Cntf在角膜緣干細胞增殖和角膜上皮損傷修復中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明的目的是提供一種睫狀神經營養因子在促進角膜緣干細胞增殖和促進角膜上皮損傷修復中的應用，具體涉及睫狀神經營養因子及其衍生物在制備藥物及藥物組合物中的用途，可用于眼表角膜和結膜上皮干細胞的培養、糖尿病角膜病變的治療、神經性角膜炎的治療、角膜緣干細胞缺乏癥的治療。
【專利說明】CNTF在角膜緣干細胞增殖和角膜上皮損傷修復中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于眼科疾病治療【技術領域】，具體涉及一種睫狀神經營養因子(CNTF)在促進角膜緣干細胞增殖和促進角膜上皮損傷修復中的應用。
【背景技術】
[0002]角膜的透明及功能的完整取決于角膜各層組織的結構和代謝的正常，而位于最外層的角膜上皮組織無疑對此起著相當重要的作用。角膜上皮是防御外界致病因子侵犯的物理屏障，其完整性的維持依賴于上皮細胞的細胞間，細胞與基底膜之間的緊密連接和錨定連接以及上皮細胞不斷自我更新。
[0003]角膜上皮層受損可影響細胞間的連接，引起細胞膜的通透性和選擇性發生變化，從而影響其屏障功能，導致角膜易受外界致病因子的侵害引起炎癥導致角膜混濁，甚至引起失明。角膜損傷后的再上皮化是損傷修復的一個最基本的過程，上皮化可以迅速重建上皮屏障，這對于保持角膜的結構完整及正常功能非常重要。角膜上皮細胞的自我更新源于角膜緣干細胞的不斷增生分化，表現為增生的基底細胞的不斷向心、向上移動至翼狀細胞層進行分化且形成細胞與細胞間及細胞與基質間的緊密連接，從而取代不斷脫落的表皮細胞層。簡而言之，上皮細胞的不斷更新依賴于基底細胞的不斷增生、分化、移行與表層細胞的不斷脫落之間的動態平衡。各種物理損傷、化學損傷、機械損傷、病原微生物、內分泌及免疫性因素均可導致角膜上皮損傷。如糖尿病性角膜病變，有研究表明:47%-64%的糖尿病患者可能會出現原發性角膜病變，其臨床特征主要表現為角膜敏感度下降、上皮愈合延遲、神經營養性角膜潰瘍等癥狀。糖尿病患者在進行白內障或視網膜手術后可能出現角膜上皮再生延遲，甚至出現反復剝脫 現象。
[0004]角膜上皮損傷后的愈合是一個非常復雜的過程，有許多細胞參與，各種細胞又分泌多種細胞因子，這些細胞之間、因子之間、細胞和因子之間存在著錯綜復雜的關系，涉及到細胞運動、粘附、增殖和分化等各個方面，構成一個復雜的網絡調控體系。角膜上皮損傷后的愈合過程非常復雜，有許多因素參與調節:①源于基底細胞及角膜緣干細胞的不斷增殖、分化的上皮細胞的自我更新對上皮細胞損傷后的迅速再上皮化、重建上皮屏障，從而保持角膜的結構完整及正常功能非常重要；②在角膜上皮愈合過程中，由細胞表達的不同的細胞外基質分子及細胞表面受體，對由細胞骨架介導的細胞粘附和運動方面起關鍵性作用；③許多生長因子如EGF、KGF、HGF、TGF、PDGF等)通過自分泌或/和旁分泌途徑參與調節角膜上皮細胞的增殖及遷移，維持角膜結構和功能的正常；④位于細胞表面的細胞粘附分子(如整合素)以受體-配體的形式發揮作用，在角膜創傷愈合中起重要作用；⑤另外，其他一些因素如神經性因素等也參與調節角膜上皮細胞的屏障功能及創傷愈合。
[0005]不論何種原因引起的角膜上皮缺損，能否迅速完整地修復，是恢復角膜上皮細胞的屏障功能、促進創傷愈合、保持良好視力的關鍵。因此全面了解角膜上皮細胞屏障功能及創傷愈合的調節因素，對臨床上治療角膜上皮細胞屏障功能障礙及促進創傷愈合來講是非常重要的。
【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種睫狀神經營養因子在促進角膜緣干細胞增殖和促進角膜上皮損傷修復中的應用，具體涉及睫狀神經營養因子及其衍生物在制備藥物及藥物組合物中的用途，可用于眼表角膜和結膜上皮干細胞的培養、糖尿病角膜病變的治療、神經性角膜炎的治療、角膜緣干細胞缺乏癥的治療。
[0007]本發明首先提供一種睫狀神經營養因子的新用途，即在制備治療角膜緣干細胞增殖和促進角膜上皮損傷修復制品中的應用；
[0008]所述的制品為滴眼液，其中包含有藥理有效濃度的睫狀神經營養因子；
[0009]所述的制品還可以是注射液；
[0010]所述的睫狀神經營養因子，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1;
[0011]為了提高睫狀神經營養因子在治療角膜緣干細胞增殖和促進角膜上皮損傷修復中的效果，發明人對睫狀神經營養因子的氨基酸序列進行了改造，改造后的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
