提高造血干細胞歸巢及植入率的方法和試劑的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種提高造血干細胞歸巢及植入率的方法和試劑。所述方法包括下述步驟：含造血干細胞的供體細胞與陽離子肽衍生物共同孵育后，將細胞移植到受體體內，以達到增強造血干細胞歸巢及植入，縮短受體造血重建時間，提高造血干細胞移植成功率的效果。本發明也提供了陽離子肽衍生物在制備治療血液系統疾病藥物中的應用。
【專利說明】提高造血干細胞歸巢及植入率的方法和試劑
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬于生物醫藥【技術領域】，具體屬于造血干細胞移植領域，更具體地涉及一種提高造血干細胞歸巢及植入率的方法和試劑。
【背景技術】
[0003]自從上世紀五十年代，學者發現骨髓移植能夠治療致死劑量照射小鼠以來，造血干細胞的造血重建功能受到廣泛關注。造血干細胞是一類能夠自我復制并能夠分化為成熟全血細胞的細胞。在成體內，造血干細胞存在于特定的微環境一龕位中。微環境通過可溶性及膜表面因子支持造血干細胞保持其正常的生物學功能，包括自我復制、分化、遷移等。成人體內，骨髓被認為是造血干細胞最主要的龕位。目前確定的龕位有兩種類型，包括內皮型龕位，由內皮細胞、成骨細胞及破骨細胞組成；血管周圍型龕位，由毛細血管內皮、間質細胞及網狀細胞等組成。另外，龕位中的細胞外因子，包括Ca2+、CXCL12/SDF-1、干細胞因子等也具有保持造血細胞功能及定位的功能。人源干細胞的表面標記包括CXCR4，⑶34，⑶150及⑶133等，在實驗條件下，⑶34+⑶133+Lin_細胞被定義為人體造血干細胞。
[0004]造血干細胞歸巢和植入到骨髓是造血干細胞移植成功與否的關鍵。造血干細胞歸巢及植入是一個復雜的過程，包括以下三個步驟I)造血干細胞在內皮細胞上的滾動及固定；2)與內皮細胞的粘附及跨膜運動；3)歸巢及植入到龕位。在上述步驟中，造血干細胞表面表達的VLA-4，VLA-5,⑶44及LFA-1等多種粘附分子與骨髓微環境中表達的VCAM-1, ICAM-1,纖維連接 蛋白及纖維蛋白原等相互結合，是影響造血干細胞歸巢及植入的關鍵因素。
[0005]SDF-1是一種干細胞趨化因子，參與包括遷移、激活及分化在內的多種干細胞生物學活動。造血干細胞表達兩種SDF-1受體，CXCR4和CXCR7。SDF-1/CXCR4反應軸被證實在胚胎發育過程中及成體內對造血干細胞的遷移起到關鍵的作用。實驗證明，在經過放射線或者化療藥物處理過的小鼠骨髓內的SDF-1水平的增高，對造血干細胞的歸巢和植入以及造血重建具有重要作用。CXCR4在包括造血干細胞在內的多種血細胞中均有表達。SDF-1/CXCR4反應軸影響造血干細胞的多種生物學活動，包括趨化運動、粘附分子的表達、蛋白酶的釋放等；這些生物學效應對造血干細胞的歸巢及植入具有重要作用:例如=SDF-1與造血干細胞表面CXCR4受體結合后，I)可以增加其表面LFA-1、VLA-4、VLA-5等粘附分子的表達，促進其與骨髓微環境的粘附；2)增加造血干細胞MMP-2 and MMP-9的釋放，促進其跨膜運動；3)刺激肌動蛋白聚合，改變細胞骨架狀態，使造血干細胞更易于遷移。因此，SDF-1/CXCR4軸對造血干細胞的歸巢、植入及移植成功率具有重要作用。
[0006]造血干細胞存在于多種組織，包括胎兒肝臟、成體骨髓、動員后的成體外周血、臍帶血及胎盤組織等。造血干細胞移植被認為是目前治療多種血液腫瘤及遺傳性疾病的有效手段。臨床上，造血干細胞移植成功率取決于有效歸巢及植入的造血干細胞數量。由于造血干細胞動員、臍帶血、胎盤等來源的造血干細胞數量較少，而經過體外擴增后的造血干細胞歸巢及植入效率大大降低，難以達到有效移植，所以提高有限數量的造血干細胞的歸巢及植入效率的方法對造血干細胞移植成功率具有重要意義。
