。構建釋放曲線，顯示了長達48小時的隨時間推移釋放的蛋白質的百分比。
[0181]
[0182] 圖10顯示了所得結果：hGH從由HyadcM聯合所研究蛋白質形成的系統向LS中的釋放證實，以前在圖2中證實的持續緩慢釋放保持不變。因此，可以說明：Hyadd系統中所包含的蛋白質/藥物受到保護，并且在富含酶、蛋白質（有些具有未知性質）和促炎分子的釋放介質如OA患者的滑液中未經受降解。
[0183] 實施例19 :由Hvadd4和hGH形成的系統在關節內施用于大鼠后的藥物動力學研究
[0184] 將8mg如實施例1中所述制備的HyadcM溶于Iml pH = 6. 9磷酸鹽緩沖液中，于 121°C濕熱滅菌。隨后，在無菌環境下加入0. SmghGH (預溶于水溶液中并通過0. 2微米再生纖維素濾器進行過濾滅菌）并適宜混合，以便使組合物均勻并且蛋白質被捕獲入凝膠中。
[0185] 對于體內研究，將等同于IOOii g蛋白質/動物的制劑量注射入大鼠膝蓋中。在預定時間（0. 15、1、2、3、4、5、6、7、8、24和4811)取血漿樣品，進行￡1154測試以評估1.&.施用后穿透到血漿中的hGH濃度。該實驗一式三份進行。
[0186] 為比較目的，將一組動物用等量的游離hGHdOOyg)同樣通過關節內施用進行處理。通過將血漿中發現的hGH濃度（ng/ml)作為時間（一直到48h)的函數作圖，獲得了藥物動力學曲線。
[0187] 益果
[0188] 如圖11所示，在關節內注射后立即能在血漿中發現所注射的蛋白質。
[0189] 但是，由于Hyadd系統產生的蛋白質持續釋放，其保留在原位、即關節腔中并且未穿透到血流中，從而其全部作用均發生在注射部位。
【權利要求】
1. 用于持續釋放治療學和/或生物學活性蛋白質的系統，包含： a) 具有主要是疏水性質的蛋白質，和 b) 透明質酸（HA)酰胺其中所述具有主要是疏水性質的蛋白質具有超過_〇. 5的GRAVY指數，并且所述HA酰胺選自： ?HA十六烷基酰胺：具有十六烷基胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為7%至14%、優選 8%至 9% ; ? HA辛基酰胺：具有辛胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為10%至15%、優選10%至 11% ； ? HA十二烷基酰胺：具有十二烷基胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為10%至15%、優選 10%至 11% ; ?HA叔丁基酰胺：具有叔丁基胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為7%至12%、優選7% 至8% ; ?HA芐基酰胺：具有芐胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為7%至15%、優選8%至9%。
2. 權利要求1所要求的用于持續釋放蛋白質的系統，其中用于制備酰胺的HA具有400 至3-106Da、特別是50至730KDa、750至1230KDa或1500至2500KDa、甚至更特別是150至 250KDa或500至730KDa的重均分子量。
3. 權利要求1-2所要求的用于持續釋放蛋白質的系統，其中所述的具有主要是疏水性質的治療學和/或生物學活性蛋白質是胰島素、hGH、sCT、IL-IRa、G-CSF、TOGF、優選 PDGF-BB、TGF- P、EGF、VEGF-B、EPO、NGF P、轉鐵蛋白、HMP-2、HMP-3 和 TMP-4。
4. 權利要求1-3所要求的用于持續釋放蛋白質的系統，其中所述HA酰胺是十六烷基酰胺，并且用于制備所述酰胺的HA具有150至250KDa或500至730KDa的重均分子量。
5. 權利要求4所要求的用于持續釋放蛋白質的系統，其中所述治療學和/或生物學活性蛋白質是hGH或sCT，任選與穩定劑和賦形劑聯合。
6. 權利要求3所要求的用于持續釋放蛋白質的系統，其中所述治療學和/或生物學活性蛋白質是胰島素，任選與穩定劑和賦形劑聯合。
7. 權利要求4所要求的用于持續釋放蛋白質的系統，其中所述治療學和/或生物學活性蛋白質是TOGF、優選TOGF-BB、TGF- 0、EGF或VEGF-B，任選與穩定劑和賦形劑聯合。
