一種用于弓形蟲感染預防的疫苗和制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明首先提供一種用于弓形蟲感染預防的核苷酸序列，其含有選自以下的核苷酸序列：1）序列表中SEQIDNo.1中所示的核苷酸序列；2）與1）中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列；3）對上述1）或2）所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾，并具有弓形蟲感染預防功能的核苷酸序列。本發明還提供一種疫苗，其包括上述的核苷酸序列，以及醫學上可接受的載體。本發明的質粒DNA疫苗pVAX-ROP7可有效地預防和控制弓形蟲動物模型（昆明鼠）的感染，即可有效的延長小鼠的存活時間，減少腦包囊的荷蟲量。因此，質粒pVAX-ROP7能作為DNA疫苗候選抗原抗弓形蟲的感染。
【專利說明】一種用于弓形蟲感染預防的疫苗和制備方法及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于免疫學和分子生物學領域，具體地，涉及一種用于弓形蟲感染預防的 疫苗。

【背景技術】
[0002] 剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii)是寄生于人和多種動物的專性細胞內原蟲，宿 主種類十分廣泛，包括哺乳類、鳥類、爬行類、魚類及人類，能引起人獸共患的弓形蟲病。弓 形蟲感染能導致孕婦流產，畸胎或死產等嚴重后果；對于免疫抑制或免疫缺陷病人的危害 更為嚴重，弓形蟲病是其常見的致死病因之一。弓形蟲作為一種機會感染因子，可在免疫抑 制或免疫缺陷患者中（如艾滋病患者、器官移植及惡性腫瘤患者等）引起嚴重的器官損害。 除此之外，由弓形蟲引起的畜禽疾病給畜牧業也造成了巨大的經濟損失。
[0003] 長期以來人們一直在尋求治療弓形蟲病的理想藥物，但結果未能如愿，因此研制 有效的弓形蟲疫苗來預防人和動物的弓形蟲病是最理想的選擇之一。對弓形蟲疫苗的研 究經歷了全蟲疫苗、蟲體特異組分疫苗、基因工程疫苗以及DNA疫苗。DNA疫苗又以其獨特 的優勢成為當今研究的熱點，如：安全，無感染病原的危險；表達的蛋白抗原以天然構型出 現，能刺激機體產生全身性免疫應答，尤其是特異性的細胞免疫反應；易與其它疫苗聯合使 用，以增強免疫效果；可產生持久免疫力，減少免疫次數；無需重組抗原的表達和純化，制 備簡單，成本較低，易于大規模生產，具有較好的開發應用前景。雖然目前已有眾多的疫苗 候選分子本揭示，但是均沒有達到完全的免疫保護效果，因此找到更多更好的來源于不同 弓形蟲階段的DNA疫苗候選抗原，尤其是與弓形蟲毒力相關的抗原基因是研究抗弓形蟲疫 苗的一個重要途徑。


【發明內容】

[0004] 本發明要解決的技術問題是提供一種用于弓形蟲感染預防的疫苗，為此，本發明 還提供所述疫苗的制備方法及其應用。
[0005] 弓形蟲棒狀體蛋白（rhoptry proteins,ROPs)是棒狀體分泌的對弓形蟲侵入宿主 細胞起重要作用的蛋白質，在蟲體入侵、PV的形成和修飾過程中起著重要作用，棒狀體蛋白 是重要的入侵和毒力作用因子。在棒狀體蛋白中，R0P2是一個很大的蛋白家族（Reese et al, 2009)，按 R0P2 命名，包括 R0P2、R0P3、R0P4、R0P5、R0P7、R0P8、R0P16 和 R0P18 等。R0P2 在弓形蟲的速殖子期、緩殖子期、包囊期都能表達并顯示出一定的免疫保護性，同時R0P2 還是一種保守蛋白，含有能被多數免疫個體所識別的T細胞表位，作為檢測用的抗原和疫 苗候選分子具有巨大潛力。棒狀體蛋白7 (R0P7)是R0P2家族的成員，R0P7的核酸序列與 R0P4有71%的相似性，其前體蛋白為65ku，成熟蛋白為57ku。弓形蟲侵入宿主細胞后就能 立即在納蟲空泡膜（parasitop horous vacuole membrane，PVM)中找到 R0P7,其與 R0P1 所 處的位置相同，并且在弓形蟲速殖子和緩殖子階段均有表達。因此，弓形蟲R0P7有望成為 理想的疫苗候選抗原。
[0006] 本發明提供一種用于弓形蟲感染預防的核苷酸序列，其含有選自以下的核苷酸序 列：
[0007] 1)序列表中SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列；
[0008] 2)與1)中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列；
[0009] 3)對上述1)或2)所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾， 并具有弓形蟲感染預防功能的核苷酸序列。