[0012]本發明發現CNTF不僅能促進角膜緣干細胞增殖和克隆形成能力，還能促進正常小鼠和糖尿病小鼠的角膜上皮的損傷修復，可用于眼表角膜和結膜上皮干細胞的培養、糖尿病角膜病變的治療 、神經性角膜炎的治療、角膜緣干細胞缺乏癥的治療。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1:在TKE2的培養基中添加不同濃度的CNTF對細胞克隆形成能力的影響，培養液中添加10ng/ml和20ng/ml CNTF能有效促進TKE2細胞克隆的形成能力。
[0014]圖2 =CNTF處理后的細胞計數結果。培養液中添加CNTF能有效促進TKE2細胞克隆的增殖，*ρ〈0.05，**Ρ〈0.01。
[0015]圖3 =CNTF對ΤΚΕ2細胞標記物Ρ63表達的影響。培養液中添加10ng/ml的CNTF能有效促進TKE2細胞P63的表達。
[0016]圖4 =CNTF對TKE2細胞標記物ABCG2表達的影響。培養液中添加10ng/ml的CNTF能有效促進TKE2細胞ABCG2的表達。
[0017]圖5 =CNTF對TKE2細胞標記物Bmi I表達的影響。培養液中添加10ng/ml的CNTF能有效促進TKE2細胞Bmil的表達。
[0018]圖6 =CNTF對TKE2細胞標記物Λ ΝΡ63表達的影響。培養液中添加10ng/ml的CNTF能有效促進TKE2細胞ΛΝΡ63的表達。
[0019]圖7 =CNTF對TKE2細胞標記物ki67表達的影響。培養液中添加10ng/ml的CNTF能有效促進TKE2細胞ki67的表達。
[0020]圖8 =CNTF對正常小鼠角膜上皮損傷修復的影響，結膜下注射50ngCNTF能有效促進角膜上皮的損傷修復。
[0021]圖9 =CNTF對STZ誘導的糖尿病小鼠角膜上皮損傷修復的影響，結膜下注射50ngCNTF能有效促進糖尿病小鼠角膜上皮的損傷修復。
【具體實施方式】[0022]本發明在小鼠角膜上皮干細胞系TKE2的培養基KSFM中添加一定劑量的CNTF(例如IO-1OOng/μ I)能夠有效地促進角膜緣干細胞的增殖。同時，在正常C57BL/6小鼠和STZ誘導的糖尿病C57BL/6小鼠中，建立角膜上皮刮除損傷模型后，結膜下注射一定劑量的CNTF (例如50ng)，能夠有效地促進角膜上皮損傷修復，從而促成了本發明。
[0023]CNTF最初是從雞的眼組織睫狀節中提取出來，因對睫狀節神經元有營養作用并可維持雞副交感神經節的存活而得名。CNTF是由一個約200個氨基酸殘基組成的酸性蛋白質，分子量為20~24kD，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1，在第17位有一個CyS，分子內無二硫鍵，無分泌信號，無N-糖基化位點和信號及肽。研究發現，CNTF具有多種功能，在神經系統，肌肉系統，肥胖癥及其相關疾病的發生發展過程中發揮重要作用。
[0024]實施例1:添加不同濃度的CNTF對TKE2細胞的影響
[0025]1.應用 TKE2 細胞的培養液(Keratinocyte-SFM 加 BPE (50 μ g/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBC0, 10724-011)常規培養TKE2細胞，將1000個細胞接種至30mm培養皿中，分別向各皿中添加不同濃度的CNTF(0、5、10、20和50ng/ml)，然后于5%C02和37攝氏度的條件下培養，每3天更換新培養基，同時添加上述濃度的CNTF因子，培養9天后固定細胞后使用結晶紫染色。CNTF處理后的細胞克隆生長情況見圖1。如圖1所示，培養液中添加10ng/ml或20ng/ml的CNTF能有效促進TKE2細胞克隆的形成能力。
[0026]2.應用 TKE2 細胞的培養液(Keratinocyte-SFM 加 BPE (50 μ g/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBC0, 10724-011)常規培養TKE2細胞，將4 X IO4個細胞接種至60mm培養皿中，分別向各皿中添加不同濃度的CNTF(O、5、10和20ng/ml)，然后于5%C02和37攝氏度的條件下培養，每3天更換新培養基，同時添加上述濃度的CNTF因子，培養6天后利用細胞計數器進行細胞計數，細胞數量統計見圖2。如圖2所示，含10和20ng/ml CNTF培養液培養的TKE2細胞較空白對照培養的TKE2細胞數量增加了 2-2.5倍(*P〈0.01)。由此，證明了添加10_20ng/ml的CNTF能促進TKE2細胞的增殖。
