蛋白激酶抑制劑在從非神經細胞制備神經細胞中的用途
【專利摘要】本發明提供了蛋白激酶抑制劑在從非神經細胞制備神經細胞中的用途，在存在蛋白激酶抑制劑時，對非神經細胞進行培養，不需要使用轉錄因子，即能夠有效誘導非神經細胞轉化為神經細胞。
【專利說明】蛋白激酶抑制劑在從非神經細胞制備神經細胞中的用途
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體地，涉及蛋白激酶抑制劑在從非神經細胞制備神 經細胞中的用途，更具體地，涉及蛋白激酶抑制劑在從非神經細胞制備神經細胞中的用途、 制備神經細胞的方法、用于制備神經細胞的試劑盒、試劑盒在從非神經細胞制備神經細胞 中的用途、神經細胞或其衍生物、神經細胞或其衍生物在制備藥物中的用途。
【背景技術】
[0002] 中樞神經系統紊亂（CNS)疾病，包括老年癡呆癥（Alzheimer' s Disease， AD)、帕金森病（Parkinsin' s Disease, Η))、肌萎縮性脊髓側索硬化癥（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS)、多發性硬化癥（Multiple Sclerosis，MS)和腦白質營養不良 (Leukodystrophies)等，在全世界范圍內，CNS疾病影響數百萬人的健康，而目前大部分 CNS疾病仍沒有有效的治療方法。在非人靈長類動物和嚙齒動物中，神經細胞移植已經被 證明是一種非常有前景的治療CNS疾病的方法。然而，細胞治療要求高質量且數量龐大的 神經細胞，但神經細胞的來源有限。在過去的二十年，已有多種方法用于在體外制備神經細 胞，包括從人胚胎干細胞（hESC)、誘導多能干細胞（hiPSC)和體細胞轉化獲得神經細胞。但 目前將制備獲得的神經細胞用于細胞移植仍存在多種限制，例如，從hESC轉化獲得的神經 細胞由于存在少量未轉化的hESC而存在致瘤危險，同時由于異體移植而存在免疫排斥問 題，hiPSC雖然可以從特定患者獲得而減輕免疫排斥問題，但其和hESC-樣，存在安全性問 題。
[0003] 最近，從體細胞直接轉化獲得神經細胞吸引了眾多研究者的注意。在2010年， Wernig研究組首先提出采用轉錄因子可以將纖維細胞直接轉化為神經細胞。隨后研究者 證實了多種多樣的神經因子和微RNAs可以用于誘導纖維細胞-神經細胞轉化。最新的報 道表明過表達轉錄因子可以誘導老鼠纖維細胞重編程為能產生髓鞘的少突膠質前體細胞 (OPCs)。由此，在疾病模型和細胞治療的發展中，直接纖維細胞-OPCs轉化成為了一種可替 換hESC/hiPSC技術的方法。直接纖維細胞-OPCs轉化具有以下優點：不需要制備、擴增、分 化多能細胞的時間，誘導獲得的有絲分裂后期的神經細胞具有較低的致瘤性和畸胎瘤形成 可能。因而，直接從纖維細胞轉化獲得的神經細胞適合用于自體移植。然而，目前報道的從 纖維細胞直接轉化神經細胞的方法中均需要使用轉錄因子，這將使得轉化周期較長，且安 全性較差。
[0004] 因而，目前關于體外制備神經細胞的方法仍有待改善。
【發明內容】
[0005] 本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發明的 一個目的在于提出一種采用蛋白激酶抑制劑有效制備獲得安全性高、適于自體移植的神經 細胞的手段。
[0006] 在本發明的第一方面，本發明提供了蛋白激酶抑制劑在從非神經細胞制備神經細 胞中的用途。發明人驚奇地發現，在存在蛋白激酶抑制劑時，不需要使用轉錄因子，非神經 細胞即能夠有效轉化為神經細胞。
[0007] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制 劑、AKT抑制劑、PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑。由此，能夠有效誘導非神經細胞 轉化為神經細胞。
[0008] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制劑 Y27632、AKT/mTOR 抑制劑 Palomid 529、PI3K 抑制劑 LY294002、FAK 抑制劑 PF562271 以及 免疫抑制劑雷帕霉素。由此，能夠有效誘導非神經細胞轉化為神經細胞，且轉化率較高。
[0009] 根據本發明的實施例，所述神經細胞為選自少突膠質前體細胞、成熟少突膠質細 胞、神經元細胞、神經膠質細胞的至少一種。由此，制備獲得的神經細胞能夠有效用于自體 移植，治療中樞神經紊亂疾病以及脊髓損傷，且安全性高，不存在免疫排斥反應。
[0010] 根據本發明的實施例，所述非神經細胞為人類細胞，所述人類細胞為選自成纖維 細胞、上皮細胞、成人細胞和新生兒細胞的至少一種。由此，在存在蛋白激酶抑制劑時，能夠 快速有效地轉化為神經細胞。
[0011] 在本發明的第二方面，本發明提供了一種制備神經細胞的方法。根據本發明的實 施例，該方法包括：在存在蛋白激酶抑制劑時，對非神經細胞進行培養。發明人發現，利用本 發明的該方法，不需要使用轉錄因子，即能夠快速有效地制備獲得神經細胞，且獲得的神經 細胞適合用于自體移植，治療中樞神經紊亂疾病以及脊髓損傷，同時安全性高，不存在免疫 排斥反應。
[0012] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制 齊[J、AKT/mTOR抑制劑、PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑。由此，能夠有效誘導非神 經細胞轉化為神經細胞。
[0013] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制劑 Y27632、AKT/mTOR 抑制劑 Palomid 529、PI3K 抑制劑 LY294002、FAK 抑制劑 PF562271 以及 免疫抑制劑雷帕霉素。由此，能夠有效誘導非神經細胞轉化為神經細胞，且轉化率較高。
[0014] 根據本發明的實施例，所述神經細胞為選自少突膠質前體細胞、成熟少突膠質細 胞、神經元細胞、神經膠質細胞的至少一種。由此，制備獲得的神經細胞能夠有效用于自體 移植，治療中樞神經紊亂疾病以及脊髓損傷，且安全性高，不存在免疫排斥反應。
[0015] 根據本發明的實施例，所述非神經細胞為人類細胞，所述人類細胞為選自成纖維 細胞、上皮細胞、成人細胞和新生兒細胞的至少一種。由此，在存在蛋白激酶抑制劑時，能夠 快速有效地轉化為神經細胞。
[0016] 在本發明的第三方面，本發明提供了一種用于制備神經細胞的試劑盒。根據本發 明的實施例，該試劑盒包含：第一培養基，所述第一培養基包含：第一基礎培養基，蛋白激 酶抑制劑，腦原性神經營養因子（BDNF)，神經營養因子3(NT3)，丙戊酸鈉（VPA)，雙丁酰環 腺苷酸（dbcAMP)，以及視黃酸（Retinoic acid, RA)。其中，所述蛋白激酶抑制劑為選自下 列的至少一種：R〇CK抑制劑、AKT/mTOR抑制劑、PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑。 發明人發現，利用該試劑盒，能夠有效地將非神經細胞誘導轉化為神經細胞，且操作簡單、 方便快捷。
[0017] 根據本發明的實施例，本發明的試劑盒進一步包括：第二培養基，所述第二培養基 包含：第二基礎培養基，蛋白激酶抑制劑，N2細胞培養基添加劑（N-2)，B27細胞培養基添加 劑（B-27)，谷氨酰胺（Glutamax)，刺猬蛋白（SHH)，成纖維細胞生長因子（FGF2)，重組人血 小板衍生生長因子（PDGF-AA)，以及視黃酸；或/和第三培養基，所述第三培養基包含：第三 基礎培養基，蛋白激酶抑制劑，N2細胞培養基添加劑，B27細胞培養基添加劑，谷氨酰胺，刺 猬蛋白，頭發生素蛋白（Noggin)，雙丁酰環腺苷酸，胰島素樣生長因子（IGF)，神經營養因 子3,以及視黃酸。其中，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制劑、AKT/ mTOR抑制劑、PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑。由此，能夠有效獲得成熟的不同種 類的神經細胞。
