專利名稱：組織工程化角膜上皮移植膜及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組織工程化角膜上皮移植膜、其制備方法和應(yīng)用， 以及一種構(gòu)建組織工程角膜用支架材料。本發(fā)明屬于生物工程和臨床 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
嚴(yán)重的角膜病變和角膜損傷引起的盲性眼疾，居致盲性眼病的首 位。角膜移植手術(shù)雖然治療效果好，成功率高，但供體角膜材料來源 十分匱乏。長(zhǎng)期以來，迫切希望通過在體外再造組織工程化生物角膜， 使組織工程化角膜成為人體角膜移植等效物，最終移植人眼角膜成功 使角膜盲患者視功能得到一定的恢復(fù)并提高他們的生活質(zhì)量。因此， 尋求可用于人體移植的組織工程化角膜，擴(kuò)大供體來源，滿足患者需 求成為迫切需要解決的問題。
在體外構(gòu)建符合人體組織工程學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)的組織工程化 角膜是解決上述問題的一種理想方法。
角膜(cornea)是眼球壁最外層纖維膜的前1 / 6部分，具有透明、 無血管和感覺神經(jīng)豐富的特點(diǎn)。其前凸，表面光滑，質(zhì)地堅(jiān)韌并有彈 性。在組織學(xué)上角膜由外向內(nèi)分為上皮細(xì)胞層、基質(zhì)層和內(nèi)皮細(xì)胞 層。角膜基本結(jié)構(gòu)示意圖可參見圖18。角膜的生理功能有以下幾個(gè)方 面(l)保護(hù)眼球與鞏膜一起構(gòu)成眼球壁最外層，共同保護(hù)眼球。同 時(shí)其神經(jīng)末梢豐富，有敏銳的感覺功能，與眼的保護(hù)有密切關(guān)系。(2) 具有很強(qiáng)的屈光能力是屈光間質(zhì)的主要組成部分，提供70%的屈光 力。(3)透入光線功能角膜本身透明，無色，沒有血管，因此光線通 過角膜可投入眼內(nèi)。目前，體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞和角膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)已基本
成熟(參見Griffth M， Hakim M， Shimmura S， et al. Artificial human corneas: scaffolds for transplantation and host regeneration. Cornea, 2002, 21: 54-61 ;陳家祺，張勝，郭林潔等 應(yīng)用三維培養(yǎng)技術(shù)體外重建角膜的初步研究。中華眼科雜志，2001， 37 : 244-247 ; Reichl S， Bednarz J， Muller-Goymann CC. Human corneal equivalent as cell culture model for in vitro drug permeation studies. Br J Ophthalmol, 2004， 88: 560—565)，對(duì)培
然而，對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞尤其對(duì)靈長(zhǎng)類角膜內(nèi)皮細(xì)胞，特別是對(duì)人角膜 內(nèi)皮細(xì)胞還沒有找到比較有效的體外培養(yǎng)方法。
有些學(xué)者曾報(bào)道在體外成功培養(yǎng)出人角膜內(nèi)皮細(xì)胞并對(duì)其特性進(jìn) 行了分析，1999年Griffith等(Grifft，Osborne R，Manger R. Functinal human corneal equivalents constructed from cell lines. Science, 1999, 286:2169-2172 )通過SV40病毒基因轉(zhuǎn)染使人角膜內(nèi) 皮細(xì)胞永生化，因而獲得體外培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞。 一方面，對(duì)該報(bào)道 中所培養(yǎng)出的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞還有待于進(jìn)一步證實(shí)，同時(shí)，通過轉(zhuǎn)基
因方法獲得的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞不排除具有腫瘤細(xì)胞特性。因此，在體 外培養(yǎng)中要想獲得與體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞具有相周生理功能的人角膜內(nèi)皮細(xì)
胞還需要在今后的研究中加以解決。
為了最終獲得含有完全結(jié)構(gòu)的組織工程化角膜，本發(fā)明人首先成
膜。所述組織工程化角膜上皮移植膜既有良好的組織相容性又有一定 透明屈光間質(zhì)功能，能夠應(yīng)用于板層和深板層角膜移植術(shù)，避免因角 膜上皮缺而引起的基質(zhì)持續(xù)水肺，新生血管侵入，出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)， 最終植片混濁，脫落。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種組織工程化角膜上皮移植膜，其包括人角膜上皮細(xì)胞和組織工程角膜支架材料。
在本發(fā)明中，所述組織工程化角膜上皮移植膜中的人角膜上皮細(xì) 胞可由角膜緣組織塊培養(yǎng)法獲得。
在本發(fā)明中，所述組織工程角膜支架材料的選擇主要取決于所選 材料是否具有與人角腹基質(zhì)具有相似生物學(xué)、物理學(xué)和光學(xué)特性。為 了避免或減少組織工程化角膜移植膜移植后引起的免疫反應(yīng)，所述組 織工程角膜支架材料應(yīng)當(dāng)無抗原性或抗原性較低。
在本發(fā)明中，所述無抗原性或抗原性較低的組織工程角膜支架材 料可以為人源的角膜基質(zhì)或非人源的異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)。在本發(fā)明 中，所述異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)是經(jīng)過酶，例如胰蛋白酶消化處理的異 種角膜基質(zhì)。具體的，經(jīng)過酶例如胰蛋白酶消化處理的角膜基質(zhì)由于 脫除了基質(zhì)細(xì)胞后無抗原性或抗原性較低，同時(shí)保留了角膜基質(zhì)應(yīng)具 備的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。實(shí)際上，用于制備脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的方法業(yè)已為本領(lǐng) 域技術(shù)人員知曉，適于制備本發(fā)明所述組織工程化角膜上皮移植膜的 脫細(xì)胞角膜基質(zhì)也能夠根據(jù)需要商購(gòu)獲得。
