一種能與glp-1r特異性結合的抗體及其與glp-1的融合蛋白質的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種能與GLP-1R特異性結合的抗體及其與GLP-1的融合蛋白。這些融合蛋白質可以高效地與人GLP-1R受體結合并激活受體信號通道，可以被用于糖尿病，超重，肥胖，及其相關病癥的治療。
【專利說明】—種能與GLP-1R特異性結合的抗體及其與GLP-1的融合蛋白質

【技術領域】
[0001]本發明涉及抗體【技術領域】，特別涉及一種能與GLP-1R特異性結合的抗體及其與GLP-1的融合蛋白質。

【背景技術】
[0002]II型糖尿病的典型癥狀包括以下三個方面:1)外周胰島素抵抗，主要是骨骼和肌肉對胰島素的應激度下降，導致對這些組織的葡萄糖輸出受到影響(Kahn and Goldfine,J Diabetes Complicat1n (1993)7:92-105 ；ffeyer 等，J Clin Invest.(1999)104:787-794) ；2)過度的肝臟葡萄糖生成，肝臟細胞對胰島素的調節應激降低(Kahnand Goldfine, J Diabetes Complicat1n.(1993) 7:92-105 ；Lam 等，Am J Phys1lEndocrinol Metab.(2009) 11:375-378)和膜高血糖素的過度分泌(Unger and Orci,Arch Intern Med.(1977) 137:482-491) ;3)膜島 beta 細胞失調，在疾病早期，beta 細胞的增殖和胰島素分泌量增加代償性彌補胰島素抵抗對血糖的影響(Bonner-Weir, TrendsEndocrinol Metab.(2000)11:375-378),但隨著時間和胰島素抵抗程度的增加導致beta細胞耗竭，胰島素分泌隨之下降導致了 II型糖尿病的真正始發(DeFronzo, Diabetes.(1988) 37:667-687; Kahn 等，J Nutr.(2001) 131:354S-360S)。
[0003]胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)是一個包含有30個氨基酸的肽段。它由腸道內L細胞分泌來應激葡萄糖的攝入(Orskov等，Diabetes (1994) 43:535-539; Drucker等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1987) 84: 3431-3438)。其應激分泌后，GLP-1 和胰腺上的GLP-1R (胰高血糖素樣肽-1受體)結合激活下游腺苷酸環化酶信號通路來促進胰島素的合成與分泌。GLP-1分泌還會減少胃排空，以此來減少食物消化后進入循環系統的葡萄糖的量(Wettergren 等，Dig.Dis.Sc1.(1993) 38:665_673)。在小鼠以及 I 型和 II 型糖尿病患者中，GLP-1增加了胰島素的分泌降低血糖濃度(Nauck等，Diabetes.(1997)105:187-195; Todd 等，Eur J Clin Invest.(1997) 27:533-536)。有研究顯示，GLP-1還能夠抑制胰腺beta細胞的凋亡，促進其增殖(Perfetti等，Endocrinology (2000)141:4600-4605 ；Hui 等，Endocrinology (2003) 144:1444-1455)。臨床已經證實了GLP-1在治療糖尿病病人上的可行性和效果(Samson and Garber, Curr Opin EndocrinolDiabetes Obes.(2013) 20:87-97)，也已經有專利(U.S Pat.No 5，899，883，U.S.Pat.N0.6，989，148)敘述了使用GLP-1及其衍生物來治療糖尿病的方法。但是GLP-1在體內半衰期較短，治療效果不佳。


【發明內容】

[0004]本發明的目的之一在于提供一種能與GLP-1R特異性結合的抗體。
[0005]本發明的目的之二在于提供一種能與GLP-1R特異性結合的抗體與GLP-1形成的融合蛋白質，它能延長GLP-1的體內半衰期來保留GLP-1分子生物學活性。同時，GLP-1和能與GLP-1R特異性結合的抗體形成的融合蛋白質具有由抗體提供的分子靶向性，而且抗體的免疫源性也低于其他的融合蛋白質伙伴。
[0006]本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:
一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，所述抗體包含以下方案之一的氨基酸序列:
a.選自以下序列之一的輕鏈⑶R3序列:
與選自L1-L13的輕鏈CDR3序列:SEQ ID NO: 46?SEQ ID NO: 53其中之一相差總共不超過三個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR3序列；優選的與選自L1-L13的輕鏈CDR3序列:SEQ ID NO: 46?SEQ ID NO: 53其中之一相差總共不超過兩個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈⑶R3序列；更優選的與選自L1-L13的輕鏈⑶R3序列:SEQ ID NO:46?SEQ ID NO: 53其中之一相差一個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈⑶R3序列。
[0007]b.選自以下序列之一的重鏈⑶R3序列:
與選自H1-H13的重鏈CDR3序列:SEQ ID NO: 20?SEQ ID NO: 27其中之一相差總共不超過四個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈CDR3序列；優選的與選自H1-H13的重鏈CDR3序列:SEQ ID NO: 20?SEQ ID NO: 27其中之一相差總共不超過三個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈⑶R3序列；進一步的與選自H1-H13的重鏈⑶R3序列:SEQ ID NO:2(TSEQ ID NO: 27其中之一相差總共不超過二個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈⑶R3序列；更進一步的與選自H1-H13的重鏈CDR3序列:SEQ ID NO: 20?SEQ ID NO: 27其中之一相差一個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈CDR3序列。
[0008]c.(a)的輕鏈⑶R3序列和(b)的重鏈⑶R3序列。
[0009]作為優選，所述抗體還包含以下方案的一種或幾種組合的氨基酸序列:
a.選自以下之一的輕鏈⑶Rl序列:
與選自L1-L13的輕鏈CDRl序列:SEQ ID NO: 28?SEQ ID NO: 37其中之一相差不超過三個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈⑶Rl ;優選的與選自L1-L13的輕鏈⑶Rl序列:SEQ ID NO: 28?SEQ ID NO:37其中之一相差總共不超過兩個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDRl序列；更優選的與選自L1-L13的輕鏈CDRl序列:SEQ ID NO: 28?SEQ ID NO: 37其中之一相差一個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDRl序列。
[0010]b.選自以下之一的輕鏈⑶R2序列:
與選自L1-L13的輕鏈CDR2序列:SEQ ID NO: 38?SEQ ID NO: 45其中之一相差不超過兩個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR2 ;優選的與選自L1-L13的輕鏈CDR2序列:SEQ ID NO: 38?SEQ ID NO: 45其中之一相差一個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR2序列。
[0011]c.選自以下之一的重鏈⑶Rl序列:
與選自H1-H13的重鏈CDRl序列:SEQ ID NO: 6?SEQ ID NO: 12其中之一相差不超過兩個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈⑶Rl ;優選的與選自H1-H13的重鏈⑶Rl序列:SEQ ID NO: 6?SEQ ID NO: 12其中之一相差一個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈⑶R2序列。
[0012]d.選自以下之一的重鏈⑶R2:
與選自H1-H13的重鏈CDR2序列:SEQ ID NO: 13?SEQ ID NO: 19其中之一相差不超過三個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈序列。優選的與選自H1-H13的重鏈⑶R2序列:SEQ ID NO: 13?SEQ ID NO: 19其中之一相差總共不超過兩個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDRl序列；更優選的與選自H1-H13的重鏈CDR2序列:SEQ ID NO: 13?SEQ ID NO:19其中之一相差一個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDRl序列。
[0013]一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，所述抗體包含以下方案之一:
a.包含以下方案的一種或幾種的輕鏈可變結構域:
1.選自SEQID NO: 28?SEQ ID NO: 37其中之一的輕鏈CDRl序列；
i1.選自SEQID NO: 38?SEQ ID NO: 45其中之一的輕鏈CDR2序列；
ii1.選自SEQID NO: 46?SEQ ID NO: 53其中之一的輕鏈CDR3序列；
b.包含以下方案的一種或幾種的重鏈可變結構域:
1.選自SEQID NO: 6?SEQ ID NO: 12其中之一的重鏈CDRl序列；
i1.選自SEQID NO: 13?SEQ ID NO: 19其中之一的重鏈CDR2序列；
ii1.選自SEQID NO: 20?SEQ ID NO: 27其中之一的重鏈CDR3序列；
c.(a)的輕鏈可變結構域序列和(b)的重鏈可變結構域序列。
[0014]一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，所述抗體包含以下方案之一的氨基酸序列:
a.選自以下方案之一的輕鏈可變結構域序列:
1.具有與選自L1-L13的輕鏈可變結構域序列:SEQID NO: 81，SEQ ID NO: 83，SEQID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:95，SEQ ID NO: 97，SEQ ID NO: 99，SEQ ID NO: 101，SEQ ID NO: 103，SEQ ID NO: 105 其中之一至少80%相同的序列的氨基酸；
i1.與編碼L1-L13的輕鏈可變結構域序列的多聚核苷酸序列:SEQID NO: 80, SEQ IDNO: 82，SEQ ID NO: 84，SEQ ID NO: 86，SEQ ID NO: 88，SEQ ID NO: 90，SEQ ID NO: 92，SEQ ID NO: 94，SEQ ID NO: 96，SEQ ID NO: 98，SEQ ID NO: 100，SEQ ID NO: 102，SEQID NO: 104其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列編碼的氨基酸序列；
b.選自以下的重鏈可變結構域序列:
1.與H1-H13 的重鏈可變結構域序列:SEQ ID NO: 55，SEQ ID NO: 57，SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQID NO: 71，SEQ ID NO: 73，SEQ ID NO: 75，SEQ ID NO: 77，SEQ ID NO: 79 其中之一至少80%相同的氨基酸序列；
i1.與編碼H1-H13的重鏈可變結構域序列的多聚核苷酸序列:SEQID NO: 54, SEQ IDNO: 56，SEQ ID NO: 58，SEQ ID NO: 60，SEQ ID NO: 62，SEQ ID NO: 64，SEQ ID NO: 66，SEQ ID NO: 68，SEQ ID NO: 70，SEQ ID NO: 72，SEQ ID NO: 74，SEQ ID NO: 76，SEQ IDNO: 78其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列編碼的氨基酸序列；
c.(a)的輕鏈可變結構域序列和(b)的重鏈可變結構域序列。
[0015]作為優選，所述抗體還包含以下方案之一的氨基酸序列:
a.選自L1-L13 的輕鏈可變結構域序列:SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQID NO: 97，SEQ ID NO: 99，SEQ ID NO: 101，SEQ ID NO: 103，SEQ ID NO: 105 其中之一的輕鏈可變結構域序列；
b.選自H1-H13 重鏈可變結構域序列:SEQ ID NO: 55，SEQ ID NO: 57，SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQID NO: 71，SEQ ID NO: 73，SEQ ID NO: 75，SEQ ID NO: 77，SEQ ID NO: 79 其中之一的重鏈可變結構域序列；
c.a的輕鏈可變結構域序列和b的重鏈可變結構域序列。