[0018] 根據本發明的實施例，所述神經細胞為選自少突膠質前體細胞、成熟少突膠質細 胞、神經元細胞、神經膠質細胞的至少一種。由此，制備獲得的神經細胞能夠有效用于自體 移植，治療中樞神經紊亂疾病以及脊髓損傷，且安全性高，不存在免疫排斥反應。
[0019] 根據本發明的實施例，所述第一基礎培養基為神經細胞基礎培養基，所述第二基 礎培養基為DMEM/F12培養基，所述第三基礎培養基為DMEM/F12培養基。由此，有利于將非 神經細胞轉化為神經細胞。
[0020] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑為選自ROCK抑制劑Y27632、AKT/mT0R 抑制劑Palomid529、PI3K抑制劑LY294002、FAK抑制劑PF562271以及免疫抑制劑雷帕霉 素的至少一種，優選ROCK抑制劑Y27632。由此，能夠有效誘導非神經細胞轉化為神經細胞， 且轉化效率和轉化率較高。
[0021] 根據本發明的實施例，所述第一培養基包含：5μΜ-20μΜ的ROCK抑制劑Y27632， 5ng/ml - 20ng/ml的腦原性神經營養因子，20ng/ml - 80ng/ml的神經營養因子3,0· 5mM -1. 5mM的丙戊酸鈉，25 μ Μ-100 μ Μ的雙丁酰環腺苷酸，以及0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的視黃酸。根據 本發明的實施例，所述第二培養基包含：5 μ Μ - 20 μ Μ的ROCK抑制劑Υ27632, lx Ν2細胞 培養基添加劑，lx B27細胞培養基添加劑，lx谷氨酰胺，lOOng/ml - 400ng/ml的刺猬蛋白， 10ng/ml - 40ng/ml的成纖維細胞生長因子，10ng/ml - 40ng/ml的重組人血小板衍生生長 因子，以及〇. 5 μ Μ - 1 μ Μ的視黃酸。根據本發明的實施例，所述第三培養基包含：5 μ Μ _ 20μΜ的ROCK抑制劑Y27632，lx Ν2細胞培養基添加劑，lx Β27細胞培養基添加劑，lx谷 氨酰胺，l〇〇ng/ml - 400ng/ml的刺猬蛋白，20ng/ml - 80ng/ml的神經營養因子3,50ng/ ml - 200ng/ml 的頭發生素蛋白，50ng/ml - 200ng/ml 雙丁酰環腺苷酸，50ng/ml - 200ng/ml 胰島素樣生長因子，以及0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的視黃酸。由此，能夠快速有效地將非神經細胞直 接誘導轉化為神經細胞，且轉化率較高。
[0022] 根據本發明的實施例，所述第一培養基包含：10μ Μ的ROCK抑制劑Υ27632,10ng/ ml的腦原性神經營養因子，10ng/ml的神經營養因子3, ImM的丙戊酸鈉，50 μ Μ的雙丁酰環 腺苷酸，以及〇. 5 μ Μ的視黃酸。根據本發明的實施例，所述第二培養基包含：10 μ Μ的ROCK 抑制劑Y27632, lx N2細胞培養基添加劑，lx B27細胞培養基添加劑，lx谷氨酰胺，200ng/ ml的刺猬蛋白，20ng/ml的成纖維細胞生長因子，20ng/ml的重組人血小板衍生生長因子， 以及0. 5 μ Μ的視黃酸。根據本發明的實施例，所述第三培養基包含：10 μ Μ的ROCK抑制劑 Y27632, lx N2細胞培養基添加劑，lx B27細胞培養基添加劑，lx谷氨酰胺，200ng/ml的刺 猬蛋白，l〇〇ng/ml的頭發生素蛋白，100ng/ml的雙丁酰環腺苷酸，100ng/ml的胰島素樣生 長因子，l〇ng/ml的神經營養因子3,以及0. 5 μ Μ的視黃酸。由此，能夠快速有效地將非神 經細胞直接誘導轉化為神經細胞，轉化效率和轉化率較高，同時獲得的神經細胞能夠有效 用于自體細胞移植治療中樞神經系統紊亂疾病以及脊髓損傷，并且安全性高，不存在免疫 排斥反應。
[0023] 在本發明的第四方面，本發明提供了前面所述的試劑盒在從非神經細胞制備神經 細胞中的用途。發明人發現，利用前面所述的試劑盒能夠有效誘導非神經細胞轉化為神經 細胞，且獲得的神經細胞能夠有效用于自體細胞移植治療中樞神經系統紊亂疾病以及脊髓 損傷，并且安全性高，不存在免疫排斥反應。
[0024] 在本發明的第五方面，本發明提供了一種制備神經細胞的方法。根據本發明的實 施例，該方法包括以下步驟：（1)利用第一培養基，培養非神經細胞，其中，所述第一培養基 包含：第一基礎培養基，蛋白激酶抑制劑，腦原性神經營養因子，神經營養因子3,丙戊酸 鈉，雙丁酰環腺苷酸，以及視黃酸，其中，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK 抑制劑、AKT/mTOR抑制劑、PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑。利用本發明的該方 法，不需要使用轉錄因子，即能夠快速有效地從非神經細胞轉化獲得神經細胞，且制備獲得 的神經細胞能夠有效用于自體細胞移植治療中樞神經系統紊亂疾病以及脊髓損傷，并且安 全性高，不存在免疫排斥反應。
[0025] 根據本發明的實施例，本發明的制備神經細胞的方法進一步包括：(2)利用第二 培養基或第三培養基，培養經過第一培養基培養的非神經細胞，其中，所述第二培養基包 含：第二基礎培養基，蛋白激酶抑制劑，N2細胞培養基添加劑，B27細胞培養基添加劑，谷氨 酰胺，刺猬蛋白，成纖維細胞生長因子，重組人血小板衍生生長因子，以及視黃酸；所述第三 培養基包含：第三基礎培養基，蛋白激酶抑制劑，N2細胞培養基添加劑，B27細胞培養基添 加劑，谷氨酰胺，刺猬蛋白，頭發生素蛋白，雙丁酰環腺苷酸，胰島素樣生長因子，神經營養 因子3,以及視黃酸，其中，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制劑、AKT/ mTOR抑制劑、PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑。利用本發明的該方法，不需要使用 轉錄因子，即能夠快速有效地從非神經細胞轉化獲得神經細胞，且制備獲得的神經細胞能 夠有效用于自體細胞移植治療中樞神經系統紊亂疾病以及脊髓損傷，并且安全性高，不存 在免疫排斥反應。
[0026] 根據本發明的實施例，所述神經細胞為選自少突膠質前體細胞、成熟少突膠質細 胞、神經元細胞、神經膠質細胞的至少一種。由此，制備獲得的神經細胞能夠有效用于自體 移植，治療中樞神經紊亂疾病以及脊髓損傷，且安全性高，不存在免疫排斥反應。
[0027] 根據本發明的實施例，所述非神經細胞為人類細胞，所述人類細胞為選自成纖維 細胞、上皮細胞、成人細胞和新生兒細胞的至少一種。由此，在存在蛋白激酶抑制劑時，能夠 快速有效地轉化為神經細胞。
[0028] 根據本發明的實施例，所述第一基礎培養基為神經細胞基礎培養基，所述第二基 礎培養基為DMEM/F12培養基，所述第三基礎培養基為DMEM/F12培養基。由此，有利于將非 神經細胞轉化為神經細胞。
[0029] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑為選自ROCK抑制劑Y27632、AKT/mT0R 抑制劑Palomid 529、PI3K抑制劑LY294002、FAK抑制劑PF562271以及免疫抑制劑雷帕霉 素的至少一種，優選ROCK抑制劑Y27632。由此，能夠有效誘導非神經細胞轉化為神經細胞， 且轉化效率和轉化率較高。