本發(fā)明中，用作組織工程角膜支架材料的異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)需
要滿足如下條件
1) 異種角膜基質(zhì)易得；
2) 異種角膜基質(zhì)經(jīng)酶處理脫細(xì)胞后無抗原性；
3) 異種角膜基質(zhì)經(jīng)酶處理脫細(xì)胞后基質(zhì)內(nèi)膠原纖維排列無改變；
4) 異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)經(jīng)甘油處理脫水后角膜基質(zhì)恢復(fù)透明；
5) 異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)在移植異種角膜后組織相容性良好；
6) 在異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)上接種人角膜上皮后，細(xì)胞可貼壁、增殖、 分裂并保持原有的細(xì)胞特性。
在本發(fā)明中，用作組織工程角膜支架材料的所述異種脫細(xì)胞角膜 基質(zhì)包括但不限于豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)和狗脫細(xì)胞角膜基質(zhì)。符合上 述性質(zhì)的其它適宜的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)也能夠用作本發(fā)明所述組織工程 角膜支架材料。
本發(fā)明同時(shí)提供一種構(gòu)建組織工程角膜用支架材料，所述無抗原性組織工程角膜支架材料為脫細(xì)胞角膜基質(zhì)。優(yōu)選的，所述脫細(xì)胞角 膜基質(zhì)細(xì)胞是經(jīng)酶消化處理的豬角膜基質(zhì)細(xì)胞。
本發(fā)明還提供一種所述的組織工程化角膜上皮移植膜在制備用于 治療因角膜病變或角膜損傷引起的盲性眼疾的醫(yī)療材料中的用途。
另一方面，本發(fā)明提供一種制備所述組織工程化角膜上皮移植膜
的方法，包括①取人角膜緣組織利用植塊培養(yǎng)法在體外原代、傳代 培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞；②對(duì)原代、傳代培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞特異性進(jìn) 行鑒定確認(rèn)；③構(gòu)建組織工程角膜支架材料；④將體外培養(yǎng)的人角 膜上皮接種于脫細(xì)胞角膜基質(zhì)載架上共同在體外培養(yǎng)，最終得到構(gòu)建 組織工程化角膜上皮移植膜。
優(yōu)選的，所述制備所述的組織工程化角膜移植膜的方法，可進(jìn)一 步具體包括以下操作步驟①取人角膜緣組織利用植塊培養(yǎng)法在體外 原代，傳代培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞；②對(duì)原代，傳代培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì) 胞特異進(jìn)行鑒定確認(rèn)培養(yǎng)出的細(xì)胞為所需特定細(xì)胞，并對(duì)上述細(xì)胞的 生物學(xué)特性進(jìn)行綜合分析，包括貼壁時(shí)間，生長(zhǎng)曲線，克隆形成力， 增值能力，代謝能力和特異性蛋白表達(dá)等；③對(duì)組織工程角膜支架材 料脫細(xì)胞角膜基質(zhì)進(jìn)行組織相容性和光學(xué)特性檢驗(yàn)；④將體外培養(yǎng) 的人角膜上皮接種于脫細(xì)胞角膜基質(zhì)載架上共同在體外培養(yǎng)，分時(shí)段 觀察細(xì)胞形態(tài)特征和生物學(xué)活性，同時(shí)，觀察種植上皮細(xì)胞和支架材 料之間的相容性，最終構(gòu)建組織工程化角膜上皮移植膜； 在此次研
究中將構(gòu)建的組織工程化角膜上皮移植膜移植動(dòng)物模型分時(shí)段觀察組 織工程化角膜上皮移植膜與植床之間的組織相容性，透明性和支架載 體上細(xì)胞形態(tài)和活性變化以及眼內(nèi)，外生理性，病理性變化； 最終 將構(gòu)建的組織工程化角膜上皮移植膜移植人眼角膜，分階段觀察組織 工程化角膜上皮移植膜與植床之間的組織相容性，透明性和支架載體 上細(xì)胞形態(tài)和活性變化以及眼內(nèi)，外生理性，病理性變化。
在本發(fā)明中，體外培養(yǎng)人角膜上皮細(xì)胞采用如下所述的組織塊培 養(yǎng)法，包括
1)在角膜緣取角膜緣組織塊，并用含有1%青霉素-鏈霉素的
7D-PBS緩沖液(PBS緩沖液(pH7.2~7.4) : NaCl 137mmol/L， KC1 2. 7腿ol/L, Na2HP04 4. 3mmol/L， KH2P04 1.4畫1/L)沖洗；
2) 于dispase II酶消化液(0. 24U/ml)中于4X:下放置過夜，以 使得中性蛋白酶對(duì)細(xì)胞的損傷最小，而對(duì)細(xì)胞基底膜的消化作用最大， 然后以D-PBS緩沖液沖洗；
3) 再用O. 25y。胰蛋白酶-EDTA在371C處理10分鐘，于含10。/4FBS DMEM培養(yǎng)液中中和胰蛋白酶；
4) 待置于培養(yǎng)皿中的經(jīng)上述處理的角膜緣組織塊完全貼壁后，在 含10% FBS DMEM培養(yǎng)液中37X:、 5%二氧化碳培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，培養(yǎng)液隔 日一換。
按照上述方法體外培養(yǎng)人角膜上皮細(xì)胞，可采用本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員知曉的方法，例如經(jīng)角膜上皮特異性抗體K3和干細(xì)胞非特異性抗 體P63的免疫熒光染色，來確證培養(yǎng)細(xì)胞是否為角膜上皮細(xì)胞，同時(shí)具 有一定干細(xì)胞性。
在本發(fā)明中，通過組織工程方法，將所述人角膜上皮細(xì)胞接種到 所述組織工程角膜支架材料上，在組織工程角膜支架材料上培養(yǎng)所述 人角膜上皮細(xì)胞，得到本發(fā)明所述組織工程化角膜上皮移植膜。在本 發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過體外角膜緣組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)出的 人角膜上皮細(xì)胞接種到異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，例如豬異種脫細(xì)胞角膜 基質(zhì)上，在體外共同構(gòu)建組織工程化角膜上皮移植膜。所得體外構(gòu)建 組織工程化角膜上皮移植膜的有效性，可釆用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知 曉的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如，可將體外構(gòu)建角膜上皮移植膜移植活體后， 移植膜在脫水狀態(tài)下保持一定透明度并與周邊角膜愈合良好無滲漏和 明顯的免疫排斥反應(yīng)，說明在該脫細(xì)胞角膜基質(zhì)上接種的人角膜上皮 細(xì)胞存活并保持原有特性。