[0010] 本發明的第二個目的是提供一種重組蛋白，其氨基酸序列由上述的核苷酸序列編 碼。
[0011] 優選地，所述重組蛋白的氨基酸序列參見序列表中SEQ ID No. 2。
[0012] 本發明的第三個目的是提供一種重組載體，其包括上述的核苷酸序列。
[0013] 本發明的第四個目的是提供一種重組質粒，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。
[0014] 本發明的第五個目的是提供一種疫苗，其包括權利要求1所述的核苷酸序列，以 及醫學上可接受的載體。
[0015] 本發明的第六個目的是提供上述的核苷酸序列、重組蛋白、重組載體、重組質粒、 疫苗在弓形蟲感染預防中的應用。
[0016] 本發明的第七個目的是提供一種上述的疫苗的制備方法，步驟如下：
[0017] (1)提取弓形蟲RH株總RNA;
[0018] (2 ) RT-PCR 擴增 RH 株總 RNA ;
[0019] (3)將步驟2中的擴增產物與載體連接；
[0020] (4) pVAX I質粒的小量提取；
[0021] (5)回收pVAX I載體及目的片段R0P7 ;
[0022] (6)連接pVAX I載體與目的片段R0P7 ;
[0023] (7)將連接產物轉化至宿主菌中。
[0024] 優選地，所述RT-PCR擴增RH株總RNA時所用引物為：
[0025] 上游引物：5，-CGGGGTACCCCGATGGGGCACCCTACCTCTTTC-3，；
[0026] 下游引物：5' -TGCTCTAGAGCATCACGTTTCCGGTGGTGGC-3'。
[0027] 優選地，所述RT-PCR擴增RH株總RNA時PCR反應條件為：94°C預變性4min，94°C 變性lmin，62°C復性lmin ;72°C延伸2min ;32個循環，最后，72°C延伸7min。
[0028] 本發明的質粒DNA疫苗pVAX-R0P7可有效地預防和控制弓形蟲動物模型（昆明鼠） 的感染，即可有效的延長小鼠的存活時間，減少腦包囊的荷蟲量。因此，質粒PVAX-R0P7能 作為DNA疫苗候選抗原抗弓形蟲的感染。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實 施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中：
[0030] 圖1是pVAX-R0P7構建路線；
[0031] 圖2是弓形蟲RH株死亡情況；
[0032] 圖 3 是 pVAX I 質粒。

【具體實施方式】
[0033] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。
[0034] 本發明中實驗材料購自：
[0035] 雌性KM鼠，6w齡左右，體重20±2g，購自蘭州大學醫學實驗中心。
[0036] 宿主菌，弓形蟲RH、PRU株，pVAX I真核表達載體等材料，均為中國農業科學院蘭 州獸醫研究所寄生蟲功能基因組學研究室保存并提供。
[0037] PrimeScript?One St印 RT-PCR Kit Ver. 2 (貨號：RR055B)、10XPCR Buffer (Mg2+free)、MgCl2 (25mmol/L)、dNTP Mixture (2.5mmol/L each)、Ex-Taq (5U/yL)(貨 號：DDR100D)、pGEM-T easy Vector (貨號：A1360)、BamH I (貨號：D1010A)、Xhol (貨號： D1094A)、KpnI (貨號：D1068A)、PstI (貨號：D1073A)、XbaI (貨號：D1093A)、10XM Buffer、 10XK Buffer、10X 和 6XLoading Buffer:購自 TaKaRa 公司；
[0038] Wizard* SV Genomic DNA Purification System (貨號：A2360)、Tris-Cl、EDTA、 IPTG、X-gal、T4DNA 連接酶：購自 Promega 公司；
[0039] RNAprep Pure Tissue Kit (貨號：DP431)、TIANprep Mini Plasmid Kit (貨號： DP103-02)、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(貨號：貨號：DP209-02)、普通DNA產物純化試 劑盒(貨號：DP204-02):購自天根生化科技(北京）有限公司；
[0040] 氨節青霉素（Amp)、卡那霉素（Kan)、瓊脂糖：購自Sigma公司；
[0041] 其他化學試劑如NaCl、無水乙醇等均為國產分析純級產品。