[0007]C3a被證明能夠通過提高造血干細胞表面CXCR4受體對SDF-1的應答來增強造血干細胞的歸巢和植入。C3a作為一種補體激肽，具有細胞激肽樣作用，可以增加毛細血管的通透性，引起炎性滲出、水腫等多種急性炎性反應，而且該類炎性反應不為抗組胺藥抑制。另外，C3a還是一種過敏毒素，能夠直接引發多種細胞的脫顆粒反應，包括內皮細胞、肥大細胞、吞噬細胞等，從而引發局部的急性炎癥反應，如果脫顆粒反應擴散，會引起過敏性休克。C3a還可以間接引起平滑肌收縮，導致支氣管和消化系統痙攣等。另外，C3a還對其他免疫細胞具有趨化作用，引發更多炎性細胞的集中和過敏毒素的釋放，從而加劇炎癥反應。因此，靜脈輸注C3a對于經過放射或者化療治療的骨髓移植患者來說，安全性方面的障礙難以克服，亟待提供了一種更安全的并能夠提高造血干細胞歸巢和植入效率的預處理方法。
[0008]陽離子肽，又被稱為抗菌肽，是一類攜帶正電荷的小分子肽，是一種在進化過程中非常保守的天然抑菌物，存在于多種動物的不同組織中。陽離子肽主要通過與細菌及病毒等外膜作用，影響膜結構，實現其抑菌功能。目前發現的陽離子肽已超過1500種。除了直接的抗菌作用外，陽離子肽還具有多種生物學功能，包括免疫調節、介導免疫細胞趨化運動、促進細胞因子和趨化因子的釋放、促進組織修復和血管再生及免疫細胞間的轉化等。hLFl - 11是人源乳鐵蛋白的衍生物，是一種具有其N端11個殘基序列的合成肽，能夠刺激人單核細胞釋放細胞因子和趨化因子。作為一種新的抗菌素，該合成肽正處于臨床試驗階段。0P-145是cathelicidin家族的體外合成衍生物，在結構和生物學效應上均與LL-37相似，該合成肽正處于 臨床試驗階段，作為一種新的治療中耳炎的抗生素。hLFl - 11和0P-145均已進入二期臨床試驗，其安全性已經得到驗證，但尚未發現有人利用hLFl - 11和0P-145體外預處理造血干細胞以提高其歸巢和植入效率。

【發明內容】

[0009]本發明解決的技術問題是提供一種提高造血干細胞歸巢及植入率的方法和試劑。本發明方法通過體外預處理造血干細胞，以達到提高造血干細胞歸巢及植入率和提高造血干細胞移植成功率的效果。
[0010]本發明采用的技術方案如下:
將含有造血干細胞的供體單核細胞，與至少一種陽離子肽衍生物進行混合孵育，將造血干細胞與陽離子肽衍生物混合物或者分離后的造血干細胞用于造血干細胞移植。toon]所述陽離子肽衍生物包括hLFl -1kgrrrrsvqwca^popi45(igkefkriverikrflrelvrplr)中一種或者兩種。
[0012]孵育時，陽離子肽衍生物hLFl - 11的濃度為1-100微克/毫升；陽離子肽衍生物0P145的濃度為1-20微克/毫升。
[0013]所述孵育為造血干細胞與陽離子肽衍生物于37°C，5%C02條件下共培養30分鐘。
[0014]所述分離后造血干細胞為經過細胞緩沖液沖洗、離心分離后細胞，其中不含或僅含微量陽離子肽衍生物。
[0015]所述造血干細胞包括來源于供體骨髓、臍帶血、胎盤及外周血造血干細胞動員所獲得的含有造血干細胞的細胞樣品。
