抗感染人工韌帶的制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種抗感染人工韌帶的制備方法；具體包含下述步驟：將PET人工韌帶進行超聲波清洗去除表面污垢；對PET人工韌帶進行電暈處理；制備納米銀表面涂層溶液；對PET人工韌帶表面涂層；清洗并真空干燥。本發明制備方法制得的人工韌帶表面納米銀涂層厚度為50～300nm，能改善人工韌帶的生物相容性及骨傳導性，使人工韌帶具有抗菌、抗炎性能，使之在生物活性和力學性能方面滿足臨床醫學的要求。
【專利說明】抗感染人工韌帶的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學領域，涉及一種抗感染人工韌帶的制備方法，具體是采用銀 涂層改善PET材料人工韌帶的生物相容性及骨傳導性，使人工韌帶具有抗菌、抗炎性能。

【背景技術】
[0002] 聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET)人工韌帶作為膝關節交叉韌帶損傷重建的移植物 選擇，多項臨床研究已證明其術后的中短期療效及安全性較為滿意，但仍因組織相容性問 題，會出現滑膜炎、感染等并發癥問題；且關節滑液內的炎癥產物會破壞關節內結構，影響 腱骨愈合。這些成為導致膝關節交叉韌帶重建手術失敗的重要因素之一。因此，提高PET 材料的生物相容性，增加其抗菌、抗炎性能，減少人工韌帶移植物本身材料缺陷所產生的術 后移植部位炎癥問題尤為重要。
[0003] 在各種具有抗菌性能的無機金屬離子當中銀離子具有較高的抗菌性，銀粒子的尺 寸越小、分布越均勻，其抗菌活性也越強。銀離子具有與菌體中酶蛋白的巰基-SH迅速結合 的能力，使一些以此為必要基的酶失活而無法生存，從而達到殺滅細菌、修復組織、促進傷 口的愈合作用。同時也具有治療和預防細菌、真菌的作用。納米技術出現，使銀在納米狀態 下的殺菌能力產生了質的飛躍，極少的納米銀可產生強大的殺菌作用。從目前的研究開發 來看，納米銀具有安全性高、耐熱性好、抗菌范圍較廣、持續殺菌的有效期長、能夠促進傷口 的愈合、細胞的生長及受損細胞的修復，無任何毒性反應等優點。目前，不同制備方式（專 利：CN103722181A，CN103691967A，CN103691966A，CN103710390A 等）納米銀制備的各種具 有抗感染性醫療材料（專利：CN103505472A，CN203089546U，CN203089574U，CN203089573U 等）臨床應用很多，但是針對PET材料人工韌帶，仍沒有利用納米銀修飾人工韌帶的相關文 獻和專利報道。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于針對上述現有技術存在的缺陷，提供一種抗感染人工韌帶的制 備方法；主要解決人工韌帶在臨床應用中暴露會由于感染導致滑膜炎的問題。本發明通過 利用金屬銀的抗感染和抗炎效果，在人工韌帶表面進行銀涂層修飾，制備具有抗菌、抗炎性 能的新型PET人工韌帶，減少膝關節交叉韌帶重建術后滑膜炎、感染等并發癥，促進人工韌 帶在膝關節交叉韌帶重建中的腱骨愈合。
[0005] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0006] 第一方面，本發明涉及一種抗感染人工韌帶的制備方法，所述方法包含如下步 驟：
[0007] (1)將PET人工韌帶進行超聲波清洗去除表面污垢；
[0008] (2)對PET人工韌帶進行電暈處理；
[0009] (3)制備納米銀表面涂層溶液；
[0010] (4)對PET人工韌帶表面涂層；
[0011] (5)清洗并真空干燥；
[0012] (6)重復步驟（4)和步驟（5)，直至所述涂層厚度為50?500nm。