本發(fā)明提供的組織工程化角膜上皮移植膜移植術(shù)可應(yīng)用于板層或 深板層角膜移植手術(shù)，并且，因無抗原性或抗原性較低術(shù)后可避免免 疫排斥反應(yīng)等多項(xiàng)并發(fā)癥的發(fā)生。由于現(xiàn)有技術(shù)中的以往載體多為羊 膜，膠原膜和親水凝膠膜，這些以往載體因缺乏正常角膜應(yīng)具備的透明性、彈性、韌性和三維結(jié)構(gòu)均不宜做角膜替代物。與以往技術(shù)相比， 本發(fā)明應(yīng)用異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)經(jīng)酶消化處理后不僅消除原抗原性， 而且角膜基質(zhì)組織結(jié)構(gòu)未受破壞，具有彈性，韌性和一定厚度，脫水 狀態(tài)時(shí)呈透明，接種角膜上皮細(xì)胞易在脫細(xì)胞角膜基質(zhì)上增殖、分裂， 同時(shí)保持細(xì)胞原有生物特性。因此，體外構(gòu)建的組織工程化角膜上皮 移植膜完全可應(yīng)用于板層，深板層角膜移植術(shù)。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明
圖l A圖為角膜緣組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞情況。接種培養(yǎng) 皿笫五天發(fā)現(xiàn)角膜上皮細(xì)胞從角膜緣組織塊爬出，細(xì)胞分布較致密， 形態(tài)呈類圓形；B圖為用角膜緣組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)l0天后的角膜上皮細(xì) 胞.細(xì)胞密度較致密形態(tài)圓形或類圓形。
圖2 A圖為在共聚焦顯微鏡下所有細(xì)胞對(duì)角蛋白3呈陽性情況；B 圖為體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞情況。角膜上皮細(xì)胞的特異性抗體為角蛋 白3(Keratin 3，后簡(jiǎn)稱"K3")。用角膜緣組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)角膜上 皮，傳代培養(yǎng)1周時(shí)細(xì)胞對(duì)角蛋白3在共聚焦顯微鏡下呈陽性。
圖3 A圖為在共聚焦顯微鏡下抗P63呈陽性細(xì)胞情況；B圖為體外 培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞情況。角膜上皮干細(xì)胞目前還沒有特異性抗體證明 為角膜上皮干細(xì)胞，但現(xiàn)在可利用間接方法證明其干細(xì)胞性，檢測(cè)P63 是其中有效方法之一。用角膜緣組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)角膜上皮，傳代培 養(yǎng)1周時(shí)部分細(xì)胞對(duì)抗P63在共聚焦顯微鏡下呈陽性。
圖4為用角膜緣組織塊體外培養(yǎng)法培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞情況。傳代
細(xì)胞的污染。A圖為Hochest染色，通過熒光染色可標(biāo)記體外培養(yǎng)細(xì)胞 核呈蘭色，直觀反映培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)；B圖為li蛋白固C5AC免疫染色無綠色 熒光說明體外培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞無杯狀細(xì)胞的污染。
圖5為用角膜緣組織塊體外培養(yǎng)法培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞情況。傳代 培養(yǎng)1周時(shí)用TUNEL染色觀察角膜上皮細(xì)胞凋亡情況。A圖為Hochest染色，通過熒光染色可標(biāo)記體外培養(yǎng)細(xì)胞核呈蘭色，直觀反映培養(yǎng)細(xì)
胞數(shù)；B圖為TUNEL染色無綠色熒光說明體外培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞無明 顯細(xì)胞凋亡。
圖6為用角膜緣組織塊體外培養(yǎng)法培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞情況。波形蛋 白作為非特異性骨架蛋白存在于多種細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。傳代培養(yǎng)1周時(shí)用波
形蛋白特異性抗體熒光染色角膜上皮內(nèi)波形蛋白。A圖為Hochest染色， 通過熒光染色細(xì)胞核直觀反映體外培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)；B圖為大部分角膜上皮 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)波形蛋白染色陽性。
圖7為用角膜緣組織塊體外培養(yǎng)法培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞，傳代培養(yǎng) l周時(shí)用BrdU染色觀察角膜上皮細(xì)胞增殖、分裂情況。A圖為Hochest 染色，通過熒光染色表示體外培養(yǎng)所有細(xì)胞核直觀反映培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)；B 圖為BrdU染色陽性呈綠熒光。約占培養(yǎng)細(xì)胞的30-40%，表明角膜上皮 細(xì)胞分裂，增殖較旺盛。
圖8為體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果從上至下依 次為陰性對(duì)照，K3，P63, MUC5AC。
圖9為體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞接種羊膜上在體外共培養(yǎng)4周時(shí)的情 況，角膜上皮細(xì)胞分層至5-7層，表層呈扁平細(xì)胞，中間層呈翼狀，基 底呈柱狀。圖A為PAS染色呈陰性說明無杯狀細(xì)胞污染；圖B為HE染 色7見察細(xì)月包形態(tài)。
圖IO為體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞接種豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)后體外共 培養(yǎng)2周情況。如圖B， C， D所示，角膜上皮細(xì)胞特異性抗體K3在免疫 熒光染色中表達(dá)陽性。圖A為非特異性染色。