[0016]作為優選，方案c中a的輕鏈可變結構域序列與b的重鏈可變結構域序列的組合選自以下之一:L1HU L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、LIIHl1、L12H12、L13H13。
[0017]作為優選，所述抗體還包含以下方案之一的氨基酸序列:
a.SEQ ID NO: 106的輕鏈恒定區氨基酸序列；
b.SEQ ID NO: 107的輕鏈恒定區氨基酸序列；
c.SEQ ID NO: 108的重鏈恒定區氨基酸序列；
d.SEQ ID NO: 109的重鏈恒定區氨基酸序列；
e.SEQ ID NO: 106的輕鏈恒定區氨基酸序列和SEQ ID NO: 108的重鏈恒定區氨基酸序列；
f.SEQ ID NO: 107的輕鏈恒定區氨基酸序列和SEQ ID NO: 108的重鏈恒定區氨基酸序列；
g.SEQ ID NO: 106的輕鏈恒定區氨基酸序列和SEQ ID NO: 109的重鏈恒定區氨基酸序列；
h.SEQ ID NO: 107的輕鏈恒定區氨基酸序列和SEQ ID NO: 109的重鏈恒定區氨基酸序列。
[0018]作為優選，所述抗體選自鼠源抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、Fab片段、F(fa’ )x片段、結構域抗體、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、IgG4抗體。
[0019]一種GLP-1融合蛋白質，所述GLP-1融合蛋白質由GLP-1和本發明的抗體融合形成，其中GLP-1包含選自以下之一的氨基酸序列:SEQ ID NO: 1,SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3，SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO: 127。
[0020]作為優選，GLP-1通過 N’ -R1-L-R2-C’、N’ -R2-L-R1-C’ 或者 N’ -R2_L-Rlr-C’ 的連接方式與權利要求1或3或4所述抗體的輕鏈和/或重鏈相融合；
其中L為肽接頭序列，其包含全長的、部分的或者重復的選自LKf LK3的氨基酸序列:SEQ ID NO: 110，SEQ ID NO: 111，SEQ ID NO: 112 其中之一的氨基酸序列；
Rl為GLP-1的氨基酸序列；
Rlr為GLP-1的反向氨基酸序列；
R2為權利要求1或3或4所述抗體輕鏈或者重鏈的氨基酸序列；
C’代表GLP-1融合蛋白質多肽鏈的羥基殘基端；
N’代表GLP-1融合蛋白質多肽鏈的氨基殘基端。
[0021]—種多核苷酸，其編碼本發明的GLP-1融合蛋白質。
[0022]—種載體，其包含本發明的多核苷酸。
[0023]一種宿主細胞，其包含本發明的載體。
[0024]一種藥用組合物，其包含與藥用可接受載體混合的本發明的GLP-1融合蛋白質。
[0025]一種包含或基于本發明的抗體或者GLP-1融合蛋白質的藥用組合物在制備用于預防或治療非胰島素依賴性糖尿病的藥物中的用途。
[0026]考慮到GLP-1R在使用胰島素樣肽_1調控II型糖尿病人的血糖濃度方法中的所承擔的關鍵作用，并且其顯著的治療特征是其刺激胰島素分泌而不伴有低血糖相關危險的能力。本發明將GLP-1與能與GLP-1R特異性結合的抗體相融合，延長GLP-1的體內半衰期來保留GLP-1分子生物學活性。同時，GLP-1和能與GLP-1R特異性結合的抗體形成的融合蛋白質具有由抗體提供的分子靶向性，而且抗體的免疫源性也低于其他的融合蛋白質伙伴。
[0027]本發明的有益效果是JfGLP-1與能與GLP-1R特異性結合的抗體相融合，延長GLP-1的體內半衰期來保留GLP-1分子生物學活性。同時，GLP-1和能與GLP-1R特異性結合的抗體形成的融合蛋白質具有由抗體提供的分子靶向性，而且抗體的免疫源性也低于其他的融合蛋白質伙伴。
[0028]發明詳述
本發明針對GLP-1在體內被二肽基肽酶(DPP-1V)迅速清除而有效性不足的缺點用GLP-1R的抗體與其融合來增強其半衰期和生物學活性。所用于融合的抗體，具有不阻礙GLP-1與受體結合的前提下，特異性識別GLP-1R的生物學活性，本身與受體的高親和力和穩定性能夠長效地增加GLP-1在受體周圍的局部濃度，從而大大增加其與受體結合的有效時間和效價。同時，與抗體的融合增加了 GLP-1被DPP-1V識別或者捕獲的空間位阻，減少了其在體內被清除的幾率而增加了 GLP-1的有效時長。據文獻報道，GLP-1R的N端胞外區和其跨膜區部分的咬合狀態的釋放是GLP-1得以進入與GLP-1R的結合位點，行使其生物活性的關鍵步驟。而本發明中所述的抗體與GLP-1R結合很大程度上涉及到受體的N端胞外區，其和受體的結合有助于上述咬合狀態的釋放，利于GLP-1的進入。所以，GLP-1與針對GLP-1R的抗體融合后增加了自身的半衰期和親和效價，有更強的生物學活性，是更進一步優越于GLP-1療法的一個重要創新。更重要的是，本發明所用的部分抗體本身具有在GLP-1存在的情況下，增強GLP-1R的GLP-1激活的生物學特性。因為以上的一些原因，本發明所述的GLP-1融合蛋白質是比GLP-1更有效的GLP-1R激活劑。
[0029]融合蛋白質長時期反復施用時的抗原性存在普遍的顧慮。對于GLP-1融合物療法，這尤其是一個顧慮，因為糖尿病患者一旦經診斷為該疾病，必須一生接受治療。此外，如果免疫球蛋白的Fe部分保留不需要的效應子功能，Fe融合蛋白質療法可能是一個顧慮。通過用電腦協助對免疫球蛋白的三維結構的預測以及抗體的序列的優化以及人源化，加上鑒定反復和長期施用后誘導免疫反應風險降低并且不再具有效應子功能的特定GLP-1融合蛋白質，本發明的中討論的GLP-1部分的氨基酸優選通過富含甘氨酸和絲氨酸的肽接頭與抗體的輕鏈和重鏈相融合。因為甘氨酸和絲氨酸帶有較小的側鏈，使肽接頭序列具有相當的靈活性，減少了 GLP-1和抗體之間相對位置的剛性，使GLP-1可以自由地與GLP-1R相互作用。同時，肽接頭的存在隔離了 GLP-1和抗體，避免了兩者結構域的相互作用。甘氨酸和絲氨酸交替出現避免過度重復向融合蛋白質中引入不必要的免疫源性，但是肽接頭無可避免的增加融合蛋白質在體內的免疫原性，優選肽接頭長度，平衡結構柔度和免疫源性很重要，所以，本發明提供了 3個不同長度的肽接頭用于融合。同時，本發明中提供了 GLP-1與抗體用肽接頭通過不同的連接的方式來形成融合，由此而形成的GLP-1融合蛋白質的形式包括:
1)帶有GLP-1與輕鏈通過N’-R1-L-R2-C’方式連接的融合蛋白質；
2)帶有GLP-1與輕鏈通過N’-R2-L-R1-C’方式連接的融合蛋白質；
3)帶有GLP-1與輕鏈通過N’-R2-L-Rlr_C’方式連接的融合蛋白質；
4)帶有GLP-1與重鏈通過N’-R1-L-R2-C’方式連接的融合蛋白質；
5)同時帶有I)和4)的融合蛋白質；
6)同時帶有2)和4)的融合蛋白質；
7)同時帶有3)和4)的融合蛋白質。