[0013] 優選地，所述電暈處理后，PET人工韌帶材料表面張力值為45?85mN/m。
[0014] 優選地，所述納米銀表面涂層溶液是將動物明膠溶液和硝酸銀溶液混勻得到反應 前體液，調整pH至7?12,加入抗壞血酸還原制得的。最后得粒徑為10?100nm納米銀涂 層溶液。所述調整pH采用1M NaOH進行調節。
[0015] 優選地，所述明膠溶液的濃度為10?50mg/ml，所述硝酸銀溶液的濃度為 10?100mM，所述硝酸銀溶液、動物明膠溶液、抗壞血酸三者的體積比為1 : (0.1? 10) : (0.01?10);所述混勻是在室溫?60°C條件下。
[0016] 更優選，所述硝酸銀溶液、動物明膠溶液、抗壞血酸三者的體積比為1 : (1? 5) : (0· 01 ?10)。
[0017] 優選地，所述抗壞血酸的濃度為10?lOOmM，用量為0. 1?100ml ;所述還原反應 的時間為30?120min。
[0018] 優選地，所述動物明膠是兔、豬、狗、牛明膠中的一種或者幾種的混合物。
[0019] 優選地，所述對PET人工韌帶材料表面涂層具體為：在37?70°C下，將步驟⑵處 理好的PET人工韌帶材料浸泡于步驟（3)制得的納米銀表面涂層溶液中10?30min。
[0020] 優選地，重復步驟⑷和步驟（5) 5?30次。
[0021] 第二方面，本發明涉及一種抗感染人工韌帶，所述抗感染人工韌帶表面的納米銀 涂層厚度為50?500nm。
[0022] 與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：
[0023] (1)納米銀涂層可改善人工韌帶的生物相容性、力學性能，使韌帶具有抗菌、抗炎 性能，促進腱骨愈合；
[0024] (2)該制備方法可在醫用的人工韌帶上形成較為均勻的涂層，可解決前期研究中 通過在材料表面應用直接人工涂覆的方法而造成的涂層不均勻、穩定性較差的問題；
[0025] (3)本制備過程簡單、條件溫和、節能環保、成本低廉，具有良好的市場應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、 目的和優點將會變得更明顯：
[0027] 圖1為新鮮所制備的抗感染人工韌帶對不同菌株的抑制效果對比圖；
[0028] 圖2為所制備的抗感染人工韌帶浸泡在人工模擬液中的Ag離子釋放率示意圖；
[0029] 圖3為所制備的抗感染人工韌帶不同時間段的浸出液對不同菌株抑制效果示意 圖；
[0030] 圖4為不同人工韌帶與骨髓間充質細胞共培養在不同時間段的細胞增殖效果對 比圖。

【具體實施方式】
[0031] 下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術 人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術 人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明 的保護范圍。
[0032] 本發明公開一種制備納米銀涂層修飾的人工韌帶方法。本發明方法操作簡單，條 件溫和，成本低且環境友好，納米銀涂層修飾后的人工韌帶涂層穩定性、抗菌、抗炎性和生 物相容明顯改善，是一種對目前人工韌帶技術改進的簡單方法，擁有巨大的市場應用價值。 具體如以下各實施例：
[0033] 實施例1
[0034] 在室溫條件下，以水為溶劑，將5ml50mmol/L的AgN03以及5ml25mg/L的豬明膠溶 液混合，調節pH值到8,然后加入lOOul新鮮制備10mM抗壞血酸溶液，在25°C下攪拌反應 30min，得到納米銀涂層溶液。