[0042] 一、弓形蟲RH株pVAX-R0P7疫苗的制備方法如下：
[0043] 1.弓形蟲RH株總RNA的提取：將弓形蟲RH株腹腔接種KM鼠，96h后，經頸椎脫 臼致死，無菌收集小鼠腹水1. 0mL，在10000轉/分鐘轉速下離心3?5min，棄上清，備用。 用天根生化科技(北京）有限公司的試劑盒RNAprep Pure Tissue Kit提取弓形蟲RH株總 RNA，提取的具體方法和步驟參見說明書。
[0044] 2. RT-PCR擴增：以所提取的弓形蟲RH株總RNA為模板，用大連寶生物工程公司 PrimeScript?0ne St印RT-PCR Kit Ver.2試劑盒進行R0P7基因的RT-PCR擴增，使用方 法參見說明書。其中，
[0045] 上游引物：FR0P7:5，-CGGGGTACCCCGATGGGGCACCCTACCTCTTTC-3';
[0046] 下游引物：RR0P7:5' -TGCTCTAGAGCATCACGTTTCCGGTGGTGGC-3' ；
[0047] PCR反應條件為：94°C預變性4min，94°C變性lmin，62°C復性lmin ;72°C延伸 2min ; 32個循環，最后，72 °C延伸7min。
[0048] 3. PCR純化產物的連接：將步驟2中的擴增產物與pGEM-T連接，連接反應使用 TaKaRa公司pGEM-T easy Vector，使用方法參見說明書，連接條件為16°C反應2?4h或 4°C連接過夜，連接產物標記為PGEM-R0P7。
[0049] 4. R0P7的序列測定：將經菌液PCR和酶切鑒定均為陽性的菌株，送到上海生工生 物工程有限公司測序。測序結果參見序列表中SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列，其編碼 的蛋白序列參見序列表中SEQ ID No. 2。
[0050] 5.pVAX I質粒的小量提取：用天根生化科技(北京）有限公司TIANpr印Mini Plasmid Kit進行pVAX I質粒提取，使用方法參照說明書。
[0051] 6. pVAX I載體（圖1所示）及目的片段R0P7的回收：用Κρη I和Xba I分別雙酶 切pVAX I質粒及pGEM-R0P7重組質粒，并用天根生化科技(北京)有限公司普通瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒回收載體及目的片段，使用方法參照說明書。
[0052] 7. pVAX I載體與目的片段R0P7的連接：將經切膠回收純化得到的R0P7基因片段 定向亞克隆至pVAX I載體中。16°C反應4?6h或4°C連接過夜，產物標記為pVAX-R0P7。 其核苷酸序列見SEQ ID No. 3,其中，橫線部分為R0P7的核苷酸序列。
[0053] 8.連接產物的轉化與鑒定：將連接產物10 μ L轉化大腸桿菌DH5 α中，挑取若干 單菌落作菌液PCR鑒定。產物標記為pVAX-R0P7。pVAX-R0P7構建路線見圖1。
[0054] 二、培養基和溶液的配制：
[0055] a、溶液的配制：
[0056] (1)LB液體培養基
[0057] 稱取LB粉末5. 0g，加適量的去離子水溶解，并定容至200mL，121 °C高壓滅菌 20min，4°C保存備用。
[0058] (2) LB固體培養基
[0059] 于LB液體培養基中加入2. 0% (m/V)瓊脂粉，121°C高壓滅菌20min，待其冷卻到 55°C?65°C時傾注平板，待凝固后4°C保存備用。
[0060] (3 ) Kan+LB選擇液體培養基
[0061] 待（1)中制備的LB液體培養基高壓滅菌后冷卻至50°C?55°C時，加入Kan (卡那 霉素）（終濃度為l〇〇〇IU/mL)，搖晃混勻后4°C保存。
[0062] (4 ) Kan+LB固體選擇培養基
[0063] 待（2)中制備的LB固體培養基滅菌后冷卻至50°C?55°C時，加入Kan (終濃度為 1000IU/mL)并輕輕搖動，混勻后迅速傾注平板，室溫凝固并于4°C保存備用。
[0064] b、質粒大量提取時溶液的配制：
[0065] (1) 0· 25mol/L Tris-Cl 溶液（ρΗ8· 0)
[0066] 稱取Tris-Cl粉末6.055g，并將其溶解到100mL ddH20中，調節pH值為8.0,定容 到200mL，高壓滅菌后4°C保存備用。
[0067] (2) 0· 5mol/L EDTA 溶液（ρΗ8· 0)
[0068] 稱取Na2EDTA37. 22g，溶于200mL ddH20中，振蕩混勻，調節pH值為8. 0,高壓滅菌 后4 C保存備用。
[0069] (3)TE溶液（pH8·0)