[0030]本發明中，編碼GLP-1的DNA與所述抗體的全長/可變區/片段輕鏈或全長/可變區/全長重鏈DNA通過編碼肽接頭序列的DNA連接成融合輕鏈或融合重鏈DNA，同時在輕鏈DNA的5’末端還將引入編碼信號引導肽的DNA來形成基因，并可以此基因基礎連接突變/野生型的GLP-1和抗體序列。本發明通過基因合成的方法得到GLP-1的序列，并通過PCR的方法將其與肽接頭序列以及抗體輕鏈或重鏈DNA相連接。針對GLP-1R的抗體輕鏈或重鏈可變區序列由特定雜交瘤細胞中通過PCR方法調取，并與特定抗體亞型的恒定區DNA相連接組成得到。野生型抗體亞型的恒定區DNA可以通過從特定的文庫克隆得到并作為序列優化的基礎。在此所述的用于表達融合蛋白質的基因，通過克隆方式放入表達載體中用于融合蛋白質的產生和表達。在表達過程中，輕鏈和重鏈表達載體搭配后，用共轉染或者轉化的方式將帶有其基因的DNA引入宿主細胞中，并用優化適應誘導啟動子，選擇轉化子或者擴增編碼所希望序列的基因的培養基在適宜的PH，溫度中培養。DNA引入方式選用普遍使用的CaPO4,電穿孔和PEI等方式。
[0031]適于表達此處所述載體中核酸的合適宿主細胞包括高等真核細胞，哺乳動物宿主細胞系表達的實例包括了中國倉鼠卵巢細胞系(CHO)和人胚胎腎臟細胞(HEK293或者懸浮培養的HEK293細胞系)，位于輕鏈N末端的信號引導肽指導重組融合蛋白質的從哺乳動物宿主細胞系中的分泌。用于表達和克隆的載體上帶有能夠使載體在宿主細胞中不斷復制的選擇標記，用于篩選有能力吸收編碼融合蛋白質的核酸的細胞并且帶有與融合蛋白質編碼序列有效連接并指導mRNA合成的啟動子。其中一個實例是用帶有抗生素抗性以及乙型肝炎病毒和猿病毒啟動子(SV40)的載體優選穩定表達融合蛋白質的CHO宿主細胞。
[0032]本發明在宿主細胞系表達融合蛋白質后，用親和層析的方法將其分泌在細胞培養上清中的部分純化。本發明中的實例包括用蛋白G的親和層析柱捕獲融合有全長抗體的融合蛋白質，然后用低PH將其從層析柱料上洗脫后再收集。溫和的洗脫條件有助于防止蛋白的變性。
[0033]可以用一種或多種賦形劑配制本發明的融合蛋白質。本發明的融合蛋白質可以與可藥用的緩沖液、經調節提供可接受的穩定性的pH、以及可施用(例如胃腸外施用)的pH組合。任選地，可以添加一種或多種可藥用的抗微生物劑。間甲酚和苯酚是優選的可藥用抗微生物劑。可以添加一種或多種可藥用鹽溶液以調節離子強度或張力。可以添加一種或多種賦形劑以進一步調節制劑的等滲性。甘油是等滲性調節賦形劑的實例。可藥用意味著適于施用于人類或其他動物，因此不含有毒性成分或不希望的污染物，并且不干擾其中活性化合物的活性。
[0034]可以以溶液制劑或能夠用合適的稀釋劑重構的凍干粉配制本發明的融合蛋白質。凍干劑型是其中融合蛋白質穩定的一種劑型，具有或不具有重構產品在預期的使用貨架期內保持PH的緩沖能力。包含在此討論的融合蛋白質的溶液在凍干前優選是等滲的，使之重構后能夠形成等滲溶液。
[0035]本發明的融合蛋白質的可藥用鹽溶液形式在本發明范圍內。常用于形成酸加成鹽的酸為無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸等，以及有機酸，例如對甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、對溴苯基一磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、乙酸等。優選的酸加成鹽是與無機酸，例如鹽酸和氫溴酸形成的鹽。
[0036]堿加成鹽包括從無機堿，例如銨、堿或堿土金屬氫氧化物衍生的那些鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽等。在制備本發明的鹽溶液中有用的這類堿因此包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、碳酸鉀等。
[0037]本發明的融合蛋白質具有生物學活性。生物學活性指該融合蛋白質在體內結合并激活GLP-1R并引起細胞應激反應。反應包括但是不限于提高胰島素的分泌、胰高血糖素分泌的抑制，抑制食欲、體重減輕、誘導過飽、抑制凋亡、誘導胰腺beta細胞增殖及胰腺beta細胞分化。對有代表性的一些GLP-1融合蛋白質測試體外和體內活性。首先，步驟4 (圖1)提供了該融合蛋白質和GLP-1R相互作用的熒光檢測數據。然后，步驟5提供了基于該融合蛋白質與人GLP-1R相互作用后將其活化的體外活性測定。在實驗中使用過表達人類GLP-1R的CHO細胞。在這些細胞中，GLP-1R的活化引起腺苷酸環化酶的活化，該酶的活化又誘導由cAMP應答元件(CRE)驅動的報告基因的表達。步驟12(圖2)提供了其中報告基因為螢光素酶的數據。體外的實驗數據共同表明融合蛋白質能夠結合并活化GLP-1R，并且在體外表現比GLP-1-Gly8(7-37)0H更有效。步驟13 (圖3)提供對禁食并腹腔注射本發明的融合蛋白質之一后16h的小鼠灌服葡萄糖后血糖的變化數據。步驟13小鼠中產生的數據則顯示該融合蛋白質在體內具有活性，并且比天然GLP-1具有更長的半衰期。
[0038]可以通過具有普通技能的內科醫生已知有效的任意途徑施用這些融合蛋白質。外周腸胃外屬于其中一種此類方法。醫學文獻中通常將腸胃外施用理解為通過消毒注射器或一些其他機械裝置例如注射泵向機體注射劑型。外周腸胃外可以包括靜脈內、肌內、皮下和腹膜內施用途徑。
[0039]本發明的融合蛋白質也可以進行經口、直腸、經鼻或下呼吸道途徑施用，它們是非腸胃外途徑。這些非腸胃外途徑中，優選下呼吸道途徑和經口途徑。
[0040]本發明的融合蛋白質可以用于治療多種疾病和病癥。本發明的融合蛋白質首先通過作用于GLP-1R而發揮其生物學作用。因此可以用本發明的GLP-1融合蛋白質治療會對GLP-1R刺激或對GLP-1化合物施用做有宜應答的疾病和/或病癥的受試者。將這些受試者稱為“需要GLP-1化合物治療”或“需要GLP-1R刺激”的受試者。包括非胰島素依賴性糖尿病、胰島素依賴性糖尿病、中風(見WO 00 / 16797)、心肌梗死(見WO 98 / 08531)、肥胖(見WO 98 / 19698)、手術后分解代謝改變(見美國專利號6，006, 753)、功能性消化不良和腸易激綜合征(見W099 / 64060)。也包括要求以GLP-1化合物預防性治療的受試者，例如具有發展為非胰島素依賴性糖尿病危險的受試者(見WO 00 / 07617)。糖耐量損傷或空腹葡萄糖損傷的受試者、體重對于受試者身高和體液高出正常體重約25%的受試者、部分胰切除的受試者、父母一方或雙方具有非胰島素療的GLP-1融合蛋白質的“有效量”是與沒有治療相比引起對血糖濃度的更佳控制，從而導致糖尿病并發癥(例如視網膜病、神經病或腎臟疾病)發作延遲的量。預防糖尿病的GLP-1融合蛋白質的“有效量"是與沒有治療相比延緩血糖水平升高的發作的量，所述發作需要以抗低血糖藥物例如磺酰脲類、噻唑烷二酮、胰島素和/或雙胍類治療。有效將患者血糖正常化的融合蛋白質的劑量取決于許多因素，其中包括但不限于受試者性別、體重和年齡、調節血糖無能的嚴重性、施用途徑和生物利用率。融合蛋白質藥物代謝動力學圖譜、潛能和劑型。劑量可以為0.0l至I mg / kg體重，優選0.05至0.5 mg / kg體重。優選每周一次或二次施用本發明的融合蛋白質。取決于所治療的疾病，可能有必要更頻繁地施用該融合蛋白質，例如每周三次或更多次。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1是流式細胞術(FACS)檢測重組表達的GLP-1融合蛋白質(GLP-1(A8G) -LK-L13H13)與穩定表達人源GLP-1R (hGLP-lR)的中國倉鼠卵巢細胞株(標有*的實線峰)以及中國倉鼠卵巢細胞株本身(虛線峰)的特異性結合的對比。