[0035] 取PET材料的人工韌帶先超聲清洗lOmin，超純水沖洗3遍，真空烘干，電暈處理 5min，得到表面張力值為65mNm的PET人工韌帶，真空干燥備用。
[0036] 在37°C條件下，將人工韌帶浸泡于前面獲得的納米銀涂層溶液中，攪拌反應 30min，使體系中納米涂層與人工韌帶表面充分結合，取出人工韌帶真空干燥，重復以上步 驟5次，通過掃描電鏡觀測，得到納米銀涂層厚度在50 ±6. 8nm的新型人工韌帶。并通過進 一步的體外抗菌實驗（圖1)，將受試菌按照在各自生長適宜條件下制備好的菌懸液，控制 茵液濃度為1〇 5?107CFU/mL，分裝50mL的三角瓶，每瓶各20mL菌懸液，分別加入預先滅好 菌的新型人工韌帶，同時設未做表面處理的人工韌帶作為陰性對照。37°C、150r/min的搖 床處理2h后，采用梯度稀釋平板菌落計數法計算菌懸液中活菌數。根據處理后菌懸液活 菌數的差異，計算出材料對細菌的抑制率。如圖1，發現所制備的抗感染人工韌帶對大腸桿 菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和黑根霉菌都有很好的抑制效果，對于細菌的抑制率都 在90%以上，具有良好的抗感染效果。
[0037] 同時，通過將所制備的抗感染人工韌帶浸泡于人體模擬液進行體外穩定性實驗， 也發現所制備抗感染人工韌帶的涂層具有很好的穩定性，在實驗的24天之內，并沒出現涂 層崩解或者脫落的現實，同時對浸泡液也進行了銀離子濃度分析如圖2,發現所制備的抗感 染人工韌帶具有較長的緩釋周期，緩釋周期達24天，說明所制備人工韌帶的抗感染效果是 一個長時間的作用過程。
[0038] 隨后的對不同菌種的不同時間的抗菌實驗也證明，在實驗的24天周期內，人工韌 帶的浸泡液對不同菌種都有著良好的抑制效果如圖3。
[0039] 進一步通過相關的細胞實驗（圖4)，通過培養骨髓間充質（BMCS)細胞，DMEM培養 基生長至對數生長期，消化傳代，24h后待細胞貼壁長好，加入原始材料浸提液，同時設置未 表面處理PET人工韌帶浸提液處理細胞作為對照組。繼續培養不同時間后，通過MTT法測 定細胞在490nm的吸收值，也表明所制備的抗感染人工韌帶能有效促進骨髓間充質細胞粘 附和生長。
[0040] 實施例2
[0041] 在室溫條件下，以水為溶劑，將10mll0mmol/L的AgN03以及25ml25mg/L的兔明膠 溶液混合，調節pH值到8,然后加入100ul新鮮制備100mM抗壞血酸溶液，在60°C下攪拌反 應120min，得到納米銀涂層溶液。
[0042] 取PET材料的人工韌帶先超聲清洗5min，超純水沖洗3遍，真空烘干，電暈處理 20min，得到表面張力值為85mN/m的人工韌帶，真空干燥備用。
[0043] 在70°C條件下，將人工韌帶浸泡于前面獲得的納米銀涂層溶液中，攪拌反應 lOmin，使體系中納米涂層與PET材料表面充分結合，取出濾紙晾干，重復以上步驟30次，得 到納米銀涂層厚度在300±25. 6nm之間的新型人工韌帶。
[0044] 實施例3
[0045] 在室溫條件下，以水為溶劑，將10ml50mmol/L的AgN03以及50mll0mg/L的牛明膠 溶液混合，調節pH值到7,然后加入100ml新鮮制備80mM抗壞血酸溶液，在35°C下攪拌反 應30min，得到納米銀涂層溶液。
[0046] 取PET材料的人工韌帶先超聲清洗20min，超純水沖洗3遍，真空烘干，電暈處理 3min，得到表面張力值為45mN/m的PET韌帶，真空干燥備用。
[0047] 在37°C條件下，將人工韌帶浸泡于前面獲得的納米銀液中，攪拌反應，14min，使體 系中納米涂層與PET材料表面充分結合，取出濾紙晾干，重復以上步驟10次，得到納米銀涂 層厚度在1〇〇 ±18. 6nm之間的人工韌帶。