[0030] 根據本發明的實施例，所述第一培養基包含：所述第一培養基包含：5μ Μ-2〇μ Μ 的ROCK抑制劑Υ27632, 5ng/ml - 20ng/ml的腦原性神經營養因子，20ng/ml - 80ng/ml 的神經營養因子3,0. 5mM- 1. 5mM的丙戊酸鈉，25μΜ-100μΜ的雙丁酰環腺苷酸，以及 0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的視黃酸。根據本發明的實施例，所述第二培養基包含：5 μ Μ - 20 μ Μ的ROCK 抑制劑Y27632, lx N2細胞培養基添加劑，lx B27細胞培養基添加劑，lx谷氨酰胺，100ng/ ml - 400ng/ml的刺猬蛋白，10ng/ml - 40ng/ml的成纖維細胞生長因子，10ng/ml - 40ng/ml 的重組人血小板衍生生長因子，以及0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的視黃酸。根據本發明的實施例，所述 第三培養基包含：5 μ Μ - 20 μ Μ的ROCK抑制劑Υ27632, lx Ν2細胞培養基添加劑，lx Β27細 胞培養基添加劑，lx谷氨酰胺，l〇〇ng/ml - 400ng/ml的刺猬蛋白，20ng/ml - 80ng/ml的神 經營養因子3,50ng/ml - 200ng/ml的頭發生素蛋白，50ng/ml - 200ng/ml雙丁酰環腺苷酸， 50ng/ml - 200ng/ml胰島素樣生長因子，以及0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的視黃酸。由此，能夠快速有效 地將非神經細胞直接誘導轉化為神經細胞，且轉化率較高。
[0031] 根據本發明的實施例，所述第一培養基包含：1〇μ Μ的ROCK抑制劑Υ27632,10ng/ ml的腦原性神經營養因子，10ng/ml的神經營養因子3, ImM的丙戊酸鈉，50 μ Μ的雙丁酰環 腺苷酸，以及〇. 5 μ Μ的視黃酸。根據本發明的實施例，所述第二培養基包含：10 μ Μ的ROCK 抑制劑Y27632, lx N2細胞培養基添加劑，lx B27細胞培養基添加劑，lx谷氨酰胺，200ng/ ml的刺猬蛋白，20ng/ml的成纖維細胞生長因子，20ng/ml的重組人血小板衍生生長因子， 以及0. 5 μ Μ的視黃酸。根據本發明的實施例，所述第三培養基包含：10 μ Μ的ROCK抑制劑 Y27632, lx N2細胞培養基添加劑，lx B27細胞培養基添加劑，lx谷氨酰胺，200ng/ml的刺 猬蛋白，l〇〇ng/ml的頭發生素蛋白，100ng/ml的雙丁酰環腺苷酸，100ng/ml的胰島素樣生 長因子，l〇ng/ml的神經營養因子3,以及0. 5 μ Μ的視黃酸。由此，能夠快速有效地將非神 經細胞直接誘導轉化為神經細胞，轉化效率和轉化率較高，同時獲得的神經細胞能夠有效 用于自體細胞移植治療中樞神經系統紊亂疾病以及脊髓損傷，并且安全性高，不存在免疫 排斥反應。
[0032] 在本發明的第六方面，本發明提供了一種神經細胞或其衍生物。根據本發明的實 施例，所述神經細胞是根據前面所述的方法獲得的。發明人發現，利用本發明的神經細胞或 其衍生物，能夠有效用于自體細胞移植治療中樞神經系統紊亂疾病以及脊髓損傷，并且安 全性高，不存在免疫排斥反應。
[0033] 在本發明的第七方面，本發明提供了前面所述的神經細胞或其衍生物在制備藥物 中的用途，所述藥物用于治療中樞神經系統紊亂疾病以及脊髓損傷。
[0034] 根據本發明的實施例，所述中樞神經系統紊亂疾病為選自阿爾茨海默病、帕金森 病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、多發性硬化癥和腦白質營養不良的至少一種。由此，治療效 果較佳。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0035] 圖1顯示了根據本發明的實施例1，部分篩選實驗結果，其中，
[0036] 圖1Α為篩選過程的流程示意圖，
[0037] 圖1Β為培養7天時，對照組和實驗組細胞的照片，
[0038] 圖1C為培養7天時，對照組和實驗組的轉化率結果；
[0039] 圖2顯示了根據本發明的實施例3, iOPCs和iOLs的免疫檢測結果，其中，
[0040] 圖2A為分化培養前的iOPCs的免疫染色實驗結果，
[0041] 圖2B為分化培養后所得到的iOLs的免疫染色實驗結果；
[0042] 圖3顯示了根據本發明的實施例4, western印跡分析和免疫染色實驗檢測結果， 其中，
[0043] 圖3A為western印跡分析檢測結果，
[0044] 圖3B為iOPCs免疫染色實驗檢測結果，
[0045] 圖3C為iOLs免疫染色實驗檢測結果；
[0046] 圖4顯示了根據本發明的實施例5,微陣列分析結果圖，其中，
[0047] 圖4A為iOPCs、人類腦源性OPCs、iOLs和親本成纖維細胞之間的基因差異表達譜，
[0048] 圖4B為iOPCs、人類腦源性OPCs、iOLs和親本成纖維細胞之間差異表達基因的聚 類分析結果；
[0049] 圖5顯示了根據本發明的實施例6,免疫組織化學檢測結果，其中，
[0050] 圖5A為注射iOPCs位點的同一腦組織切片的免疫熒光結果圖和H&E染色結果圖，
[0051] 圖5B為注射iOPCs位點腦組織切片的免疫染色結果圖，
[0052] 圖5C為注射iOPCs位點腦組織切片的共聚焦顯微鏡照片；
[0053] 圖6顯示了根據本發明的實施例7, MR90纖維細胞轉化得到的神經元細胞的免疫 染色實驗結果圖；
[0054] 圖7顯示了根據本發明的實施例7, MR90纖維細胞轉化得到的神經元細胞的電生 理學檢測結果，其中，
[0055] 圖7a為從-60mV開始，以10mV的增幅對細胞施加電壓至+60mV過程中記錄的電 流軌跡（上圖）及鈉電流和電壓之間的關系（下圖），
[0056] 圖7b為當電壓在500ms內從-80mV增加至+60mV的過程中，記錄得到的膜電流的 軌跡，
[0057] 圖7c為保持電壓為-80mV時，記錄得到的自發的突觸電流的軌跡；以及
[0058] 圖8顯示了根據本發明的實施例7, MR90纖維細胞轉化得到的神經膠質細胞的免 疫染色實驗結果圖。
【具體實施方式】
[0059] 下面詳細描述本發明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發 明，而不能理解為對本發明的限制。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文 獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均 為可以通過市購獲得的常規產品。
[0060] 在本發明的第一方面，本發明提供了蛋白激酶抑制劑在從非神經細胞制備神經細 胞中的用途。發明人驚奇地發現，在存在蛋白激酶抑制劑時，不需要使用轉錄因子，非神經 細胞即能夠有效轉化為神經細胞。
[0061] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制 劑、AKT抑制劑、PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑。由此，能夠有效誘導非神經細胞 轉化為神經細胞。
[0062] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制劑 Y27632、AKT/mTOR 抑制劑 Palomid 529、PI3K 抑制劑 LY294002、FAK 抑制劑 PF562271 以及 免疫抑制劑雷帕霉素。由此，能夠有效誘導非神經細胞轉化為神經細胞，且轉化率較高。 [0063] 根據本發明的實施例，所述神經細胞為選自少突膠質前體細胞、成熟少突膠質細 胞、神經元細胞、神經膠質細胞的至少一種。由此，制備獲得的神經細胞能夠有效用于自體 移植，治療中樞神經紊亂疾病以及脊髓損傷，且安全性高，不存在免疫排斥反應。