[0042]圖2是通過報告基因方法得到的GLP-1野生型(圓形)和GLP-1 (A8G)-LK-L13H13(三角形)對穩定表達hGLP-lR的中國倉鼠卵巢細胞株的激活曲線。
[0043]圖3是小鼠(ICR)糖耐量實驗，檢測GLP-1 (A8G) -LK-L13H13在5微克/只(方形)和15微克/只(三角形)單次1.p.注射16h后對禁食狀態下的小鼠的糖耐量的影響。
[0044]圖4是小鼠(C57BL)糖耐量實驗，檢測GLP-1 (A8G)-LK-L13H13在15微克/只(三角形)單次1.P注射40h后對禁食狀態下的小鼠的糖耐量的影響。
[0045]圖5是二型糖尿病小鼠(db/db Mice)血糖濃度時間糖曲線，檢測GLP-1 (A8G)-LK-L13H13在30微克/千克的濃度下(倒三角形)對二型糖尿病小鼠進行單次1.P.注射后的小鼠血糖濃度變化的時間曲線。
[0046]圖6是二型糖尿病小鼠(db/db Mice)日進食量時間曲線，記錄GLP-1 (A8G)-LK-L13H13在30微克/千克的濃度下(倒三角形)單次對二型糖尿病小鼠進行
1.P.注射前3天到注射后5天這一時間段內小鼠日進食量的變化的時間曲線。圖6和圖5為平行進行的實驗結果。

【具體實施方式】
[0047]下面通過具體實施例，并結合附圖，對本發明的技術方案作進一步的具體說明。
[0048]本發明中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。
[0049]步驟1:免疫用抗原細胞穩定株的構建
接種CHO-DHFR細胞至6孔板中，培養24h后轉染含hGLP-lR基因(核苷酸序列見SEQID NO: 113，氨基酸序列見SEQ ID NO: 114)的pYS質粒于6孔板中的細胞，轉染前更換培養液，按照Invitrogen公司推薦Lipofectamine 2000的轉染條件進行轉染。48h后，再換為含有10 nM MTX的完全培養基，每隔3天換液，待兩周左右，出現穩定生長的克隆，消化分散細胞集落，待長至50%愈合度時，逐漸提高MTX的濃度進行加壓篩選，直至MTX的濃度為10 μ Mo構建的穩定細胞株分別進行FACS檢測，利用抗hGLP-lR的抗體(Abeam)鑒定加壓后的細胞群體，10 μ M MTX篩選后的CHO-DHFR-hGLP-lR細胞膜上hGLP-lR有大量表達，最后經過亞克隆、鑒定獲得6株hGLP-lR高表達細胞穩定株。
[0050]步驟2:抗體的制備
將在弗氏佐劑中乳化的CHO-DHFR-hGLP-lR全細胞，以2xl06細胞/只的劑量皮下注射BALB/c小鼠(6-8周齡)。2周后,使用不完全弗氏佐劑乳化免疫原,加強免疫小鼠,此后每周加強一次。通過剪尾的方式采血，離心分離血清，進行FACS檢測血清效價。直至達到適合抗體滴度時，斷頸處死小鼠，無菌狀態下獲取脾臟細胞。收集生長狀態處于對數生長期的SP2/0細胞,2000 rpm, 3min離心,沉淀用無血清培養至重懸,再次離心-重懸,計數。混合脾臟細胞和SP2/0細胞，保證SP2/0:脾臟細胞> 1:1，共“洗滌-離心”3次。彈散最后一次離心后的沉淀，逐滴加入ImL預溫至37°C的PEG-1350 (30s內滴完)，上下吹吸慢加入30mL預熱至37°C的無血清培養基(Invitrogen)以終止PEG的融合作用，1500rpm,5min離心，彈散細胞沉淀，加入添加有HAT (次黃嘌呤、氨甲喋呤和胸苷；Invitr0gen)，20%FBS (B1ind)的RPMI1640 (Invitrogen)作為融合培養基，按每孔20000個脾細胞及5000個飼養層細胞鋪于96孔板中，每孔ΙΟΟμΙ。融合后的雜交瘤細胞和飼養層細胞一起在96孔板中進行培養，并進行HAT篩選，以除去非融合的細胞。10天后收取培養板中的雜交瘤細胞上清進行ELISA檢測。
[0051]步驟3:全細胞ELISA篩選
將CHO-DHFR-hGLP-lR過表達hGLP-1R的細胞和不表達hGLP-lR的CHO-DHFR-空白細胞分別接種至96孔板，長至90%愈合度。除去細胞培養上清，PBS洗兩遍，加入100 μ I 100%甲醇4°C固定lOmin。再加入100 μ I新鮮配制的0.6% H2O2-PBS,室溫處理20min，PBS洗滌2遍。經過PBS-1%BSA封閉后，加入雜交瘤細胞上清4°C孵育90 min。多次洗滌后，每孔加入 5000 倍稀釋的 GxM-HRP-Fc 二抗(Sigma-Aldrich)10 μ 1，37°C孵育 0.5h。洗滌 5 次后，每孔加入100 μ I TMB顯色底物，37°C反應15min, 2M H2SO4終止，讀取0D450值。陽性對照為免疫小鼠的血清；陰性對照為細胞培養基上清。選取分泌抗hGLP-lR抗體的雜交瘤株，進行克隆化以獲得能穩定分泌針對hGLP-lR的細胞株。最后選取雜交瘤細胞分泌的抗體上清進行FACS驗證。
[0052]步驟4:陽性雜交瘤細胞上清流式分析鑒定(FACS)
用含1mM EDTA的PBS消化、收集15個CHO-DHFR-hGLP-lR細胞，分別加入1.5ml EP管，離心后棄上清，陰性對照樣本用流式上樣緩沖液(PBS，2% FBS)重懸。陽性處理組細胞每管加200μ I抗體上清，室溫孵育；1500rpm離心，棄上清，用流式上樣緩沖液洗一次，再離心，重懸，每孔加入1:50稀釋的FITC標記的羊抗鼠熒光抗體(BD Pharmingen) 200μ1，室溫避光孵育30 min ;離心，棄上清，再用流式上樣緩沖液洗一次，離心，最后用流式上樣緩沖液重懸，上機檢測。雜交瘤細胞上清和表達有hGLP-lR的CHO-DHFR細胞有特異性結合，灰色峰和虛線峰為陰性對照，雜交瘤細胞上清對應的實線峰(帶有*標記)有明顯右移(圖1)。
[0053]步驟5:抗體基因的克隆及亞克隆