[0048] 實施例4
[0049] 在室溫條件下，以水為溶劑，將10mll00mmol/L的AgN03以及50ml50mg/L的牛明 膠溶液混合，調節pH值到12,然后加入50ml新鮮制備50mM抗壞血酸溶液，在45°C下攪拌 反應45min，得到納米銀涂層溶液。
[0050] 取PET材料的人工韌帶先超聲清洗20min，超純水沖洗3遍，真空烘干，電暈處理 lOmin，得到表面張力值為75mN/m的PET韌帶，真空干燥備用。
[0051] 在50°C條件下，將人工韌帶浸泡于前面獲得的納米銀液中，攪拌反應25min，使體 系中納米涂層與PET材料表面充分結合，取出濾紙晾干，重復以上步驟7次，得到納米銀涂 層厚度在70 ± 15. 6nm之間的人工韌帶。
[0052] 綜上所述，本發明采用銀涂層改善PET材料人工韌帶的生物相容性及骨傳導性， 使人工韌帶具有抗菌、抗炎性能，使之在生物活性和力學性能方面滿足臨床醫學的要求。
[0053] 以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明并不局限于上述 特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影 響本發明的實質內容。
【權利要求】
1. 一種抗感染人工韌帶的制備方法，其特征在于，所述方法包含如下步驟： (1) 將PET人工韌帶進行超聲波清洗去除表面污垢； (2) 對PET人工韌帶進行電暈處理； (3) 制備納米銀表面涂層溶液； (4) 對PET人工韌帶表面涂層； (5) 清洗并真空干燥； (6) 重復步驟（4)和步驟（5)，直至所述PET人工韌帶表面涂層厚度為50?300nm。
2. 根據權利要求1所述的抗感染人工韌帶的制備方法，其特征在于，所述電暈處理后， PET人工韌帶材料表面張力值為45?85mN/m。
3. 根據權利要求1所述的抗感染人工韌帶的制備方法，其特征在于，所述納米銀表面 涂層溶液是將動物明膠溶液和硝酸銀溶液混勻得到反應前體液，調整pH至7?12,加入抗 壞血酸還原制得的。
4. 根據權利要求3所述的抗感染人工韌帶的制備方法，其特征在于，所述明膠溶液的 濃度為10?50mg/ml，所述硝酸銀溶液的濃度為10?100mM ;所述硝酸銀溶液、動物明膠溶 液、抗壞血酸三者的體積比為1 : (0. 1?10) : (0. 01?10);所述混勻是在室溫?60°C 條件下攪拌進行的。
5. 根據權利要求3所述的抗感染人工韌帶的制備方法，其特征在于，所述抗壞血酸的 濃度為10?l〇〇mM，用量為〇. 1?l〇〇ml ;所述還原反應的時間為30?120min。
6. 根據權利要求3所述的抗感染人工韌帶的制備方法，其特征在于，所述動物明膠是 兔、豬、狗、牛明膠中的一種或幾種的混合物。
7. 根據權利要求1所述的抗感染人工韌帶的制備方法，其特征在于，所述對PET人工韌 帶材料表面涂層具體為：在37?70°C下，將步驟（2)處理好的PET人工韌帶材料浸泡于步 驟（3)制得的納米銀表面涂層溶液中10?30min。
8. 根據權利要求1所述的抗感染人工韌帶的制備方法，其特征在于，重復步驟（4)和步 驟（5)5?30次。
9. 一種根據權利要求1所述的抗感染人工韌帶的制備方法制得的抗感染人工韌帶，其 特征在于，所述抗感染人工韌帶表面的納米銀涂層厚度為50?500nm。
【文檔編號】A61L27/54GK104147642SQ201410367560
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】陳俊, 陳世益, 張鵬, 蔣佳, 吳子英, 陳天午, 萬方 申請人:復旦大學附屬華山醫院