8. 權利要求4所要求的用于持續釋放蛋白質的系統，其中所述治療學和/或生物學活性蛋白質是金屬蛋白酶抑制劑TMP-2、TMP-3或TMP-4,任選與穩定劑和賦形劑聯合。
9. 權利要求1-8任一項所要求的用于持續釋放蛋白質的系統，用于在治療由骨關節炎導致的關節損傷、治療腱炎、修復心肌損傷、修復骨折/空腔或愈合皮膚潰瘍/創傷/撕裂傷中用于注射、關節內或局部應用。
10. 權利要求5所要求的用于持續釋放蛋白質的系統，用于在治療骨關節炎、類風濕性或銀屑病性關節炎和/或骨質疏松癥中用于關節內應用。
11. 權利要求3所要求的用于持續釋放蛋白質的系統，用于在治療由骨關節炎導致的關節損傷、治療腱炎、修復心肌損傷、修復骨折/空腔或愈合皮膚潰瘍/創傷/撕裂傷中用于注射、關節內或局部應用。
12. 權利要求7所要求的用于持續釋放蛋白質的系統，用于在治療由骨關節炎導致的關節損傷、治療腱炎、修復心肌損傷、修復骨折/空腔或愈合皮膚潰瘍/創傷/撕裂傷中用于注射、關節內或局部應用。
13. 權利要求8所要求的用于持續釋放蛋白質的系統，用于在治療由骨關節炎引起的關節軟骨損傷和/或修復骨軟骨侵蝕中用于注射或關節內應用。
14. 透明質酸（HA)酰胺和具有主要是疏水性質的蛋白質在形成用于持續釋放治療學和/或生物學活性蛋白質的系統中的用途，其中所述具有主要是疏水性質的蛋白質具有超過-0. 5的GRAVY指數，并且其中所述HA酰胺選自： a) HA十六烷基酰胺：具有十六烷基胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為7%至14%、優選8%至9% ; b) HA辛基酰胺：具有辛胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為10%至15%、優選10%至 11% ； c) HA十二烷基酰胺：具有十二烷基胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為10%至15%、優選 10%至 11% ; d) HA叔丁基酰胺：具有叔丁基胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為7 %至12 %、優選7 % 至8% ; e) HA芐基酰胺：具有芐胺的HA酰胺，摩爾酰胺化百分比為7%至15%、優選8%至9%; 其中用于制備酰胺的HA具有400至3xl06Da、特別是50至730KDa、750至1230KDa或 1500至2500KDa、甚至更特別是150至250KDa或500至730KDa的重均分子量。
15. 權利要求14所要求的用途，其中所述具有主要是疏水性質的治療學和/或生物學活性蛋白質是胰島素、hGH、sCT、IL-IRa、G-CSF、PDGF、優選 PDGF-BB、TGF- 0、EGF、VEGF-B、 EPO、NGFP、轉鐵蛋白、HMP-2、HMP-3 和 TMP-4。
16. 權利要求15所要求的用途，其中所述HA酰胺是十六烷基酰胺。
17. 權利要求16所要求的用途，其中所述治療學和/或生物學活性蛋白質是hGH或 sCT，任選與穩定劑和賦形劑聯合。
18. 權利要求17所要求的用途，用于骨關節炎、類風濕性或銀屑病性關節炎和/或骨質疏松癥的關節內治療。
19. 權利要求15所要求的用途，用于在治療由骨關節炎導致的關節損傷、治療腱炎、修復心肌損傷、修復骨折/空腔或愈合皮膚潰瘍/創傷/撕裂傷中用于注射、關節內或局部應用。
20. 權利要求16所要求的用途，其中所述治療學和/或生物學活性蛋白質是金屬蛋白酶抑制劑TIMP-2、TIMP-3或TIMP-4,任選與穩定劑和賦形劑聯合，用于注射或關節內治療由骨關節炎引起的關節軟骨損傷和/或修復骨軟骨侵蝕。
【文檔編號】A61K47/36GK104349788SQ201380028007
【公開日】2015年2月11日申請日期:2013年5月30日優先權日:2012年5月31日
【發明者】M·坎皮西, C·古麗瑟, D·雷尼爾申請人:菲迪亞制藥股份公司

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