圖11為體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞接種豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)后體外共 培養(yǎng)2周HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)和分層情況。角膜上皮細(xì)胞形成單層或 雙層。細(xì)胞形態(tài)與正常角膜上皮相似。
圖12為體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞接種豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)后體外共 培養(yǎng)4周用透射電鏡觀察連接復(fù)合體的形成情況。培養(yǎng)前2周(圖A， B) 細(xì)胞與基質(zhì)之間未形成連接復(fù)合體培養(yǎng)笫3， 4周兩者之間形成初級(jí)連 接復(fù)合體。圖13為體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞接種豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)上在體外 共培養(yǎng)2周后的掃描電鏡圖。體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞不僅很好地貼壁于 豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)上而且上皮細(xì)胞增殖，分裂旺盛，在5000倍中可見 微絨毛。
圖14圖A、 B為豬角膜基質(zhì)脫細(xì)胞后無菌包裝；圖C為甘油脫水 之前的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)呈灰白，水腫，不透明；圖D為甘油脫水后脫細(xì) 胞角膜基質(zhì)變透明；圖E為培養(yǎng)對(duì)照透明角膜透明度；圖F為浸水中1 后脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，角膜透明度明顯下降。
圖15為豬角膜基質(zhì)經(jīng)酶處理后掃描電鏡觀察脫細(xì)胞角膜基質(zhì)。可 觀察到角膜膠原纖維排列整齊，板層結(jié)構(gòu)完整，同時(shí)未見細(xì)胞.脫細(xì) 胞角膜基質(zhì)基本保持角膜原有的結(jié)構(gòu)。
圖16為堿燒傷兔角膜模型。
圖17為體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞接種豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)-體外構(gòu)建 組織工程化角膜上皮移植膜移植兔模型眼后仍保持透明。 圖18為角膜的基本結(jié)構(gòu)示意圖。
圖19為體外傳代培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞12天內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 圖20為體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞傳代后單克隆培養(yǎng)狀態(tài)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但這些實(shí)施例僅限于 說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法， 如無特別說明，均為常規(guī)條件，或者按照廠商所建議的條件。同時(shí)， 下述實(shí)施例中所述的百分含量，如無特別說明，則均為重量百分含量。
實(shí)施例 一 、人角膜上皮細(xì)胞的角膜緣組織體外培養(yǎng) 1.角膜緣組織塊體外原代，傳代培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞
原代培養(yǎng)以10%碘伏消毒人的結(jié)膜嚢及眼表，2%利多卡因作球 后麻醉，用白內(nèi)障超聲乳化切口刀(Alcon， U. S.A.)在人角膜緣取大 小約2. 0咖X2. 0咖厚度約200 //m的角膜緣組織塊，用含有1%青霉素-鏈霉素的D-PBS緩沖液沖洗3次，然后放置1.2 U/m￡ dispase II消化 液中在4"C冰箱中過夜，取出后D-PBS緩沖液沖洗3次，再用O. 25%胰蛋 白酶-EDTA在371C處理10分鐘，含10y。FBS DMEM培養(yǎng)液中和胰蛋白酶。 角膜緣組織塊放置60mm培養(yǎng)皿中在超凈臺(tái)內(nèi)室溫下自然干燥，貼壁， 時(shí)間約需U分鐘，待角膜緣組織塊完全貼壁后加含10% FBS DMEM培養(yǎng) 液適量，在37。C 5%二氧化碳培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。培養(yǎng)液隔日一換。培養(yǎng)第 3天起可發(fā)現(xiàn)從角膜緣組織塊中有細(xì)胞向外分化，培養(yǎng)10天時(shí)人角膜緣 上皮細(xì)胞細(xì)胞充滿培養(yǎng)皿底部。
傳代培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞充滿培養(yǎng)皿底部時(shí)清除匿EM培養(yǎng)液，再用含 有1%青霉素-鏈霉素的D-PBS緩沖液沖洗3次，加O. 25%胰蛋白酶 -EDTA在37。C處理10分鐘，用含10。/。FBS DMEM培養(yǎng)液中和胰酶。 1200rpm，5分鐘離心吸出上清液，加10。/。FBS DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸 浮液，以5X107mm2細(xì)胞數(shù)接種培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液隔日 一換。
2.培養(yǎng)角膜上皮特異性和干細(xì)胞性鑒定
體外培養(yǎng)傳代角膜上皮用常規(guī)免疫熒光染色方法染色角膜上皮特 異性抗體K3和干細(xì)胞非特異性抗體P63。具體方法如下 染色角膜上皮特異性抗體K3:
4%多聚甲醛固定，4"C， 30分鐘，或者-20。C無水乙醇固定，IO分 鐘，PBS浸洗3次，每5分鐘，-20X:甲醇處理細(xì)胞10分鐘，以增加 膜通透性，PBS浸洗3次，每次5分鐘，37C用羊血清封閉1小時(shí)， 加一抗(keratin 3) 4。C孵育過夜，或者37"C 2小時(shí)，PBS浸洗3次， 每次5分鐘，滴加熒光素標(biāo)記的二抗[抗小鼠的二抗
(ant卜Mouse/Murine Ig) , 1:200], 37。C避光孵育1-2小時(shí)，PBS 浸洗3次，每次5分鐘，封片觀察，若標(biāo)記細(xì)胞核加Hochest染色