[0016]本發明方法以陽離子肽衍生物為主要成分對造血干細胞預處理，提高了造血干細胞在體外對SDF-1的應答效應，增加造血干細胞在體內的歸巢和植入效率，縮短造血系統重建所需的時間，提高造血干細胞移植成功率，彌補造血干細胞來源不足的現狀。另外，陽離子肽作為一種天然存在的人體成分，靜脈低劑量輸注其衍生成分對人體安全性沒有不良影響。由此可見，本發明實際上也提供了陽離子肽衍生物在制備治療血液系統疾病藥物中的應用。所述的陽離子肽衍生物為hLFl - 11 (GRRRRSVQffCA)和0P145(IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR)中一種或者兩種。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]1.陽離子肽衍生物不影響臍帶血來源的人體造血干細胞的分化功能:陽離子肽衍生物預處理后的臍帶血來源的人體造血干細胞向全系血細胞分化的能力不受影響。(CFU,集落形成單位；GM，粒細胞和巨噬細胞；G，粒細胞；M，巨噬細胞；BFU-E，紅系爆式集落形成單位；Meg，巨核細胞；Ctl，陰性對照)。
[0018]2.陽離子肽衍生物在體外能夠提高臍帶血來源的人體造血干細胞對SDF-1的趨化反應:陽離子肽衍生物與SDF-1共同存在時，造血干細胞對SDF-1的趨化反應明顯提高，表現為遷移的造血干細胞(能夠分化為全系血細胞的干/祖細胞)數量的增加。
[0019]3.陽離子肽衍生物預處理能夠提高臍帶血來源的人體造血干細胞的歸巢效率:細胞移植11天后，受體骨髓中單核細胞數量，造血干細胞數量均比陰性對照組有明顯提聞。
[0020]4.陽離子肽衍生物預處理能夠提高臍帶血來源的人體造血干細胞的植入效率:細胞移植后11天，小鼠脾臟集落形成單位(CFU-S)數量均比陰性對照組有明顯提高。
[0021]5.陽離子肽衍生物預處理能夠縮短臍帶血來源的人體造血干細胞的對放射處理小鼠的造血重建所需時間:細胞移植后4周內，小鼠外周血細胞(WBC，白細胞；neutrophil,中性粒細胞；lymphocyte,淋巴細胞；platelet,血小板)恢復時間均比陰性對照組有明顯縮短。
【具體實施方式】
[0022]1.獲取人源臍帶血單核細胞:健康供者提供的臍帶血與磷酸鹽緩沖液混合后離心，獲得的細胞與紅細胞裂解液(Pharm Lyse buffer, BD Biosciences)混合,去除紅細胞后，用磷酸鹽緩沖液沖洗，離心，獲得含有造血干細胞的人源臍帶血單核細胞，重懸于適當溶液中，備用。
[0023]2.檢測陽離子肽衍生物對人臍帶血造血干細胞分化功能的影響:上述方式獲得的人臍帶血單核細胞重懸于含0.5%牛血清白蛋白的RPMI1640培養基中(Hyclone)與20 ug/ml hLFl - 11 (Peptisyntha)或 / 和 2 ug/ml 0P145(OctoPlus Technologies andLeiden University Medical Center)在37°C，5%C02條件下孵育I小時后，將細胞與陽離子肽衍生物混合物，進行集落形成單位試驗。具體步驟如下:細胞計數重懸后，按照1:9的體積與人甲級纖維素 (R&D Systems)混合，在CFU-GM中加入25ng/ml GM-CSF和10ng/mlIL-3 (Millipore);在 CFU-G 中加入 20ng/ml G-CSF ;在 CFU-M 中加入 10ng/ml M-CSF ;在BFU-E中加入5ng/ml干細胞因子和5 U/ml紅細胞生成素(Stem Cell Tech ) ^CFU-Meg中加入100ng/ml血小板生成素。在孵箱中培育7_14天，在顯微鏡下進行集落計數。結果如圖1所示，陽離子肽衍生物預處理后的人臍帶血來源的造血干細胞向全系血細胞分化的能力不受影響。