[0064] 根據本發明的實施例，所述非神經細胞為人類細胞，所述人類細胞為選自成纖維 細胞、上皮細胞、成人細胞和新生兒細胞的至少一種。由此，在存在蛋白激酶抑制劑時，能夠 快速有效地轉化為神經細胞。
[0065] 在本發明的第二方面，本發明提供了一種制備神經細胞的方法。根據本發明的實 施例，該方法包括：在存在蛋白激酶抑制劑時，對非神經細胞進行培養。發明人發現，利用本 發明的該方法，不需要使用轉錄因子，即能夠快速有效地制備獲得神經細胞，且獲得的神經 細胞適合用于自體移植，治療中樞神經紊亂疾病以及脊髓損傷，同時安全性高，不存在免疫 排斥反應。
[0066] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制 齊[J、AKT/mTOR抑制劑、PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑。由此，能夠有效誘導非神 經細胞轉化為神經細胞。
[0067] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制劑 Y27632、AKT/mTOR 抑制劑 Palomid 529、PI3K 抑制劑 LY294002、FAK 抑制劑 PF562271 以及 免疫抑制劑雷帕霉素。由此，能夠有效誘導非神經細胞轉化為神經細胞，且轉化率較高。 [0068] 根據本發明的實施例，所述神經細胞為選自少突膠質前體細胞、成熟少突膠質細 胞、神經元細胞、神經膠質細胞的至少一種。由此，制備獲得的神經細胞能夠有效用于自體 移植，治療中樞神經紊亂疾病以及脊髓損傷，且安全性高，不存在免疫排斥反應。
[0069] 根據本發明的實施例，所述非神經細胞為人類細胞，所述人類細胞為選自成纖維 細胞、上皮細胞、成人細胞和新生兒細胞的至少一種。由此，在存在蛋白激酶抑制劑時，能夠 快速有效地轉化為神經細胞。
[0070] 在本發明的第三方面，本發明提供了一種用于制備神經細胞的試劑盒。根據本發 明的實施例，該試劑盒包含：第一培養基，所述第一培養基包含：第一基礎培養基，蛋白激 酶抑制劑，腦原性神經營養因子，神經營養因子3,丙戊酸鈉，雙丁酰環腺苷酸，以及視黃酸。 其中，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制劑、AKT/mTOR抑制劑、PI3K抑 制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑。發明人發現，利用該試劑盒，能夠有效地將非神經細胞 誘導轉化為神經細胞，且操作簡單、方便快捷。
[0071] 根據本發明的實施例，所述第一基礎培養基為神經細胞基礎培養基，
[0072] 根據本發明的實施例，所述第一培養基包含：5μΜ-20μΜ的ROCK抑制劑Y27632， 5ng/ml - 20ng/ml的腦原性神經營養因子，20ng/ml - 80ng/ml的神經營養因子3,0· 5mM -1. 5mM的丙戊酸鈉，25 μ Μ-100 μ Μ的雙丁酰環腺苷酸，以及0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的視黃酸。由此， 能夠快速有效地將非神經細胞直接誘導轉化為神經細胞，且轉化率較高。
[0073] 根據本發明的實施例，所述第一培養基包含：10μ Μ的ROCK抑制劑Υ27632,10ng/ ml的腦原性神經營養因子，10ng/ml的神經營養因子3, ImM的丙戊酸鈉，50 μ Μ的雙丁酰環 腺苷酸，以及0. 5 μ Μ的視黃酸。由此，能夠快速有效地將非神經細胞直接誘導轉化為神經 細胞，轉化效率和轉化率較高，同時獲得的神經細胞能夠有效用于自體細胞移植治療中樞 神經系統紊亂疾病以及脊髓損傷，并且安全性高，不存在免疫排斥反應。
[0074] 根據本發明的實施例，本發明的試劑盒進一步包括：第二培養基，所述第二培養基 包含：第二基礎培養基，蛋白激酶抑制劑，Ν2細胞培養基添加劑，Β27細胞培養基添加劑，谷 氨酰胺，刺猬蛋白，成纖維細胞生長因子，重組人血小板衍生生長因子，以及視黃酸；或/和 第三培養基，所述第三培養基包含：第三基礎培養基，蛋白激酶抑制劑，Ν2細胞培養基添加 劑，Β27細胞培養基添加劑，谷氨酰胺，刺猬蛋白，頭發生素蛋白，雙丁酰環腺苷酸，胰島素樣 生長因子，神經營養因子3,以及視黃酸。其中，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一 種：ROCK抑制劑、AKT/mTOR抑制劑、ΡΙ3Κ抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑。由此，能夠 有效獲得成熟的不同種類的神經細胞。
[0075] 根據本發明的實施例，所述神經細胞為選自少突膠質前體細胞、成熟少突膠質細 胞、神經元細胞、神經膠質細胞的至少一種。由此，制備獲得的神經細胞能夠有效用于自體 移植，治療中樞神經紊亂疾病以及脊髓損傷，且安全性高，不存在免疫排斥反應。
[0076] 根據本發明的實施例，所述第二基礎培養基為DMEM/F12培養基，所述第三基礎培 養基為DMEM/F12培養基。由此，有利于將非神經細胞轉化為神經細胞。
[0077] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑為選自ROCK抑制劑Y27632、AKT/mT0R 抑制劑Palomid529、PI3K抑制劑LY294002、FAK抑制劑PF562271以及免疫抑制劑雷帕霉素 的至少一種，優選ROCK抑制劑Y27632。由此，能夠有效誘導非神經細胞轉化為神經細胞，且 轉化效率和轉化率較高。
[0078] 根據本發明的實施例，所述第二培養基包含：5μΜ-20μΜ的ROCK抑制劑Y27632， lx N2細胞培養基添加劑，lx B27細胞培養基添加劑，lx谷氨酰胺，100ng/ml - 400ng/ml 的刺猬蛋白，l〇ng/ml - 40ng/ml的成纖維細胞生長因子，10ng/ml - 40ng/ml的重組人血 小板衍生生長因子，以及0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的視黃酸。根據本發明的實施例，所述第三培養 基包含：5μΜ-20μΜ的ROCK抑制劑Y27632，lx Ν2細胞培養基添加劑，lx Β27細胞培養 基添加劑，lx谷氨酰胺，l〇〇ng/ml - 400ng/ml的刺猬蛋白，20ng/ml - 80ng/ml的神經營養 因子3,50ng/ml - 200ng/ml的頭發生素蛋白，50ng/ml - 200ng/ml雙丁酰環腺苷酸，50ng/ ml - 200ng/ml胰島素樣生長因子，以及0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的視黃酸。由此，能夠快速有效地將 非神經細胞直接誘導轉化為神經細胞，且轉化率較高。
[0079] 根據本發明的實施例，所述第二培養基包含：10 μ Μ的ROCK抑制劑Υ27632, lx Ν2 細胞培養基添加劑，lx B27細胞培養基添加劑，lx谷氨酰胺，200ng/ml的刺猬蛋白，20ng/ ml的成纖維細胞生長因子，20ng/ml的重組人血小板衍生生長因子，以及0. 5 μ Μ的視黃酸。 根據本發明的實施例，所述第三培養基包含：1〇 μ Μ的ROCK抑制劑Υ27632, lx Ν2細胞培養 基添加劑，lx B27細胞培養基添加劑，lx谷氨酰胺，200ng/ml的刺猬蛋白，100ng/ml的頭發 生素蛋白，l〇〇ng/ml的雙丁酰環腺苷酸，100ng/ml的胰島素樣生長因子，10ng/ml的神經營 養因子3,以及0. 5 μ Μ的視黃酸。由此，能夠快速有效地將非神經細胞直接誘導轉化為神經 細胞，轉化效率和轉化率較高，同時獲得的神經細胞能夠有效用于自體細胞移植治療中樞 神經系統紊亂疾病以及脊髓損傷，并且安全性高，不存在免疫排斥反應。