(Hochest是一種嗜DNA的熒光染料，它與DNA發(fā)生特異性結(jié)合后， 在熒光顯微鏡發(fā)綠熒光，可清楚地顯示核的形態(tài)、大小及核質(zhì)的密度； 具體方法可參見常規(guī)細(xì)胞生物學(xué)教材中的實(shí)驗(yàn)操作)。
Hochest是一種已知的嗜DNA的熒光染料，它可清楚地顯示核的 形態(tài)、大小及核質(zhì)密度，可以用來反應(yīng)凋亡時(shí)胞核的變化)；二抗后PBS洗1次5分鐘，加Hochest室溫處理15分鐘(1: 1000-1: 500 )， PBS浸洗3次，每次5分鐘后封片。 染色干細(xì)胞非特異性抗體P63:
"多聚甲醛固定，4X:， 30分鐘，或者-2or無水乙醇固定，IO分 鐘，PBS浸洗3次，每5分鐘，-2010曱醇處理細(xì)胞10分鐘，以增加 膜通透性，PBS浸洗3次，每次5分鐘，37C用羊血清封閉1小時(shí)， 加一抗(P63) 4t:孵育過夜，或者37X: 2小時(shí)，PBS浸洗3次，每次 5分鐘，滴加熒光素標(biāo)記的二抗[抗小鼠的二抗(anti-Mouse/Murine Ig) , 1:200], 37。C避光孵育1-2小時(shí)，PBS浸洗3次，每次5分鐘， 封片觀察，若標(biāo)記細(xì)胞核加Hochest染色。
Hochest是一種已知的嗜DNA的熒光染料，它可清楚地顯示核的 形態(tài)、大小及核質(zhì)密度，可以用來反應(yīng)凋亡時(shí)胞核的變化)；二抗后 PBS洗1次5分鐘，加Hochest室溫處理15分鐘(1: 1000-1: 500 )， PBS浸洗3次，每次5分鐘后封片。
如圖2、 3所示，結(jié)果為陽性，證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為角膜上皮細(xì)胞同時(shí)
具有一定千細(xì)胞性。
3. 細(xì)胞貼壁率，生長(zhǎng)曲線: 體外傳代培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞以5X10Vmm2細(xì)胞數(shù)接培養(yǎng)皿后，每24
小時(shí)用O. 25%胰蛋白酶-EDTA消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)可得 出角膜上皮細(xì)胞24小時(shí)貼壁率和12天內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。經(jīng)檢測(cè)，角膜 上皮細(xì)胞24小時(shí)貼壁率為(74.89 ±15. 72) %，生長(zhǎng)曲線參見圖19。
4. 單克隆形成
體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞傳代后以100和300細(xì)胞數(shù)接種培養(yǎng)皿，連 續(xù)培養(yǎng)7天后去除培養(yǎng)液，D-PBS緩沖液沖洗3次，10°/。多聚甲醛固定16 小時(shí)在4匸水箱內(nèi)，然后用2。/。Rhodaminblue (MERCK, Germany)和2°/0 Nile blue (MERCK, Germany)以1: l比例混合后在4匸冰箱內(nèi)染色30 分鐘，D-PBS緩沖液再?zèng)_洗3次，常溫下干燥l小時(shí)。計(jì)數(shù)克隆。經(jīng)檢測(cè)， 克隆計(jì)數(shù)值為(15.17±3.25) %。克隆生長(zhǎng)狀態(tài)參見圖20。 6.結(jié)膜杯狀細(xì)胞鑒定體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞傳代后以5X107mm2細(xì)胞數(shù)接種細(xì)胞載玻 片后培養(yǎng)7天。如圖4、 8所示，用結(jié)膜杯狀細(xì)胞特異性勦蛋白MUC5AC 進(jìn)行免疫熒光染色(方法同上)，結(jié)果為陰性。
7.用BrdU染色觀察細(xì)胞增殖，分裂情況
體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞傳代后以5X107mm2細(xì)胞數(shù)接種細(xì)胞栽玻 片后培養(yǎng)7天。用BrdU ( 5-溴2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo 2-deoxyuridine，BrdU)是DNA前體胸腺嘧啶核苷的類似物，能選擇性 的摻入到處于細(xì)胞周期S期(即DNA合成期)細(xì)胞的單鏈DM核苷酸序 列中，在活體引用合成DNA的可示蹤的前體物質(zhì)BrdU，使增殖期細(xì)胞 可竟?fàn)幮缘奶娲叵汆奏ざ鴵饺?進(jìn)行免疫熒光染色，具體方法如下 -20t:預(yù)冷的甲醇處理標(biāo)本4'C, IO分鐘(若沒有時(shí)間在此步驟之后可 以風(fēng)干將標(biāo)本置于-20C保存即可，下次染色前PBS水化3-55分鐘即 可),PBS浸洗3次，每次5分鐘；2N HC11次，60分鐘；37X: ， 0. lmolPBS， pH8. 5， 2次，每次10分鐘；PBS 3次，每次5分鐘；0. 1%BSA (牛血 清白蛋白)(或者PBS配)溶6 nig/ml抗體(keratin 3， 1: IOO-I: 200 ) 60分鐘-120分鐘室溫，PBS處理3次，每次5分鐘，滴加熒光素標(biāo) i己的二抗[抗小鼠的二抗(ant卜Mouse/Murine Ig) , 1:200], 37*C 避光孵育1-2小時(shí)，PBS浸洗3次，每次5分鐘，封片觀察，若標(biāo)記 細(xì)胞核加Hochest; 二抗后PBS洗1次，5分鐘；加Hochest室溫處 理15分鐘(1: 1000-1:500 ) , PBS浸洗3次，每次5分鐘后封片。結(jié) 果如圖7所示。
8.用TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡情況