收集分泌抗體的雜交瘤細胞，按照QIAGEN的mRNA抽提試劑盒操作規程，提取雜交瘤細胞的mRNA。然后將提取后的mRNA反轉錄成cDNA，逆轉錄引物為小鼠輕、重鏈恒定區的特異性引物，重鏈逆轉錄引物為(5，-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC -3，)(SEQ ID NO: 115)，輕鏈逆轉錄引物為(5，- TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3，)(SEQ ID NO: 116)和(5，-TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’)(SEQ ID NO: 117)。RT-PCR 的反應條件為:25 °C 5min ；50°C 60min ；70°C 15min。將反轉錄的cDNA用0.1mM的TE稀釋至500 μ 1，加入到超濾離心管(Amicon Ultra-0.5)中,2000g 離心 1min ;棄濾液，再加 500 μ I 的 0.1mM 的 TE”2000g離心1min ;棄濾液，將制備管倒置到新的離心管中，2000g離心lOmin，得到純化后的cDNA ;取10μ I的純化后的cDNA作為模板，加入4 μ I的5x的tailing buffer,4 μ I的dATP (ImM)和1U的末端轉移酶(Promega)后混勻，37 °C孵育5min后65 V5min ;然后以加上PolyA尾的cDNA為模板，PCR擴增抗體的輕、重鏈可變區基因。上游引物均為 OligodT，重鏈下游引物為(5’ - TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3，) (SEQ ID NO:118)和(5，- TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3’)(SEQ ID NO: 119)，輕鏈下游引物為(5，-ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3，)(SEQ ID NO: 120)。PCR 反應條件:95°C 5min ；95°C 30s,56°C 30s, 72°C Imin 40cycles ；72°C 7min ;PCR 產物連接到 PMD 18-T 載體后進行測序。測序得到的抗體輕鏈和重鏈可變區序列見附錄序列表。
[0054]基于已測序得到的抗體的DNA序列設計PCR引物，從而將完整輕鏈、重鏈信號肽和可變域以及小鼠IgGl恒定區與表達載體ρΤΜ5相連。
[0055]步驟6:在懸浮ΗΕΚ293宿主細胞系中瞬時表達抗GLP-1R的抗體
接種懸浮ΗΕΚ293或者CHO表達細胞系至轉瓶中，經過24h 37°C旋轉培養后被用于轉染。轉染過程中使用Polyethylenimine (PEI)作為轉染介質，將其與DNA混合后加入到細胞培養中。PEI和DNA的混合優選配比為1:1至5:1。細胞在接受PEI與DNA混合物后繼續37°C旋轉培養96h以上以表達抗原結合蛋白，其間向細胞培養中加入0.5%的胰蛋白胨作為表達需要的氨基酸源，最后收集細胞上清用于抗原結合蛋白質的純化分離。
[0056]步驟7:抗體人源化及優化
首先，將篩選所得的鼠源抗體輕、重鏈可變區序列，并使用NCBI的在線抗體可變區序列比對工具Ig Blast，搜索與輸入的抗體可變區序列同源的人源的抗體生殖細胞系基因序列(Ig Germline Gene sequence),并將除⑶R序列外，同源性最高的人源基因序列做為模板序列進行CDR嫁接，得到人源化抗體可變區序列，并外包合成人源化抗體輕、重鏈的基因。根據序列設計PCR引物，在合成序列的5’端和3’端引入合適的限制性內切酶位點，并通過PCR擴增后將其與人IgG2或者IgG4恒定區序列拼接后得到完整的重組人源化抗體序列。重組的抗體根據步驟6進行表達，并按照步驟4中的FACS技術驗證其針對GLP-1R的親和力。在保留了針對GLP-1R親和力的人源化抗體群中，遴選出親和力表現最優秀的抗體，并通過定點突變，對其可變區序列進行進一步的改造，更進一步提高其針對GLP-1R的親和力。
[0057]步驟8 =GLP-1人源化融合蛋白質的基因克隆與亞克隆
優化后的人源化抗體在輕鏈的N端或者C端與GLP-1及其衍生物序列進行融合組成GLP-1融合蛋白質，兩者的序列由肽接頭序列(LK)做為橋梁進行連接。信號肽-GLP-1-肽接頭的核苷酸序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，以合成基因為模板，PCR擴增“信號肽-GLPl-接頭”部分的序列，PCR 上游引物為(5，-CCACCATGGACTTTGGGCTGAGC-3，) (SEQID N0:121)，PCR 下游引物為(5，- AGAGCCGGTGGCAGAGCCAG-3’ ) (SEQ ID N0:122)，PCR 反應條件為:95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s 35cycles ；72°C 7min。另以人源化抗體的核苷酸序列為模板，擴增融合蛋白質的抗體部分的序列。
[0058]PCR 上游引物為(5，-CTGGCTCTGCCACCGGCTCTGCCATCCAGAT GACCCAGTCTCC-3，) (SEQ ID NO: 12 3) , PCR T 游弓丨物為(5，-ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3，) (SEQ ID NO: 124)，PCR 反應條件為:95°C 5min ；95°C30s, 56°C 30s, 72°C Imin 35cycles ；72°C 7min。然后通過 overlapping PCR將融合蛋白質核酸序列的“信號肽-GLP-1-肽接頭”部分與抗體部分連接，引物兩端添加Nhel和Notl的酶切位點，從而將完整的融合蛋白質序列與表達載體pTM5相連。overlapping PCR上游引物為(5’-CCGGCTAGCCACCATGGACTTTGGGCTGAGC-3，)(SEQ ID NO: 125)，下游引物為(5，-AGTGCGGCCGCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3’)(SEQ ID NO: 126)。PCR 反應條件:95°C5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin 35cycles ；72°C 7min ;PCR 產物連接到 PTM5 載體后進行測序。
[0059]步驟9:在懸浮HEK293宿主細胞系中瞬時表達GLP-1融合蛋白質。
[0060]接種HEK293懸浮細胞至轉瓶中，在轉染前換培養基。將包含融合蛋白質輕/重鏈基因的載體以 DNA 總量 0.5-1.5 μ g/ml 的濃度與 1.5-7.5 μ g/ml 的 Polyethylenimine(PEI)混合靜置15-25分鐘后，加入細胞培養中。24小時后，再向細胞培養加入0.5-1%的Trypton NI。培養5_10天后收取的上清中含有分泌表達的GLP-1融合蛋白質。
[0061]步驟10:在懸浮CHO宿主細胞系中穩定表達GLP-1融合蛋白質。
[0062]接種懸浮CHO細胞至6孔板中，通過步驟I中的轉染條件轉染融合蛋白質的表達載體。48小時后，加入300mg/ml的hygromycin (重鏈)和6mg/ml的puromycin (輕鏈)進行聯合篩選。在細胞出現大量凋亡后(死亡率>90%)，逐步降低抗生素濃度恢復剩余細胞的生長，后轉為轉瓶擴大培養，并隨后確認上清中抗體的表達。在隨后的培養基中保持減半的抗生素濃度以維持細胞對GLP-1融合蛋白質的穩定表達。
[0063]步驟11 =GLP-1融合蛋白質從細胞培養上清中的純化和制備
將細胞培養離心去除其中細胞，其上清經過偶聯蛋白G配基的親和層析柱后，用PH2.5-3.5的洗脫液將表達的GLP-1融合蛋白質從層析柱上洗脫。洗脫管中預置中和緩沖液及時中和洗脫液的低PH值。洗脫后收集的蛋白質溶液對PBS透析。