[0080] 在本發明的第四方面，本發明提供了前面所述的試劑盒在從非神經細胞制備神經 細胞中的用途。發明人發現，利用前面所述的試劑盒能夠有效誘導非神經細胞轉化為神經 細胞，且獲得的神經細胞能夠有效用于自體細胞移植治療中樞神經系統紊亂疾病以及脊髓 損傷，并且安全性高，不存在免疫排斥反應。
[0081] 在本發明的第五方面，本發明提供了一種制備神經細胞的方法。根據本發明的實 施例，該方法包括以下步驟：
[0082] (1)利用第一培養基，培養非神經細胞。
[0083] 根據本發明的實施例，第一培養基包含：第一基礎培養基，蛋白激酶抑制劑，腦原 性神經營養因子，神經營養因子3,丙戊酸鈉，雙丁酰環腺苷酸，以及視黃酸。
[0084] 根據本發明的實施例，第一基礎培養基的種類不受特別限制，只要能夠有利于誘 導非神經細胞轉化為神經細胞，本領域技術人員可以根據實際情況靈活選擇。根據本發明 的實施例，第一基礎培養基為神經細胞基礎培養基。由此，有利于將非神經細胞轉化為神經 細胞。
[0085] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制 齊IJ、AKT/mTOR抑制劑、PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑。
[0086] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑可以為選自ROCK抑制劑Y27632、AKT/ mTOR抑制劑Palomid 529、PI3K抑制劑LY294002、FAK抑制劑PF562271以及免疫抑制劑雷 帕霉素的至少一種，優選ROCK抑制劑Y27632。由此，能夠有效誘導非神經細胞轉化為神經 細胞，且轉化效率和轉化率較高。
[0087] 根據本發明的實施例，所述第一培養基包含：所述第一培養基包含：5μΜ_20μΜ 的ROCK抑制劑Υ27632, 5ng/ml - 20ng/ml的腦原性神經營養因子，20ng/ml - 80ng/ml的神 經營養因子3,0. 5mM- 1. 5mM的丙戊酸鈉，25μΜ-100μ Μ的雙丁酰環腺苷酸，以及0. 5μ Μ-? μ Μ 的視黃酸。由此，能夠快速有效地將非神經細胞直接誘導轉化為神經細胞，且轉化率較 高，如果各成分的濃度過高或過低轉化效果均不理想。
[0088] 根據本發明的一個具體示例，所述第一培養基包含：10 μ Μ的ROCK抑制劑Υ27632， 10ng/ml的腦原性神經營養因子，10ng/ml的神經營養因子3, ImM的丙戊酸鈉，50 μ Μ的雙丁 酰環腺苷酸，以及〇. 5 μ Μ的視黃酸。由此，非神經細胞能夠在最適合的條件下逐漸轉化為 神經細胞，轉化效率和轉化率較高，同時獲得的神經細胞能夠有效用于自體細胞移植治療 中樞神經系統紊亂疾病以及脊髓損傷，并且安全性高，不存在免疫排斥反應。
[0089] 根據本發明的實施例，所述非神經細胞為人類細胞，所述人類細胞為選自成纖維 細胞、上皮細胞、成人細胞和新生兒細胞的至少一種。由此，在存在蛋白激酶抑制劑時，能夠 快速有效地轉化為神經細胞。
[0090] (2)利用第二培養基或第三培養基，培養經過第一培養基培養的非神經細胞，；
[0091] 根據本發明的實施例，所述第二培養基包含：第二基礎培養基，蛋白激酶抑制劑， Ν2細胞培養基添加劑，Β27細胞培養基添加劑，谷氨酰胺，刺猬蛋白，成纖維細胞生長因子， 重組人血小板衍生生長因子，以及視黃酸。
[0092] 根據本發明的實施例，第二基礎培養基的種類不受特別限制，本領域技術人員可 以根據實際情況靈活選擇。根據本發明的實施例，所述第二基礎培養基為DMEM/F12培養 基。
[0093] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制 齊IJ、AKT/mTOR抑制劑、PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑。
[0094] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑為選自ROCK抑制劑Y27632、AKT/mT0R 抑制劑Palomid 529、PI3K抑制劑LY294002、FAK抑制劑PF562271以及免疫抑制劑雷帕霉 素的至少一種，優選ROCK抑制劑Y27632。由此，能夠有效誘導非神經細胞轉化為神經細胞， 且轉化效率和轉化率較高。
[0095] 根據本發明的實施例，第二培養基包含：5 μ Μ - 20 μ Μ的ROCK抑制劑Y27632, lx N2細胞培養基添加劑，lx B27細胞培養基添加劑，lx谷氨酰胺，lOOng/ml - 400ng/ml的刺 猬蛋白，l〇ng/ml - 40ng/ml的成纖維細胞生長因子，10ng/ml - 40ng/ml的重組人血小板衍 生生長因子，以及0. 5 μ Μ - 1 μ Μ的視黃酸。由此，能夠快速有效地將非神經細胞直接誘導 轉化為神經細胞，且轉化率較高。
[0096] 根據本發明的一個具體示例，第二培養基包含：10 μ Μ的ROCK抑制劑Υ27632， lx N2細胞培養基添加劑，lx B27細胞培養基添加劑，lx谷氨酰胺，200ng/ml的刺猬蛋白， 20ng/ml的成纖維細胞生長因子，20ng/ml的重組人血小板衍生生長因子，以及0. 5 μ Μ的視 黃酸。由此，非神經細胞能夠在最適合的條件下逐漸轉化為神經細胞，轉化效率和轉化率較 高，同時獲得的神經細胞能夠有效用于自體細胞移植治療中樞神經系統紊亂疾病以及脊髓 損傷，并且安全性高，不存在免疫排斥反應。
[0097] 根據本發明的實施例，所述第三培養基包含：第三基礎培養基，蛋白激酶抑制劑， Ν2細胞培養基添加劑，Β27細胞培養基添加劑，谷氨酰胺，刺猬蛋白，頭發生素蛋白，雙丁酰 環腺苷酸，胰島素樣生長因子，神經營養因子3,以及視黃酸。
[0098] 根據本發明的實施例，第三基礎培養基的種類不受特別限制，本領域技術人員可 以根據實際情況靈活選擇。根據本發明的實施例，所述第三基礎培養基為DMEM/F12培養 基。由此，有利于將非神經細胞轉化為神經細胞。
[0099] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制 齊IJ、AKT/mTOR抑制劑、PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑。
[0100] 根據本發明的實施例，所述蛋白激酶抑制劑為選自ROCK抑制劑Y27632、AKT/mT0R 抑制劑Palomid 529、PI3K抑制劑LY294002、FAK抑制劑PF562271以及免疫抑制劑雷帕霉 素的至少一種，優選ROCK抑制劑Y27632。由此，能夠有效誘導非神經細胞轉化為神經細胞， 且轉化效率和轉化率較高。
[0101] 根據本發明的實施例，第三培養基包含：5 μ Μ - 20 μ Μ的ROCK抑制劑Y27632, lx N2細胞培養基添加劑，lx B27細胞培養基添加劑，lx谷氨酰胺，lOOng/ml - 400ng/ml的刺 猬蛋白，20ng/ml - 80ng/ml的神經營養因子3, 50ng/ml - 200ng/ml的頭發生素蛋白，50ng/ ml - 200ng/ml雙丁酰環腺苷酸，50ng/ml - 200ng/ml胰島素樣生長因子，以及0. δμΜ-? μ Μ 的視黃酸。由此，能夠快速有效地將非神經細胞直接誘導轉化為神經細胞，且轉化率較 商。