體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞傳代后以5X107mm2細(xì)胞數(shù)接種細(xì)胞載玻 片后培養(yǎng)7天。用原位末端標(biāo)記法(TUNEL法)(基因組DM斷裂時(shí)， 暴露的 3，-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上焚光素(FITC)標(biāo) 記的dUTP(熒光-dUTP)，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行 檢測(cè)，這就是原位末端標(biāo)記(TUNEL)法(具體方法可參見常規(guī)細(xì)胞生 物學(xué)教材中的實(shí)驗(yàn)操作)進(jìn)行免疫熒光染色，具體方法如下組織切片41C， 4%PFA(PFA是四氟乙烯和全氟烴基乙烯醚的共聚物)固定 30分。室溫處理，PBS洗3次，每次5分鐘。-20^:預(yù)冷的甲醇處理切 片15分鐘，4°C，以增加細(xì)胞膜的通透性(注意此時(shí)多觀察，防止甲 醇蒸發(fā)千，此間需要添加曱醇)。室溫處理、PBS洗3次，每次5分 鐘。除去液體，用平衡液緩沖覆蓋組織，室溫處理、IO分鐘。 平衡時(shí)，在冰上解凍核苷復(fù)合物，為所有實(shí)驗(yàn)反應(yīng)片制定充分的室溫 處理dT反應(yīng)復(fù)合物。繼續(xù)置于冰上，每玻片加5(mi (具體用量視標(biāo) 本大小而定)反應(yīng)液完全覆蓋細(xì)胞；(平衡緩沖液核苷復(fù)合物室 溫處理dT-45: 5: 1)[陰性對(duì)照片為省略室溫處理dT的對(duì)照孵育液， 平衡緩沖液核苷復(fù)合物dH20- 45: 5: l]加50 W室溫處理dT反 應(yīng)復(fù)合物在玻片上，將塑料蓋玻片蓋在細(xì)胞片上防止液體蒸發(fā)及確保 試劑分布均衡(也可以不覆蓋，覆蓋后容易脫片)。37n孵育60分鐘， 以使末端充分反應(yīng)(避光)。用去離子水1: IO稀釋20XSSC20XSSC 成分及濃度配制1L溶液各成分的用量300mmol/L檸檬酸三鈉(二 水)；3mol/L氯化鈉；水88. 2g; 175. 3g;補(bǔ)足1L 。溶解檸檬酸 三鈉(二水)和氯化鈉于約0. 9L水中，加幾滴10N Na0H溶液調(diào)pH 為7.0，用水補(bǔ)足體積至1L。，室溫下將玻片浸入2XSSC液15分 鐘，終止反應(yīng)。室溫處理下，PBS洗3次，每次5分鐘，去除未結(jié)合 的熒光-12-dUTP。封存，觀察。若同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞核加Hochest;終止 反應(yīng)后PBS洗1次，5分鐘，加Hochest于室溫處理15分鐘 (1: 1000-1: 500 ) PBS浸洗3次，每次5分鐘后封片。結(jié)果如圖5所 示。
實(shí)施例二、 組織工程化角膜支架材料 1.栽體選擇
在構(gòu)建組織工程化角膜上皮移植膜時(shí)其載體目前有多種，其中以 羊膜，膠原膜和親水凝膠膜選用者較多，但這些膜都有一個(gè)共同的缺 點(diǎn)，即缺少一定的厚度抗張性，抗壓性和屈光性。因此，其應(yīng)用受到 限制。異種脫細(xì)胞基質(zhì)尤其是豬脫細(xì)胞基質(zhì)容易得到而且經(jīng)酶消化豬角膜基質(zhì)細(xì)胞后無抗原性同時(shí)有角膜應(yīng)具備的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。
2.豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)制備
如圖14所示，新鮮豬眼球在O. 125%氯霉素液中浸泡1小時(shí)，75% 乙醇浸泡O. 15小時(shí)，刀片刮除上皮，沿角膜緣剪取角膜，經(jīng)O. 125% 胰蛋白酶37'C消化30分鐘，PBS液振洗2遍，浸于iy。TritonX2100的 離心管內(nèi)(或不經(jīng)酶消化直接進(jìn)入此步驟)，4'C振蕩72小時(shí)。PBS反 復(fù)振洗，用含有1%青霉素-鏈霉素的D-PBS緩沖液沖無菌密封包裝。
實(shí)施例三、體外構(gòu)建組織工程化角膜上皮移植膜的制備
1. 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的準(zhǔn)備
將實(shí)施例2中已經(jīng)制備好的角膜基質(zhì)浸泡胎牛血清24小時(shí)后置 DMEM培養(yǎng)液以備用。
2. 體外傳代培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞用O. 25%胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞 懸浮液。
3. 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)原上皮面朝上放置培養(yǎng)皿內(nèi)自然干燥數(shù)分 鐘，待基質(zhì)略呈脫水狀，將制備好的角膜上皮細(xì)胞懸浮液以細(xì)胞數(shù) 5X107mm2接種在脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)上在超凈臺(tái)內(nèi)待細(xì)胞貼壁，期間 不斷滴培養(yǎng)液以免細(xì)胞過度干燥。待貼壁完成后加少量胎牛血清置于 37匸，5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，24小時(shí)后加適量培養(yǎng)液繼續(xù) 體外共培養(yǎng)2周。
4. 如圖13所示，脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)和角膜上皮細(xì)胞體外共培養(yǎng)2 周后通過HE染色，免疫熒光染色和掃描電鏡可觀察到角膜上皮較好地 貼附在基質(zhì)載體上，而且表達(dá)K3陽性，細(xì)胞形態(tài)與正常角膜上皮形態(tài) 相似。
5. 形態(tài)觀察
體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞傳代后以5X107mi^細(xì)胞數(shù)接種羊膜上和脫 細(xì)胞角膜基質(zhì)上體外共培養(yǎng)4周用HE (蘇木精和伊紅)染色[蘇木素與 伊紅對(duì)比染色法(簡(jiǎn)稱HE對(duì)染法)是組織切片最常用的染色方法。這 種方法適用范圍廣泛，對(duì)組織細(xì)胞的各種成分都可著色，便于全面觀察組織構(gòu)造，而且適用于各種固定液固定的材料，染色后不易褪色可
長(zhǎng)期保存，經(jīng)過H.E.染色，細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)被伊 紅染色呈粉紅色。具體可參見常規(guī)細(xì)胞生物學(xué)教材中的實(shí)驗(yàn)操作]，投 射，掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和連接復(fù)合體的形成。HE(蘇木精和伊紅) 染色，投射，掃描電鏡按常規(guī)方法制作標(biāo)本觀察，結(jié)果如圖9、 10、 11 所示。
實(shí)施例四、對(duì)體外構(gòu)建組織工程化角膜上皮移植膜的有效性的評(píng)價(jià) 組織工程化角膜上皮移植膜應(yīng)用到堿燒傷兔角膜模型 有效性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)具體操作步驟包括
-構(gòu)建三維立體組織工程化角膜上皮移植膜
組織塊法原代培養(yǎng)兔角膜緣上皮細(xì)胞
取板層角膜緣組織并剪成大小2. 0 x 2. 0 mm，厚約200um的組織 塊，在37t:， 5% C02孵箱中用1.2 U/ml Dispase 1I處理30分，每六孔 板內(nèi)置三塊兒角膜緣組織塊，每組織塊上皮面朝上，透明角膜側(cè)朝中 央，間隔2mm并平置于3T3成纖維滋養(yǎng)層細(xì)胞上。待組織塊貼附培養(yǎng)皿 底部后加培養(yǎng)液。置37。C， 5% C02孵箱中培養(yǎng)，每2天換液一次。