[0064]步驟12:報告基因實驗檢測GLP-1融合蛋白質在體外激活GLP-1受體的功能(見圖2)。
[0065]以每孔20000 個接種共表達 hGLPlR-CRE-Luciferase 的 CHO-DHFR-細胞至 96 孔細胞培養板，37°C培養過夜。第二天除去培養基上清，用無血清培養基清洗細胞表面兩次，吸去殘液，再加入100 μ I用無血清培養基稀釋純化抗體或GLP-1，37°C孵育4小時。刺激結束后，加入10yl P1mega的Bright Glo化學發光底物，最后將細胞裂解物轉移至白色96孔板,在Molecular Devices的SpectraMax L酶標儀上讀取相對發光強度。
[0066]步驟13:小鼠(ICR)禁食狀態下葡萄糖耐量實驗。
[0067]測定小鼠靜脈中葡萄糖耐量測定中評價本專利的GLP-1融合蛋白質(優選抗體GLP-1(A8G)-LK-L13H13))的效果。四組中每組包含至少三至五只小鼠。I組接受同體積PBS對照腹腔注射。II組接受15 μ g/只的單次腹腔注射。III組接受5 μ g/只的單次腹腔注射。在注射后，小鼠進行6-16 h的禁食處理，禁食完成后去小鼠血液樣本測定其基礎血糖濃度值。然后接受1.5g/kg濃度的葡萄糖灌胃。在葡萄糖灌胃后15，30，60和90分鐘采集其血液樣本以測定血糖濃度，見圖3。
[0068]步驟14:糖耐量實驗檢測GLP-1融合蛋白質在小鼠(C57BL)體內長效性(40h)。
[0069]測定小鼠靜脈中葡萄糖耐量測定中評價本專利的GLP-1融合蛋白質(優選抗體GLP-1 (A8G)-LK-L13H13))在小鼠體內的長效性。兩組中包含至少三至五只小鼠。I組接受同體積PBS對照腹腔注射。II組接受Myg/只濃度的單次腹腔注射。在注射后24 h，小鼠進行16 h的禁食處理，禁食完成后取小鼠血液樣本測定其基礎血糖濃度值。然后接受1.5g/kg濃度的葡萄糖灌胃。在葡萄糖灌胃后15，30，60和90分鐘采集其血液樣本以測定血糖濃度，見圖4。
[0070]步驟15 =GLP-1融合蛋白質降低二型糖尿病小鼠(db/db Mice)血糖濃度的長效性研究(72 h)。
[0071]在不同時間點測定二型糖尿病小鼠血糖濃度以評價本專利的GLP-1融合蛋白質(優選抗體GLP-1 (A8G)-LK-L13H13))在二型糖尿病小鼠體內降低其血糖濃度的長效性。兩組中每組包含至少六只小鼠。在注射開始前取小鼠血液樣本測定其基礎血糖濃度值。之后，I組接受同體積PBS對照腹腔注射，II組接受30 μ g/千克濃度的單次腹腔注射。在注射后I，4，6，24，48，72小時分別采集其血液樣本以測定兩組小鼠血糖濃度，見圖5。
[0072]步驟16 =GLP-1融合蛋白質減少二型糖尿病小鼠(db/db Mice)日進食量的長效性研究(120h)。
[0073]在對二型糖尿病小鼠日進食量改變的測定中評價本專利的GLP-1融合蛋白質(優選抗體GLP-1 (A8G)-LK-L13H13))在降低二型糖尿病小鼠進食水平方面的長效性。該步驟和步驟15在同一批小鼠上同步進行。兩組中每組包含至少六只小鼠。在步驟15的注射前3天起至注射后5天(120小時)，每日早晨同一時間點稱量每組小鼠日進食量，見圖6。
[0074]以上所述的實施例只是本發明的一種較佳的方案，并非對本發明作任何形式上的限制，在不超出權利要求所記載的技術方案的前提下還有其它的變體及改型。
【權利要求】
1.一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，其特征在于:所述抗體包含以下方案之一的氨基酸序列: a.選自以下序列之一的輕鏈⑶R3序列: 與選自L1-L13的輕鏈CDR3序列:SEQ ID NO: 46?SEQ ID NO: 53其中之一相差總共不超過三個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR3序列； b.選自以下序列之一的重鏈⑶R3序列: 與選自H1-H13的重鏈CDR3序列:SEQ ID NO: 20?SEQ ID NO: 27其中之一相差總共不超過四個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈CDR3序列； c.(a)的輕鏈⑶R3序列和(b)的重鏈⑶R3序列。
2.根據權利要求1所述的一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，其特征在于:所述抗體還包含以下方案的一種或幾種組合的氨基酸序列: a.選自以下之一的輕鏈⑶Rl序列: 與選自L1-L13的輕鏈CDRl序列:SEQ ID NO: 28?SEQ ID NO: 37其中之一相差不超過三個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDRl ； b.選自以下之一的輕鏈⑶R2序列: 與選自L1-L13的輕鏈CDR2序列:SEQ ID NO: 38?SEQ ID NO: 45其中之一相差不超過兩個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR2 ； c.選自以下之一的重鏈⑶Rl序列: 與選自H1-H13的重鏈CDRl序列:SEQ ID NO: 6?SEQ ID NO: 12其中之一相差不超過兩個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈⑶Rl ; d.選自以下之一的重鏈⑶R2: 與選自H1-H13的重鏈CDR2序列:SEQ ID NO: 13?SEQ ID NO: 19其中之一相差不超過三個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈序列。
3.一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，其特征在于:所述抗體包含以下方案之一: a.包含以下方案的一種或幾種的輕鏈可變結構域: 1.選自SEQID NO: 28?SEQ ID NO: 37其中之一的輕鏈CDRl序列； i1.選自SEQID NO: 38?SEQ ID NO: 45其中之一的輕鏈CDR2序列； ii1.選自SEQID NO: 46?SEQ ID NO: 53其中之一的輕鏈CDR3序列； b.包含以下方案的一種或幾種的重鏈可變結構域: 1.選自SEQID NO: 6?SEQ ID NO: 12其中之一的重鏈CDRl序列； i1.選自SEQID NO: 13?SEQ ID NO: 19其中之一的重鏈CDR2序列； ii1.選自SEQID NO: 20?SEQ ID NO: 27其中之一的重鏈CDR3序列； c.(a)的輕鏈可變結構域序列和(b)的重鏈可變結構域序列。