[0102] 根據本發明的一個具體示例，第三培養基包含：10 μ Μ的ROCK抑制劑Υ27632， lx N2細胞培養基添加劑，lx B27細胞培養基添加劑，lx谷氨酰胺，200ng/ml的刺猬蛋白， 100ng/ml的頭發生素蛋白，100ng/ml的雙丁酰環腺苷酸，100ng/ml的胰島素樣生長因子， lOng/ml的神經營養因子3,以及0. 5 μ Μ的視黃酸。由此，非神經細胞能夠在最適合的條件 下逐漸轉化為神經細胞，轉化效率和轉化率較高，同時獲得的神經細胞能夠有效用于自體 細胞移植治療中樞神經系統紊亂疾病以及脊髓損傷，并且安全性高，不存在免疫排斥反應。
[0103] 根據本發明的實施例，所述神經細胞為選自少突膠質前體細胞、成熟少突膠質細 胞、神經元細胞、神經膠質細胞的至少一種。由此，制備獲得的神經細胞能夠有效用于自體 移植，治療中樞神經紊亂疾病以及脊髓損傷，且安全性高，不存在免疫排斥反應。
[0104] 利用本發明的該方法，不需要使用轉錄因子，即能夠快速有效地從非神經細胞轉 化獲得神經細胞，且制備獲得的神經細胞能夠有效用于自體細胞移植治療中樞神經系統紊 亂疾病以及脊髓損傷，并且安全性高，不存在免疫排斥反應。
[0105] 在本發明的第六方面，本發明提供了一種神經細胞或其衍生物。根據本發明的實 施例，所述神經細胞是根據前面所述的方法獲得的。發明人發現，利用本發明的神經細胞或 其衍生物，能夠有效用于自體細胞移植治療中樞神經系統紊亂疾病以及脊髓損傷，并且安 全性高，不存在免疫排斥反應。
[0106] 在本發明的第七方面，本發明提供了前面所述的神經細胞或其衍生物在制備藥物 中的用途，所述藥物用于治療中樞神經系統紊亂疾病以及脊髓損傷。
[0107] 根據本發明的實施例，中樞神經系統紊亂疾病的種類不受特別限制。根據本發明 的實施例，前面所述的藥物比較適合用于治療選自阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性脊髓 側索硬化癥、多發性硬化癥和腦白質營養不良等中樞神經紊亂疾病的至少一種。由此，治療 效果較佳。
[0108] 實施例1 :蛋白激酶抑制劑的篩選
[0109] 首先，用〇· lmg/ml多聚鳥氨酸溶液（sigma，P4957)包被細胞培養板至少3小 時，接著用高壓蒸汽處理過的純水洗板3次，每5分鐘一次，然后，加入含有2 μ g/ml纖 連蛋白（sigma, F0556)和 10 μ g/ml 層粘連蛋白（ROCHE, 11243217001)的 IX PBS 溶 液，500 μ 1/孔，并置于培養箱中過夜包被，隨后移除培養板中的溶液，并用基礎培養基 (DMEM 培養基（HyClone, SH30022)，10 % 胎牛血清（Fisher Scientific，SH3007003)， 10mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（CORNING, 25060-CL)，lx MEM NEAA(100X，GIBCO, 11140)，ImM 丙酮酸鈉（GIBC0, 25000)，lx 2-巰基乙醇（1000X，GIBC0, 21985)，lx 谷氨酰胺（100X， GIBC0, 35050)，雙抗）洗板，然后，以2X104個細胞/孔的密度接種來自真皮的成人成纖 維細胞系（購自ATCC，PCS-201-012)，用上述基礎培養基培養24小時，然后移除基礎培 養基，并用PBS溶液洗板一次，接著實驗組分別加入含有2 μ Μ不同蛋白激酶抑制劑（蛋 白激酶抑制劑庫，Calbiochem，Cat#539744、539745和539746)的神經誘導培養基（神 經元細胞培養基（ScienCell，1521)，10ng/ml腦源性神經營養因子（PR0SPEC，CYT-207)， 10ng/ml 神經營養因子 3 (PR0SPEC，CYT-257)，ImM 丙戊酸鈉（sigma, P4543)，50 μ Μ 雙丁 酰環腺苷酸（sigma, D0627)，雙抗，0· 5 μ Μ視黃酸（sigma, R2625)，2 μ Μ蛋白激酶抑制 劑），對照組加入不含蛋白激酶抑制劑的神經誘導培養基，繼續培養，每兩天換一次液， 培養過程中觀察細胞的形態，并在培養第7天時計算轉化率（轉化率=誘導得到的神經 細胞的數量/總細胞數量），部分篩選實驗結果見圖1，其中，圖1A為篩選過程的流程 示意圖，圖1B為培養7天時，對照組和實驗組細胞的照片，其中，左圖為對照組細胞的 照片，右圖為添加 Rock抑制劑Y-27632 (在本文中Rock抑制劑Y-27632與Y-27632可 以互換使用）的實驗組細胞的照片，圖1C為培養7天時，對照組和添加不同蛋白激酶 抑制劑的實驗組的轉化率測定結果，其中，control表示對照組。當細胞轉變為類神經 細胞形態后（大約接種成纖維細胞后7天左右），可以進一步用OPC(少突膠質前體細 胞）培養基（DMEM/F12(Invitrogen，11320)，lxN-2(R&Dsystems)，不含維他命A的lx B-27(Invitrogen), lx Glutamax(GIBCO, 35050), 200ng/ml SHH(R&D systems), 20ng/ml FGF2(R&D systems) ,20ng/ml FOGF-AACR&D systems),雙抗，10 μ M Y_27632(Enzo Life S ciences，ALX-270-333-M005)，0.5yM RA(sigma，R2625))繼續培養細胞。
[0110] 從圖1的結果可以看出，加入ROCK抑制劑Y-27632能夠高效地將來自真皮的成 人成纖維細胞誘導轉化為神經細胞，而未加蛋白激酶抑制劑的對照組則沒有觀察到纖維細 胞向神經細胞的轉化。特別需要指出的是，在培養的第3天至第7天，發明人觀察到在含 有ROCK抑制劑Υ-27632的神經誘導培養基中培養的一個成纖維細胞亞種群從典型的大、扁 平、呈紡錘形的成纖維細胞（圖1B左圖）轉化為小且多突起的神經細胞，即誘導少突膠質 前體細胞（i〇PCs)(圖1B右圖）。由圖1C可以看出，當利用含有ROCK抑制劑Y27632的培 養基培養成纖維細胞時，轉化率最高，達到80%左右。發明人選擇轉化率最高的5種蛋白激 酶抑制劑，即 ROCK 抑制劑 Y27632 (Y27632)、AKT/mTOR 抑制劑 Palomid 529 (P529)、PI3K 抑 制劑LY294002 (LY)、FAK抑制劑PF562271 (FAKi)以及免疫抑制劑雷帕霉素（）進行后續相 關試驗。
[0111] 實施例2
[0112] 采用與實施例1相同的方法，分別利用ROCK抑制劑Y27632、AKT抑制劑Palomid 529、PI3K抑制劑LY294002、FAK抑制劑PF562271以及免疫抑制劑雷帕霉素誘導人成纖維 細胞系MR90和WI38。結果表明，經神經誘導培養基培養一段時間后，在兩種細胞系中，均 有成纖維細胞轉化為少突膠質前體細胞，采用ROCK抑制劑Y27632誘導IMR90細胞的照片 及轉化率結果見圖1。
[0113] 實施例3
[0114] 在本實施例中，對實施例1中誘導得到的i〇PCs能否分化為成熟少突角質細胞進 行評估，具體如下：
[0115] 利用不含生長因子并添加甲狀腺激素（一種已知的少突膠質細胞分化誘導劑） 的成熟培養基（1〇μΜ 的 ROCK抑制劑 Y27632(Enzo Life Sciences，ALX-270-333-M005)， lx N2細胞培養基添加劑，lx B27細胞培養基添加劑，lx谷氨酰胺，200ng/ml的刺 猬蛋白，l〇〇ng/ml的頭發生素蛋白（R&D systems)，100ng/ml的雙丁酉先環腺苷酸 (sigma, D0627)，100ng/ml的胰島素樣生長因子（R&D systems)，10ng/ml的神經營養因子 3 (PR0SPEC，CYT-257)，以及0. 5 μ Μ的視黃酸（sigma, R2625))對實施例1中利用含有2 μ Μ ROCK抑制劑Υ27632的神經誘導培養基培養7天后所得到的iOPCs進行分化培養，得到 iOLs (誘導少突膠質細胞），并對分化培養前后的iOPCs和iOLs分別進行免疫染色實驗。具 體如下：