[0070] 先將（1)中制備的0· 25mol/L Tris-Cl溶液和（2)中制備的0· 5mol/L EDTA溶液 (ρΗ8·0)稀釋，并分別吸取 10mmol/L Tris-Cl l.OmL與 lmmol/L EDTA0.2mL，加入無菌ddH20 后定容到100mL，4°C保存備用。
[0071] (4) 10%SDS 溶液（pHL 2)
[0072] 稱取SDS (十二烷基磺酸鈉）粉末10g，加入去離子水90mL后60°C水浴溶解，用濃 HC1將其pH值調為7. 2,并定容到100mL，現配現用，不宜長期保存。
[0073] (5) 2mol/L NaOH 溶液
[0074] 先于燒杯中加入去離子水160mL，稱取NaOH粉末16. Og并緩緩加入到去離子水中， 邊加邊混勻，定容到200mL后于塑料瓶中4°C保存。
[0075] (6) Solution I
[0076] 取（1)中制備的 0· 25mol/L Tris-C110mL，（2)中制備的 0· 5mol/LEDTA2mL，加去離 子水定容到100mL，高壓蒸汽滅菌后4°C保存。
[0077] (7) Solution II
[0078] 取2mol/L NaOHlOmL，10%SDS10mL，加去離子水定容到100mL，現配現用，常溫保存， 不宜長時間存放。
[0079] (8) Solution III
[0080] 稱取KAc粉末58. 884g，與冰乙酸23mL混合，加入適量去離子水溶解后定容到 200mL，4°C 保存。
[0081] (9) 3mol/L NaAc 溶液（ρΗ5· 2)
[0082] 稱取無水NaAc49. 22g，加去離子水定容到200mL，高壓蒸汽滅菌后4°C保存。
[0083] (10) 5mol/L LiCl 溶液
[0084] 稱取無水LiC142. 4g，加去離子水定容到200mL，高壓蒸汽滅菌后4°C保存。
[0085] (11) 10mg/mL 溶菌酶
[0086] 使用前，稱取10mg的溶菌酶，加10mm〇l/L的Tris-Cl (PH8. 0)即刻溶解定容至 lmL，-20°C保存。
[0087] 三、大量制備質粒
[0088] 1.挑取步驟(一）和（二）中制備的已保存于_20°C的含有目的質粒（pVAX I， PVAX-R0P7)的陽性菌液于Kan+LB固體選擇培養基上劃線，37°C培養過夜。挑取板上的一個 單菌落置于12mL Kan+LB液體選擇培養基中，搖床37°C，以180?220轉/分鐘的轉速培養 12?16h。將上述培養菌液以體積比1 :100的比例接種到裝有400mL Kan+LB液體選擇培 養基的l〇〇〇mL錐形瓶中，搖床37°C，在180?220轉/分鐘轉速下培養過夜。
[0089] 2.將步驟1得到的細菌培養物置于冰中或4°C冰箱數分鐘，4°C，以9000轉/分鐘 轉速離心5min，收集細菌培養物沉淀，棄上清(利用移液器小心吸出上清)，倒置離心管使上 清盡量流出。用10mL4°C預冷的Solution I重懸菌體，旋渦振蕩，使細菌在Solution I中完 全分散。（由于旋渦振蕩和Solution I的加入已足夠是菌液裂解分散，為了簡化操作，此處 省去現有技術中進一步裂解分散的步驟：加入lmL新配制的10mg/mL溶菌酶溶液（pH8. 0)， 震蕩混勻）。
[0090] 3.在步驟2得到的菌液中加入20mL新配制的Solution II，輕搖并上下顛倒混勻 2?4次。再加入15mL4°C預冷的Solution III，立即輕搖混勻，以免產生局部沉淀。冰上 或-20°C冰箱放置10min。加 Solution II和Solution III的時間間隔控制在5min以內， 以免過分裂解。4°C或室溫，在11000轉/分鐘下離心10min，利用4層紗布將上清過濾，轉 移到兩個新50mL離心管中。
[0091] 4.將步驟3得到的上清與14-16mL異丙醇(現有技術中此處需加入0. 6倍體積的 異丙醇的方法，本 申請人:通過實驗發現，異丙醇的加入量在0.6倍體積上下各lml的范圍 內，是不影響產物的提取質量和產量的)混勻，室溫放置l〇min。室溫下，在11000轉/分鐘 下離心lOmin，棄上清，將空管倒置于濾紙上數分鐘，除去殘余。加入3mL ddH20充分溶解， 再加入3mL預冷的5mol/L LiCl溶液(此時需先加 ddH20，后加 LiCl，才能使沉淀充分溶解， 顛倒步驟易造成沉淀溶解不充分或不溶解)，充分混勻，此處不可用吹打的方式混勻。吹打 混勻易使提取的質粒發生斷裂，兩只離心管合并為一管，冰中或_20°C冰箱放置lOmin。4°C 或室溫，在11000轉/分鐘下離心lOmin，將上清分別轉移到一新50mL離心管中，加入等體 積（12mL)預冷的異丙醇，充分混勻，室溫放置lOmin。4°C或室溫，在11000轉/分鐘下離心 lOmin，小心棄上清，倒置控干管內液體，一般倒置10?15min即可。此時管壁會出現白色 沉淀物即質粒。