4.一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，其特征在于:所述抗體包含以下方案之一的氨基酸序列: a.選自以下方案之一的輕鏈可變結構域序列: 1.具有與選自L1-L13的輕鏈可變結構域序列:SEQ ID NO: 81，SEQ ID NO: 83，SEQID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:95，SEQ ID NO: 97，SEQ ID NO: 99，SEQ ID NO: 101，SEQ ID NO: 103，SEQ ID NO: 105 其中之一至少80%相同的序列的氨基酸； i1.與編碼L1-L13的輕鏈可變結構域序列的多聚核苷酸序列:SEQ ID NO: 80, SEQ IDNO: 82，SEQ ID NO: 84，SEQ ID NO: 86，SEQ ID NO: 88，SEQ ID NO: 90，SEQ ID NO: 92，SEQ ID NO: 94，SEQ ID NO: 96，SEQ ID NO: 98，SEQ ID NO: 100，SEQ ID NO: 102，SEQID NO: 104其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列編碼的氨基酸序列； b.選自以下的重鏈可變結構域序列: 1.與H1-H13 的重鏈可變結構域序列:SEQ ID NO: 55，SEQ ID NO: 57，SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQID NO: 71，SEQ ID NO: 73，SEQ ID NO: 75，SEQ ID NO: 77，SEQ ID NO: 79 其中之一至少80%相同的氨基酸序列； i1.與編碼H1-H13的重鏈可變結構域序列的多聚核苷酸序列:SEQID NO: 54, SEQ IDNO: 56，SEQ ID NO: 58，SEQ ID NO: 60，SEQ ID NO: 62，SEQ ID NO: 64，SEQ ID NO: 66，SEQ ID NO: 68，SEQ ID NO: 70，SEQ ID NO: 72，SEQ ID NO: 74，SEQ ID NO: 76，SEQ IDNO: 78其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列編碼的氨基酸序列； c.(a)的輕鏈可變結構域序列和(b)的重鏈可變結構域序列。
5.根據權利要求4所述的一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，其特征在于:所述抗體還包含以下方案之一的氨基酸序列: a.選自L1-L13 的輕鏈可變結構域序列:SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQID NO: 97，SEQ ID NO: 99，SEQ ID NO: 101，SEQ ID NO: 103，SEQ ID NO: 105 其中之一的輕鏈可變結構域序列； b.選自H1-H13 重鏈可變結構域序列:SEQ ID NO: 55，SEQ ID NO: 57，SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQID NO: 71，SEQ ID NO: 73，SEQ ID NO: 75，SEQ ID NO: 77，SEQ ID NO: 79 其中之一的重鏈可變結構域序列； c.a的輕鏈可變結構域序列和b的重鏈可變結構域序列。
6.根據權利要求5所述的一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，其特征在于:方案c中a的輕鏈可變結構域序列與b的重鏈可變結構域序列的組合選自以下之一:L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13。
7.根據權利要求6所述的一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，其特征在于:所述抗體還包含以下方案之一的氨基酸序列: a.SEQ ID NO: 106的輕鏈恒定區氨基酸序列； b.SEQ ID NO: 107的輕鏈恒定區氨基酸序列； c.SEQ ID NO: 108的重鏈恒定區氨基酸序列； d.SEQ ID NO: 109的重鏈恒定區氨基酸序列； e.SEQ ID NO: 106的輕鏈恒定區氨基酸序列和SEQ ID NO: 108的重鏈區氨基酸恒定序列； f.SEQ ID NO: 107的輕鏈恒定區氨基酸序列和SEQ ID NO: 108的重鏈恒定區氨基酸序列； g.SEQ ID NO: 106的輕鏈恒定區氨基酸序列和SEQ ID NO: 109的重鏈恒定區氨基酸序列； h.SEQ ID NO: 107的輕鏈恒定區氨基酸序列和SEQ ID NO: 109的重鏈恒定區氨基酸序列。
8.根據權利要求1或3或4所述的一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，其特征在于:所述抗體選自鼠源抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、Fab片段、F(fa’ )x片段、結構域抗體、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、IgG4抗體。
9.一種GLP-1融合蛋白質，其特征在于:所述GLP-1融合蛋白質由GLP-1和權利要求1或3或4所述抗體融合形成，其中GLP-1包含選自以下之一的氨基酸序列:SEQ ID NO: 1，SEQ ID NO: 2，SEQ ID NO: 3，SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO: 127。
10.根據權利要求9所述的GLP-1融合蛋白質，其特征在于=GLP-1通過N’ -R1-L-R2-C’、N’ -R2-L-R1-C’ 或者 N’ -R2_L-Rlr-C’ 的連接方式與權利要求1 或 3 或 4所述抗體的輕鏈和/或重鏈相融合； 其中L為肽接頭序列，其包含全長的、部分的或者重復的選自LKf LK3的氨基酸序列:SEQ ID NO: 110，SEQ ID NO: 111，SEQ ID NO: 112 其中之一的氨基酸序列； Rl為GLP-1的氨基酸序列； Rlr為GLP-1的反向氨基酸序列； R2為權利要求1或3或4所述抗體輕鏈或者重鏈的氨基酸序列； C’代表GLP-1融合蛋白質多肽鏈的羥基殘基端； N’代表GLP-1融合蛋白質多肽鏈的氨基殘基端。
11.一種多核苷酸，其特征在于:其編碼權利要求9的GLP-1融合蛋白質。
12.—種載體,其特征在于:其包含權利要求11的多核苷酸。
13.一種宿主細胞，其特征在于:其包含權利要求12的載體。
14.一種藥用組合物，其特征在于:其包含與藥用可接受載體混合的權利要求9的GLP-1融合蛋白質。
15.一種權利要求14的藥用組合物在制備用于預防或治療非胰島素依賴性糖尿病的藥物中的用途。
【文檔編號】A61P3/10GK104371019SQ201410349725
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年7月22日 優先權日:2013年8月13日
【發明者】張 成, 景書謙, 章華, 汪笑峰, 藥晨江 申請人:杭州鴻運華寧生物醫藥工程有限公司