[0116] 在誘導轉化的前一天，將5X104個成纖維細胞接種于包被的玻璃蓋玻片上， 采用與實施例1相同的方法進行誘導轉化，經過誘導轉化后，于室溫條件下，將得到的 iOPCs在含有4 %多聚甲醛的PBS溶液中固定20分鐘，然后在含有0.2 %聚乙二醇辛 基苯基醚和10 %羊血清（NGS)的PBS溶液中透性化30分鐘，接著于4攝氏度下，在含 有 10% NGS 和一抗（鼠抗-04(Millipore, 1:50)、兔抗-NF(Sigma-Aldrich, 1:1000)、鼠 抗-A2B5 (Mi 11 ipore, 1:50)、MBP (1:100, Covance ;1:100, Abeam)，、MAG(Mi 11 ipore, 1:50)、 MOG(Millipore，1:50))的PBS溶液中過夜孵育。然后，用PBS溶液洗滌細胞三次，并在室溫 條件下，用抗兔或抗鼠二抗，Alexa Fluor-488 或 Alexa Fluor_594(l:500，Invitrogen)孵 育2小時。然后，利用免疫熒光顯微鏡或蔡司LSM 510META共聚焦顯微鏡觀察細胞。檢測 結果見圖2,其中，Merge表示重合圖，圖2A為分化培養前的iOPCs的免疫染色實驗結果，圖 2B為分化培養后所得到的iOLs的免疫染色實驗結果。
[0117] 圖2A的結果表明，80 %的成纖維細胞轉化為具有典型少突膠質細胞形態的04-陽 性細胞（即iOPCs)，進一步的，這些04-陽性細胞對另外兩個0PC標記A2B5 (少突膠質前 體細胞表面抗原A2B5)和S100i3 (神經膠質特異性蛋白）也呈陽性。相反，利用不含ROCK 抑制劑Y27632的相同誘導培養基培養成纖維細胞4周后，所得到的細胞仍保持典型的成 纖維細胞形態，免疫染色實驗表明該細胞對04 (少突膠質前體細胞表面抗原04)、A2B5和 S100i3呈陰性。上述結果表明，利用ROCK抑制劑Y27632能夠直接誘導成纖維細胞轉化為 iOPCs。圖2B的結果表明，進行分化培養3-7天，大約70 %的iOPCs分化成為具有典型少突 膠質細胞形態的細胞。并且，所得到的少突膠質細胞表達髓鞘堿性蛋白（MBP)，以及成熟少 突膠質細胞的特定標記：髓磷脂相關糖蛋白（MAG)和髓鞘少突膠質細胞糖蛋白（M0G)。由 此，說明ROCK抑制劑誘導得到的iOPCs能夠進一步分化為功能性成熟少突膠質細胞。
[0118] 實施例4
[0119] ROCK是屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶的AGC (蛋白激酶A/蛋白激酶G/蛋白激酶C)家 族的一種激酶，在哺乳動物（如人、大鼠、小鼠）中包括R0CK1和R0CK2。R0CK1主要在肺、 肝臟、脾臟、腎臟和睪丸表達，而R0CK2主要分布于腦部和心臟。為了測定Rho-ROCK通路是 否參與纖維細胞-少突膠質前體細胞轉化過程，檢測ROCK基因沉默對纖維細胞-少突膠質 前體細胞轉化的影響，具體如下：
[0120] 提供針對R0CK2基因的小發夾結構RNAs，包括shRNAl和shRNA2(Sigma-Aldrich， TRCN0000342532, TRCN0000342473)，然后將shRNAl和shRNA2分別轉入來自真皮的成人成 纖維細胞中，并對轉染后的細胞進行western印跡分析，接下來，利用不含蛋白激酶抑制劑 的神經誘導培養基對轉染后的細胞進行培養，培養7天后，得到iOPCs，接著采用與實施例3 相同的方法，對得到的iOPCs進行免疫染色實驗，接下來，利用成熟培養基對得到的iOPCs 進行分化培養，得到iOLs，然后采用與實施例3相同的方法，對得到的iOLs進行免疫染色實 驗。實驗結果見圖3,其中，圖3A為Western印跡分析檢測結果，其中，Tubulin表示微管蛋 白，Control表示對照組，圖3B為iOPCs免疫染色實驗檢測結果，圖3C為iOLs免疫染色實 驗檢測結果。
[0121] 由圖3A可以看出，轉染后的細胞中R0CK2顯著低表達，說明shRNAl和shRNA2 均能夠有效抑制R0CK2的表達，經過神經誘導培養基培養后，轉染后的細胞的轉化率約為 60-80%，與用ROCK抑制劑處理的成纖維細胞的轉化率基本相同。由圖3B可以看出，通過 R0CK2基因沉默而得到的iOPCs對GFP(綠色熒光蛋白）、04、A2B5和S100 β呈陽性。由圖 3C可以看出，經過分化培養，通過R0CK2基因沉默而得到的iOPCs能夠分化為具有典型少突 膠質細胞形態的細胞，且分化獲得的細胞（即iOLs)表達MBP、MAG和M0G。上述結果表明 R0CK2激酶參與成纖維細胞向神經細胞的轉化過程。
[0122] 實施例5
[0123] 發明人假設ROCK抑制劑通過調節一組神經轉錄因子而引起纖維細胞-0PC轉化， 為了分析Y27632處理得到的iOPCs、人類腦源性OPCs、iOLs和親本成纖維細胞之間的相 似性，發明人通過微陣列分析生成了全基因表達數據。其中，微陣列分析在華盛頓大學基 因組中心進行，具體步驟如下：利用Illumina HumanHT-12v4表達微珠芯片，并用生物素 標記提取自上述個細胞的mRNA樣品，然后進行直接雜交試驗，并用微珠陣列閱讀器掃描數 據。掃描得到的圖片使用Illumina Beadscan v3進行量化，將量化后的數據輸入Illumina GenomeStudio軟件并通過Illumina's quantile方法進行標準化，然后將去除背景后所得 到的標準化數據以excel形式輸出，隨后，基于平均信號將輸出的數據進行過濾，其中，設 置基線為50以便平均信號大于50的唯一基因可以用于后續的分析。選擇每一個基因的 最大和最小信號值，然后將兩者相除，只有相除結果值大于3(3倍差異表達）的基因被認 為是表達差異基因，然后，通過MeV軟件將得到的所有表達差異基因進行聚類分析。進一 步的，為了確定iOPCs、人類腦源性OPCs、iOLs和親本成纖維細胞之間的關系，分別對每個 樣品進行微陣列分析，將得到的數據基于平均信號進行過濾，且基線設置為50,以便提高分 辨率。為了檢驗0PC分化通路與無限增殖的相關性，將來自http://www. geneontology. org/，G0:0030182的所有0PC分化基因都與微陣列分析數據進行比對，并通過基于網絡的 Gorilla program(http://cbl_gorilla· cs. technion. ac. il/)進行基因富集分析。檢測結 果見圖4,其中，WT表示野生型。其中，圖4A為iOPCs、人類腦源性OPCs、iOLs和親本成纖 維細胞之間的基因差異表達譜，圖4B為iOPCs、人類腦源性OPCs、iOLs和親本成纖維細胞 之間差異表達基因的聚類分析結果。
[0124] 由圖4的結果可以看出，聚類分析顯示了 iOPCs和其親本成纖維細胞的基因表達 譜之間存在顯著差異（圖4A，表明iOPCs與其親本成纖維細胞明顯不同。表達差異基因聚 類分析顯示ROCK抑制劑誘導得到的iOPCs的轉錄譜與人類腦源性OPCs緊密聚集，而與其 親本成纖維細胞相距較遠（圖4A、圖4B)。通過分析4倍差異表達基因的微陣列數據，iOPCs 和腦源性OPCs在神經轉錄因子顯示出明顯的基因表達重疊。上述結果表明，在誘導轉化過 程中，一組成纖維細胞特定基因可能存在永久性降調節。綜合上述，表明基因轉移-分化消 除了大多數原始細胞的明顯表達印記，卻特別誘導0PC表型表達。
[0125] 實施例6
[0126] 將實施例1中經ROCK抑制劑Y27632處理得到的iOPCs移植進用環己酮草酰二腙 處理的小鼠的脫髓鞘腦胼胝體，評價iOPCs在體內的功能性和形成髓鞘的潛能，具體如下：