角膜緣上皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)
兔角膜緣上皮細(xì)胞經(jīng)原代培養(yǎng)后，制成單細(xì)胞懸浮液，以4xioV cm2細(xì)胞數(shù)直接接種脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)進(jìn)行共培養(yǎng)。 豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備
取下新鮮豬眼球后剔出眼球周邊組織和筋膜用1。/。雙抗PBS反復(fù)沖 洗眼球多次后沿角膜緣透明角膜側(cè)取角膜組織5%多聚甲醛固定16小 時(shí)，1。/。雙抗PBS中浸泡2小時(shí)，加O. 25%胰蛋白酶在37匸孵箱內(nèi)消化30 分鐘，l^雙抗PBS沖洗3次共15分鐘，將角膜組織置入iy。曲拉酮(Triton X-IOO)內(nèi)在4X:冰箱中震蕩72小時(shí)，ly。雙抗PBS浸洗3次共15分鐘后無 菌包裝后留用。
1.構(gòu)建組織工程化角膜上皮膜
取以備好的無菌豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)放入D-PBS內(nèi)浸泡24小時(shí)，后用D-PBS浸洗3次共5分鐘。然后，將豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)上皮面朝上放置
6孔板培養(yǎng)皿中待用.用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)兔角膜上皮細(xì)胞細(xì)胞充滿培
養(yǎng)皿底部時(shí)清除培養(yǎng)液加D-PBS沖洗2次，加O. 25%胰蛋白酶
/0. 02y。EDTA適量在37匸，5% 0)2孵箱中處理3分，1200rpm， 20°C離心5
分鐘，制成單細(xì)胞懸浮液以5xlOVcnh密度接種在無菌豬脫細(xì)胞角膜基
質(zhì)上皮面，待細(xì)胞貼壁后加10% DMEM/F12培養(yǎng)液進(jìn)行共培養(yǎng).培養(yǎng)至第
4周終止培養(yǎng)進(jìn)行。
-移植兔角膜模型
兔角膜用O. 1N NaOH燒10秒，用生理鹽水反復(fù)沖洗。每天涂抗生 素眼骨一次，觀察4周。4周后發(fā)現(xiàn)角膜混濁，透明度下降，新生血管 侵入。
-觀察移植片與植床之間愈合情況，具體可參照以下指標(biāo) -有無滲漏，溶解
熒光素染色角膜上皮后通過裂隙燈顯微鏡檢查。 -中央光學(xué)區(qū)透明度的變化
通過裂隙燈顯微鏡觀察角膜厚度變化和后方虹膜紋理清晰程度進(jìn) 行分析。具體如下
I級(jí)清晰見虹膜紋理
II級(jí)后方虹膜紋理可見，但模糊。
III級(jí)后方虹膜紋理不清，但瞳孔可辨。
IV級(jí)后方虹膜紋理及瞳孔均不不見。
-形態(tài)變化通過光鏡和電鏡觀察
將移植的角膜上皮移植膜和受體眼角膜制成切片后行蘇木精-伊紅染色和掃描電鏡觀察。具體如下 蘇木精-伊紅染色
將組織工程化角膜上皮膜置于10%多聚曱醛中固定，酒精梯度脫水 從50%, 60%， 70%, 80%, 90 0/。， 95%至100%。用25%、 50。/。、 70%、 90%二甲苯一無水酒精透化使酒精完全脫除。將組織工程化角膜 上皮膜放入6 01C溫箱中，取熔點(diǎn)52-56C的純凈石蠟液中進(jìn)行浸蠟， 換蠟2-3次。將熔蠟及脫細(xì)胞角膜組織趁熱倒入預(yù)制小紙盒中，讓蠟 漸漸冷凝，移浮于水面，至完全凝固。剝離紙盒，切取角膜組織蠟塊， 于旋轉(zhuǎn)切片機(jī)上切成連續(xù)蠟帶8- 15jtm厚。玻片上涂一薄層粘貼劑， 加1滴水，切取蠟帶材料烘千。脫細(xì)胞角膜切片在二甲苯中脫蠟5~10 分鐘，入100%、 95%、 85%、 70%酒精，各級(jí)為2~5分鐘。最后經(jīng)蒸 餾水轉(zhuǎn)入染液蘇木精染液染色5分鐘，水洗玻片上多余染液。鏡檢控制， 直至細(xì)胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止，約數(shù)10秒鐘，流水沖洗15分鐘， 0. 5%伊紅染液染色1分鐘，依次經(jīng)70%、 85%、 95%、 100%酒精脫水， 各級(jí)為2~3分鐘，在95%以下濃度的酒精中伊紅易脫色，應(yīng)適當(dāng)縮短 時(shí)間。二甲苯透明(二次)，共約10分鐘。封片擦去切片周圍多余二 甲苯，迅速滴加適量中性樹膠，再加蓋玻片封固。 掃描電鏡
將組織工程化角膜上皮移植膜置入2. 5%戊二醛磷酸緩沖液中固 定，然后用蔗糖沖洗液沖洗2小時(shí)，共3次，過夜后使用1°/。四氧化鋨緩 沖液后固定1~2小時(shí)。乙醇梯度脫水后，用無水乙醇和環(huán)氧樹脂的混 合劑浸透l小時(shí)，用純環(huán)氧樹脂浸透，室溫下過夜。次日升溫至60X:聚 合固化，48小時(shí)后取出組織工程化角膜上皮膜制作厚約20nm的超薄切 片，應(yīng)用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行雙染色后置于銅網(wǎng)在不同倍數(shù)的 掃描電鏡(JEM-1200EX， Japan)下觀察組織工程化角膜上皮膜結(jié)構(gòu)。
-組織工程化角膜上皮移植膜的細(xì)胞生物學(xué)特性變化 細(xì)胞分裂，增殖活性-BrdU染色
傳代兔角膜緣上皮細(xì)胞接種脫細(xì)胞豬角膜面共培養(yǎng)4周時(shí)加1. OmM BrdU稀釋液24小時(shí)后用-20t:預(yù)冷的甲醇在4iC處理標(biāo)本10分鐘，PBS 浸洗3次每次5分鐘，2N HC1 37匸處理60分鐘，PBS浸洗各2次每次 IO分鐘，3次每次5分鐘，0. 1。/。抗BrdU抗體6pg/ml， ( 1:100-1:200 ) 常溫下反應(yīng)120分鐘后PBS浸洗3次每次5分鐘，滴加熒光素標(biāo)記的二抗(1: 200 ) ， 37t:避光孵育1-2小時(shí)PBS浸洗3次后封片觀察。標(biāo)記細(xì)胞 核加Hochest。
細(xì)胞凋亡-TUNEL檢測(cè)