[0027]3.應用 TKE2 細胞的培養液(Keratinocyte-SFM 加 BPE (50 μ g/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBC0, 10724-011)常規培養TKE2細胞，將10個細胞接種至96孔板中，分別向各皿中添加不同濃度的CNTF(O和10ng/ml)，然后于5%C02和37攝氏度的條件下培養，每3天更換新培養基，同時添加上述濃度的CNTF因子，培養9天后固定細胞，通過免疫熒光方法檢測CNTF對TKE2細胞干細胞標記和增殖相關標記(P63，ABCG2, Bmil, ΔΝΡ63, ki67)的影響。如圖3-7所示，培養液中添加10ng/ml的CNTF能有效促進TKE2細胞干細胞標記和增殖相關標記的表達。
[0028]實施例2:外源性添加CNTF對角膜上皮損傷修復的影響
[0029]1.CNTF對正常小鼠角膜上皮損傷修復的影響。
[0030]將12只C57BL/6小鼠(6_8周齡)隨機分為對照組和實驗組，使用3mm環鉆和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm區域內的上皮，同時對照組小鼠右眼結膜下注射7μ IPBS,實驗組小鼠右眼結膜下注射50ng CNTF (溶解于7 μ I PBS)，于建模后0、24、48和72h分別使用熒光素鈉染色及裂隙燈下照相，觀察各組小鼠的上皮損傷修復的情況，代表性裂隙燈觀察照片見圖8。如圖8所示，結膜下注射50ng CNTF能有效促進角膜上皮的損傷修復。
[0031]2.CNTF對STZ誘導的糖尿病小鼠角膜上皮損傷修復的影響[0032]將12只STZ誘導的C57BL/6糖尿病小鼠隨機分為對照組和實驗組，使用3mm環鉆和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm區域內的上皮，同時對照組小鼠右眼結膜下注射7μ I PBS，實驗組小鼠右眼結膜下注射50ng CNTF(溶解于7μ1 PBS)，于建模后0、24、48和72h分別使用熒光素鈉染色及裂隙燈下照相，觀察各組小鼠的上皮損傷修復的情況，代表性裂隙燈觀察照片見圖9。如圖9所示，結膜下注射50ng CNTF能有效促進糖尿病小鼠角膜上皮的損傷修復。
[0033]實施例3:睫狀神經營養因子的改造及效果檢測
[0034]一、為了提高睫狀神經營養因子在治療角膜緣干細胞增殖和促進角膜上皮損傷修復中的效果，對睫狀神經營養因子的氨基酸序列進行了改造，具體改造步驟如下:
[0035]以人CNTF cDNA為模板，通過PCR擴增CNTF全長蛋白序列中第13-180位(CNTF-截短)共168個氨基酸的編碼序列，在引物序列的兩端分別為人工引入的EcoR I和Xho I酶切位點。上下游引物序列分別為:
[0036]AGACACGAATTCCGTCGGGACCTCTGTAGCCG ；
[0037]AGACTCGAGAGAAATGAAACGAAGGTCATGGA。用 EcoRI 和 XhoI 分別雙酶切空載體PGEX-4T-1和PCR擴增產物，將CNTF-截短以正確讀框與pGEX_4T_l載體連接，獲得GST與CNTF-截短融合蛋白表達質粒pGEX-CNTF-截短。獲得的重組表達載體分別應用酶切和測序的方法進行鑒定，結果顯示酶切片段的大小正確，并且測序結果顯示與參考序列完全相符，根據測序結果和讀碼框位置可知，翻譯后的氨基酸序列為SEQ ID N0:2。
[0038]將構建的GST融合蛋白表達質粒轉化到大腸桿菌BL-21中，挑取單克隆菌株接種到3ml LB培養液中，37 °C、250rpm振蕩過夜；再按3%。接種量轉接，37°C培養至菌液A值達到0.6~0.8后，加入IPTG至終濃度為500mol/L,繼續振蕩培養2h ;然后4°C、3000rpm離心30min收集菌體，按40:1的比例加入細菌裂解液重懸菌體，超聲破碎細菌，離心收集上清液；應用 Glutathione Sepharose4B 純化柱(購自 Amersham Biosciences 公司)純化GST-CNTF-截短融合蛋白；將GST-CNTF-截短融合蛋白用Thrombin凝血酶切掉之后，再過一次純化柱，收集穿透液了，然后通過透析和凍干，得到CNTF-截短蛋白，然后使用PBS緩沖液重新溶解為IOOng/ μ I的儲液，凍存于_80°C備用。并檢測改造后的CNTF(CNTF-截短蛋白)在治療角膜緣干細胞增殖和促進角膜上皮損傷修復中的效果。
[0039]二、CNTF-截短蛋白對TKE2細胞的影響