[0092] 5.在步驟4制備的白色沉淀物中加入3mL ddH20或TE溶液（pH8.0)溶解沉淀， 并加入30 μ L10mg/mL RNase A (Takara公司產品），37°C水浴lh除去RNA。加入2倍體積 (8mL)無水乙醇和1/10體積（400yL)。用3mol/L NaAc溶液，充分混勻，冰中或-20°C冰箱 放置20min。4°C，在11000轉/分鐘下離心lOmin，小心將上清吸出（勿用傾倒的方式除去上 清，易造成使吸附于管壁的沉淀分散，而非上清被倒出），并將離心管倒置于濾紙上控干（主 要控干殘余的試劑如：乙醇和NaAc，減少雜質，提高質粒的純度)。加入lOOyL ddH20或TE 溶液（PH8. 0)，充分洗脫質粒沉淀。利用分光光度計測量所得質粒的濃度并記錄，測出的濃 度為10000mg/mL。因此，我們將以保存濃度為1000mg/mL (十倍稀釋)的量分裝于1. 5mL離 心管中，即每管保存有l〇〇〇mg質粒,體積為lmL,分裝封口后于-20°C保存備用。
[0093] 四、質粒DNA的純度檢測
[0094] 以ddH20或ΤΕ (ρΗ8·0)為空白對照，用分光光度計測定波長260nm和280nm下的 核酸溶液光密度（0D)值。雙鏈DNA純品的0D 26(l/0D28(l值為1. 8,若樣品0D26(l/0D28(l值低于 1.8,說明樣品可能被蛋白質污染，需進一步純化。
[0095] 五、重組質粒的免疫效果評價
[0096] 1. KM鼠免疫與分組：為了降低應激反應，KM鼠買回后需飼養1周，然后將其隨機分 為4個組，每組23只，具體分組見表1。
[0097] 表1免疫實驗分組情況
[0098]

【權利要求】
1. 一種用于弓形蟲感染預防的核苷酸序列，其含有選自以下的核苷酸序列： 1) 序列表中SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列； 2) 與1)中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列； 3) 對上述1)或2)所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾，并具 有弓形蟲感染預防功能的核苷酸序列。
2. -種重組蛋白，其氨基酸序列由權利要求1所述的核苷酸序列編碼。
3. 根據權利要求2所述的重組蛋白，其特征在于：所述重組蛋白的氨基酸序列參見序 列表中 SEQ ID No. 2。
4. 一種重組載體，其包括權利要求1所述的核苷酸序列。
5. -種重組質粒，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。
6. -種疫苗，其包括權利要求1所述的核苷酸序列，以及醫學上可接受的載體。
7. 權利要求1所述的核苷酸序列、權利要求2或3所述的重組蛋白、權利要求4所述 的重組載體、權利要求5所述的重組質粒、權利要求6所述的疫苗在弓形蟲感染預防中的應 用。
8. -種權利要求6所述的疫苗的制備方法，步驟如下： (1)提取弓形蟲RH株總RNA; (2 ) RT-PCR 擴增 RH 株總 RNA ; (3) 將步驟2中的擴增產物與載體連接； (4) pVAX I質粒的小量提取； (5) 回收pVAX I載體及目的片段R0P7 ; (6) 連接pVAX I載體與目的片段R0P7 ; (7) 將連接產物轉化至宿主菌中。
9. 根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于：所述RT-PCR擴增RH株總RNA時所 用引物為： 上游引物：5' -CGGGGTACCCCGATGGGGCACCCTACCTCTTTC-3，； 下游引物：5' -TGCTCTAGAGCATCACGTTTCCGGTGGTGGC-3'。
10. 根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于：所述RT-PCR擴增RH株總RNA時PCR 反應條件為：94°C預變性4min，94°C變性lmin，62°C復性lmin ;72°C延伸2min ;32個循環， 最后，72°C延伸7min。
【文檔編號】A61K39/002GK104152466SQ201410136321
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年4月4日 優先權日:2014年4月4日
【發明者】徐民俊, 周洋, 袁子國, 宋慧群, 黃思揚, 周東輝, 陳佳 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所