傳代兔角膜緣上皮細(xì)胞接種脫細(xì)胞豬角膜面共培養(yǎng)4周，4 % PFA固 定30分鐘，在常溫下PBS浸洗3次每次5分鐘。用在-20。C預(yù)冷的甲醇在 4。C中處理細(xì)胞15分鐘，以增加細(xì)胞膜的通透性，常溫下PBS浸洗3次每 次5分。除去液體，在常溫下用100jal平衡液緩沖覆蓋組織10分鐘。平 衡時(shí)，在冰上解凍核苷復(fù)合物，為所有實(shí)驗(yàn)反應(yīng)片制定充分的rTdT反 應(yīng)復(fù)合物。繼續(xù)置于冰上，每玻片加5(V1 (具體用量視標(biāo)本大小而定) 反應(yīng)液完全覆蓋細(xì)胞；(平衡緩沖液核苷復(fù)合物rTdT=45: 5: 1) 加50 jil rTdT反應(yīng)復(fù)合物在玻片上，將塑料蓋玻片蓋在細(xì)胞片上防止 液體蒸發(fā)及確保試劑分布均衡。37。C孵育60分鐘，以使末端充分反應(yīng) (避光)。用去離子水l: 10稀釋20XSSC，室溫下將玻片浸入2XSSC 液15分鐘，終止反應(yīng)。常溫下PBS浸洗3次共15分鐘，去除未結(jié)合的熒 光-12-dUTP。封存，觀察。若同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞核加Hochest。 -眼內(nèi)炎性反應(yīng)
通過裂隙燈檢查前房?jī)?nèi)房閃，角膜后沉積物及前房積膿或玻璃體 混濁情況。
-視網(wǎng)膜及視盤功能變化
通過眼底照相和光學(xué)斷層顯像技術(shù)評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜神經(jīng)層的厚度和杯 盤比的變化。
根據(jù)實(shí)施例四，使用豬脫角膜基質(zhì)與受體角膜植床之間的愈合及 生物相容性實(shí)驗(yàn)的具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖16、 17所示，將脫細(xì)胞豬角膜基 質(zhì)經(jīng)無菌處理后用8. Omm環(huán)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)取同時(shí)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔角膜上轉(zhuǎn)取 7. 5mm的角膜板層組織后將脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)移植到受體兔角膜上 IO-O縫線間斷縫合(將供體脫細(xì)胞角膜基質(zhì)和受體角膜緊密連接，起 密閉作用)觀察4周。術(shù)眼以抗生素眼藥點(diǎn)眼。每周觀察術(shù)眼。第l天 眼球睫狀充血，角膜水腫，半透明，l周后充血漸退；2周植片變薄，4周植片與植床相融合切口對(duì)合良好，前房形成，無滲漏。同時(shí)，未發(fā) 現(xiàn)供體脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)溶解。
上述結(jié)果顯示將體外構(gòu)建的組織工程化角膜上皮移植膜移植到 堿燒傷兔角膜模型活體后，該組織工程化角膜上皮移植膜在脫水狀態(tài) 下保持一定透明度并與周邊角膜愈合良好無滲漏和明顯的免疫排斥反 應(yīng)。脫細(xì)胞角膜基質(zhì)上接種的角膜上皮細(xì)胞存活并保持原有特性。
權(quán)利要求
1、一種組織工程化角膜上皮移植膜，其包括人角膜上皮細(xì)胞和組織工程角膜支架材料。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化角膜上皮移植膜，其中所述 組織工程角膜支架材料為無抗原性或抗原性較低的人源或非人源脫細(xì) 胞角膜基質(zhì)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組織工程化角膜上皮移植膜，其中所述 脫細(xì)胞角膜基質(zhì)是豬脫細(xì)胞角膜基質(zhì)或狗脫細(xì)胞角膜基質(zhì)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化角膜上皮移植膜，其中所述 人角膜上皮細(xì)胞是由角膜緣組織塊培養(yǎng)法獲得的。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化角膜上皮移植膜，其是通過 組織工程方法，將所述人角膜上皮細(xì)胞接種到所述組織工程角膜支架 材料上，在組織工程角膜支架材料上培養(yǎng)所述人角膜上皮細(xì)胞得到的。
6、 制備權(quán)利要求1所述的組織工程化角膜上皮移植膜的方法，包括1) 取人角膜緣組織利用植塊培養(yǎng)法在體外原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)人 角膜上皮細(xì)胞；2) 選擇具有角膜上皮細(xì)胞特異性的原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)人角膜上 皮細(xì)胞；3) 構(gòu)建組織工程角膜支架材料；和4) 將步驟l)和2)所得體外培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞種接種于步驟 3)所得組織工程角膜支架上，共同在體外培養(yǎng)，最終得到組織工程化 角膜上皮移植膜。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中在體外培養(yǎng)人角膜上皮細(xì)胞的 方法包括1) 在角膜緣取角膜緣組織塊，并用含有1°/。青霉素-鏈霉素的D-PBS 緩沖液沖洗;2) 于中性蛋白酶，優(yōu)選dispase II消化液中4'C下放置過夜，然 后D-PBS緩沖液沖洗；3 )再用0. 25%胰蛋白酶-EDTA在37。C處理10分鐘，于含10。/。FBS DMEM 培養(yǎng)液中中和胰酶；4)待置于培養(yǎng)皿中的經(jīng)上述處理的角膜緣組織塊完全貼壁后，在 含10% FBS DMEM培養(yǎng)液中37X:5M二氧化碳培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中步驟3)所述組織工程角膜
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述脫細(xì)胞角膜基質(zhì)是豬脫 細(xì)胞角膜基質(zhì)或狗脫細(xì)胞角膜基質(zhì)。
10、 權(quán)利要求1所述的組織工程化角膜上皮移植膜在制備用于治療 因角膜病變或角膜損傷引起的盲性眼疾的醫(yī)療材料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種組織工程化角膜上皮移植膜、其制備方法與應(yīng)用。其目的是提供一種組織工程化角膜移植膜，所述組織工程化角膜移植膜包括人角膜上皮細(xì)胞和無抗原性組織工程角膜支架材料，所述人角膜上皮細(xì)胞和無抗原性組織工程角膜支架材料通過組織工程法整合在一起。本發(fā)明同時(shí)還提供一種制備所述的組織工程化角膜移植膜的方法，以及所述的組織工程化角膜移植膜在制備用于治療因角膜病變或角膜損傷引起的盲性眼疾的醫(yī)療材料中的用途。
文檔編號(hào)A61L27/38GK101306207SQ20071012913
公開日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2007年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月14日
發(fā)明者薇 王, 許永根 申請(qǐng)人:北京大學(xué)第三醫(yī)院