[0040]1.應用 TKE2 細胞的培養液(Keratinocyte-SFM 加 BPE (50 μ g/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBC0, 10724-011)常規培養TKE2細胞，將4X IO4個細胞接種至60mm培養皿中，分別向兩皿中添加CNTF(10ng/ml)和CNTF-截短(10ng/ml)，然后于5%C02和37°C的條件下培養，每3天更換新培養基，同時添加上述濃度的CNTF和CNTF-截短因子，培養6天后利用細胞計數器進行細胞計數，細胞數量統計顯示，含CNTF-截短因子培養液培養的TKE2細胞較含CNTF培養的TKE2細胞數量增加了 1.3倍(？〈0.05)。由此可見，與添加CNTF因子相比，添加CNTF-截短因子能更有效地促進TKE2細胞的增殖。
[0041]2.應用 TKE2 細胞的培養液(Keratinocyte-SFM 加 ΒΡΕ(50 μ g/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBC0, 10724-011)常規培養TKE2細胞，將10個細胞接種至96孔板中，分別向兩皿中添加CNTF (10ng /ml)和CNTF-截短(10ng/ml)，然后于5%C02和37°C的條件下培養，每3天更換新培養基，同時添加上述濃度的CNTF和CNTF-截短因子，培養9天后固定細胞，通過免疫熒光方法檢測和CNTF-截短對TKE2細胞干細胞標記和增殖相關標記(P63，ABCG2，Bmil,ΔΝΡ63, ki67)的影響。結果顯示，培養液中添加10ng/ml的CNTF-截短能更有效地促進TKE2細胞干細胞標記和增殖相關標記的表達。
[0042]三、外源性添加CNTF對角膜上皮損傷修復的影響
[0043]1.CNTF對正常小鼠角膜上皮損傷修復的影響
[0044]將12只C57BL/6小鼠(6_8周齡)隨機分為對照組和實驗組，使用3mm環鉆和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm區域內的上皮，同時對照組小鼠右眼結膜下注射50ng〇見^(溶解于7口1 PBS)，實驗組小鼠右眼結膜下注射50ng CNTF-截短(溶解于7 μ I PBS)，于建模后0、24、48和72h分別使用熒光素鈉染色及裂隙燈下照相，觀察各組小鼠的上皮損傷修復的情況，結果表明結膜下注射50ng CNTF-截短能有效促進角膜上皮的損傷修復。
[0045]2.CNTF對STZ誘導的糖尿病小鼠角膜上皮損傷修復的影響
[0046]將12只STZ誘導的C57BL/6糖尿病小鼠隨機分為對照組和實驗組，使用3mm環鉆和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm區域內的上皮，同時對照組小鼠右眼結膜下注射50ng CNTF (溶解于7 μ I PBS)，實驗組小鼠右眼結膜下注射50ng CNTF-截短(溶解于7 μ IPBS)，于建模后0、24、48和72h分別使用熒光素鈉染色及裂隙燈下照相，觀察各組小鼠的上皮損傷修復的情況，結果表明結膜下注射50ng CNTF-截短能有效促進糖尿病小鼠角膜上皮的損傷修復。
【權利要求】
1.一種睫狀神經營養因子的用途，其特征在于，是在制備在制備治療角膜緣干細胞增殖和促進角膜上皮損傷修復制品中的應用。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述的睫狀神經營養因子，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
3.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述的睫狀神經營養因子的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
4.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述的制品為包含有藥理有效濃度的睫狀神經營養因子的滴眼液或注射液。
5.如權利要求4所述的用途，其特征在于所述的藥理有效濃度為10-100ng/ml。
6.一種治療角膜緣干細胞增殖和促進角膜上皮損傷修復的制品，其特征在于，所述的制品為包含有藥理有 效濃度的睫狀神經營養因子的藥物。
【文檔編號】A61K38/18GK103800894SQ201410075767
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月3日 優先權日:2014年3月3日
【發明者】周慶軍, 陳鵬, 謝立信, 張陽陽, 狄國虎 申請人:山東省眼科研究所