[0024]3.檢測陽離子肽衍生物對于人臍帶血造血干細胞對SDF-1趨化反應的影響:利用Transwell(24孔板,濾網孔徑8微米,Costar Corning)板檢測造血干細胞對SDF-1; SDF-1+0P145; SDF-1+ hLFl - 11; SDF-1+ OP145 + hLFl - 11 的趨化反應。步驟如下:計數后,將100 ul細胞懸液(含0.5%牛血清白蛋白的RPMI1640培養基)加入濾網內，培養孔內加入650 ul含有不同因子組合的基礎溶液(含0.5%牛血清白蛋白的RPMI1640培養基)，置于二氧化碳孵箱中孵育3小時，取濾網外細胞進行計數和集落形成單位試驗。結果如圖2所示，陽離子肽衍生物與SDF-1共存時，造血干細胞對SDF-1的趨化反應明顯提高，表現為遷移的造血干細胞(能夠分化為全系血細胞的干/祖細胞)數量的增加。
[0025]4.檢測陽離子肽衍生物預處理對人臍帶血造血干細胞的歸巢和植入效率以及造血重建時間的影響:經陽離子肽衍生物預處理(20 ug/ml hLFl-11或/和2 ug/ml 0P145,37°C，5%C02條件下孵育30分鐘)的人臍帶血造血干細胞，通過尾靜脈注射，移植到接受Y射線照射(450cGY)的重癥聯合免疫缺陷小鼠(N0D-SCID小鼠，6_8周，雄性)體內。于移植后第11天，取小鼠股骨進行單個核細胞計數和集落形成單位試驗，檢測預處理對造血干細胞歸巢影響。如圖3所示，經陽離子肽衍生物預處理的人臍帶血造血干細胞的歸巢效率明顯增加，表現為骨髓中單核細胞數量，造血干細胞數量均比陰性對照組有明顯提高；于移植后第11天，取小鼠脾臟并進行脾臟集落形成單位計數，檢測預處理對造血干細胞植入的影響。如圖4所示，經陽離子肽衍生物預處理的人臍帶血造血干細胞的植入效率明顯增加，表現為脾臟集落形成單位計數較對照組有明顯增加。細胞移植后，于第0，5，7，11，16，21天，經小鼠眼窩血管叢取血進行血細胞計數(白細胞，中性粒細胞，淋巴細胞及血小板計數；Hemavet 950, Drew Scientific Inc),檢測預處理對造血干細胞對受體造血系統重建時間的影響。如圖5所示，經陽離子肽衍生物預處理的人臍帶血造血干細胞能夠縮短小鼠的造血系統重建所需時間，表 現為小鼠外周血細胞(白細胞；中性粒細胞；淋巴細胞；血小板)恢復時間均比陰性對照組有明顯縮短。
【權利要求】
1.一種提高造血干細胞歸巢及植入率的方法，其特征在于， 將含有造血干細胞的供體單核細胞，與至少一種陽離子肽衍生物進行混合孵育，將造血干細胞與陽離子肽衍生物混合物或者分離后的造血干細胞用于造血干細胞移植。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述陽離子肽衍生物為hLFl- 11和OP145中一種或者兩種。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，孵育時，陽離子肽衍生物hLFl- 11的濃度為1-100微克/毫升；陽離子肽衍生物0P145的濃度為1-20微克/毫升。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述孵育為造血干細胞與陽離子肽衍生物于37°C，5%C02條件下共培養30分鐘。
5.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述造血干細胞包括來源于供體骨髓、臍帶血、胎盤及外周血造血干細胞動員所獲得的含有造血干細胞的細胞樣品。
6.陽離子肽衍生物在制備治療血液系統疾病藥物中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述的陽離子肽衍生物為hLFl- 11和OP145中一種或者 兩種。
【文檔編號】A61K38/16GK103784940SQ201410074316
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年3月3日 優先權日:2014年3月3日
【發明者】吳皖, 湯威, 羅琳, 邢文彥 申請人:湖北華賽生物醫藥技術有限公司