[0127] 給C57BL/6小鼠飼喂0. 2% (w/w)環己酮草酰二腙（一種銅螯合劑）。飼喂12周 環己酮草酰二腙，導致腦胼胝體新的內生OPCs損耗，并最終導致完全脫髓鞘。在飼喂12周 時，將小鼠分為3組，第一組將含有ROCK抑制劑誘導得到的iOPCs的PBS溶液4 μ 1注射入 環己酮草酰二腙小鼠的腦胼胝體的右側（η = 6,左側作為未移植的對照組，左側作為未移 植的對照組，其中，η表示小鼠數量），第二組將PBS溶液4μ 1注射入環己酮草酰二腙小鼠 的腦胼胝體的右側（η = 3,其中，η表示小鼠數量），第三組將含有親本成纖維細胞的PBS 溶液4μ 1注射入環己酮草酰二腙小鼠的腦胼胝體的右側（η = 3,左側作為未移植的對照 組，其中，η表示小鼠數量），注射細胞的濃度為25, 000個細胞/μ 1，注射位置的立體定向 坐標為 10. 98mm(前后軸），21. 75mm(側中軸），22. 25mm(垂直軸）（Copray et al.，2006 ; Sher et al.，2009)。移植后，停止對小鼠飼喂環己酮草酰二腙，進行正常飼養，以便避免環 己酮草酰二腙引起移植細胞變性。移植4周后，處死小鼠，并切除大腦。然后，對腦組織切片 進行免疫組織化學檢測（MBP染色），檢測結果見圖5,其中，NF表示神經絲蛋白，圖5A為注 射iOPCs位點的同一腦組織切片的免疫熒光結果圖和H&E染色結果圖，圖5B為注射iOPCs 位點腦組織切片的免疫染色結果圖，圖5C為注射iOPCs位點腦組織切片的共聚焦顯微鏡照 片。
[0128] 由圖5A可以看出，只有約20%的移植iOPCs存活，由圖5B可以看出，存活的iOPCs 進一步轉化為成熟的表達MBP的OLs，并能夠促進腦胼胝體軸突的髓鞘再生。由圖5C的共 聚焦顯微鏡照片可以看見MBP+管狀結構和神經絲共同包覆神經纖維的結構，表明移植的 iOPCs促進宿主軸突產生髓鞘。在未移植的部分沒有觀察到相同的結構。上述結果表明 ROCK抑制劑誘導得到的iOPCs可以在體內轉化為能夠生成髓鞘的少突膠質細胞。
[0129] 實施例7
[0130] 為了評價ROCK抑制劑直接誘導不同神經細胞的普遍應用價值，對誘導iOPCs 的方案進行了稍微調整，具體如下：用〇. lmg/ml多聚鳥氨酸溶液（sigma, P4957)包被 細胞培養板至少3小時，接著用高壓蒸汽處理過的純水洗板3次，每5分鐘一次，然后， 加入每孔加入500μ 1含有2μ g/ml纖連蛋白（sigma，R)556)和10μ g/ml層粘連蛋白 (R0CHE，11243217001)的IX PBS溶液，并置于培養箱中過夜包被，隨后移除培養板中的溶 液，并用基礎培養基洗板，然后，以2 X 104個細胞/孔的密度接種來自真皮的成人成纖維細 胞系（購自ATCC，PCS-201-012)，用上述基礎培養基培養24小時，然后移除基礎培養基，并 用PBS溶液洗板一次，接著加入含有ROCK抑制劑Y276325 μ Μ和mTOR抑制劑（P529, 2 μ M) 的神經誘導培養基繼續培養，培養3-7天，培養過程中，纖維細胞的形態逐漸轉化為類神經 細胞，然后，接著用成熟培養基或0PC培養基對得到的類神經細胞進行培養，得到誘導神經 元細胞（iNCs)和神經膠質細胞。進一步對誘導得到的神經元細胞（iNCs)和神經膠質細胞 進行免疫染色實驗和膜片鉗實驗。經Y27632和mTOR抑制劑誘導得到的iNCs的免疫染色 試驗結果見圖6,經Y27632和mTOR抑制劑誘導得到的iNCs的膜片鉗試驗結果見圖7,其 中，圖7a為從-60mV開始，以10mV的增幅對細胞施加電壓至+60mV過程中記錄的電流軌跡 (上圖）及鈉電流和電壓之間的關系（下圖），圖7b為當電壓在500ms內從-80mV增加至 +60mV的過程中，記錄得到的膜電流的軌跡，圖7c為保持電壓為-80mV時，記錄得到的自發 的突觸電流的軌跡，經Y27632和mTOR抑制劑誘導得到的神經膠質細胞的免疫染色試驗結 果見圖8。
[0131] 從上述實驗結果可知，發明人成功將成纖維細胞轉化為典型的神經元細胞和神 經膠質細胞，經Y27632和mTOR抑制劑誘導得到的神經元細胞和神經膠質細胞表現出各 自細胞類型典型的細胞形態和生物標記。例如，從圖6可以看出，誘導得到的神經元細 胞（iNCs)表達神經細胞特異性標記Tuj (微管相關蛋白）、MAP2 (微管相關蛋白2)以及 Synaptotagnin(突觸結合蛋白），從圖7的結果可以看出，誘導得到的神經元細胞表現出典 型的神經元細胞的電生理特性，從圖8可以看出，誘導得到的神經膠質細胞表達神經膠質 細胞特異性標記GFAP(膠質纖維酸性蛋白）。上述結果表明，蛋白激酶抑制劑能夠從非神經 細胞誘導生成各種神經細胞，例如神經元細胞、神經膠質細胞等。
[0132] 在本發明的描述中，需要理解的是，術語"第一"、"第二"僅用于描述目的，而不能 理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特征的數量。由此，限定有"第 一"、"第二"的特征可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。在本發明的描述中， "多個"的含義是兩個或兩個以上，除非另有明確具體的限定。
[0133] 在本說明書的描述中，參考術語"一個實施例"、"一些實施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特 點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不 必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任 一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技 術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結 合和組合。
[0134] 盡管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例 性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在本發明的范圍內可以對上述 實施例進行變化、修改、替換和變型。
【權利要求】
1. 蛋白激酶抑制劑在從非神經細胞制備神經細胞中的用途。
2. 根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少 一種：ROCK抑制劑、AKT/mTOR抑制劑、PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑， 任選地，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制劑Y27632、AKT/mTOR 抑制劑Palomid 529、PI3K抑制劑LY294002、FAK抑制劑PF562271以及免疫抑制劑雷帕霉 素， 任選地，所述神經細胞為選自少突膠質前體細胞、成熟少突膠質細胞、神經元細胞、神 經膠質細胞的至少一種， 任選地,所述非神經細胞為人類細胞，所述人類細胞為選自成纖維細胞、上皮細胞、成 人細胞和新生兒細胞的至少一種。
3. -種制備神經細胞的方法，其特征在于，包括： 在存在蛋白激酶抑制劑時，對非神經細胞進行培養。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少 一種：ROCK抑制劑、AKT/mTOR抑制劑、PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑， 任選地，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制劑Y27632、AKT/mTOR 抑制劑Palomid 529、PI3K抑制劑LY294002、FAK抑制劑PF562271以及免疫抑制劑雷帕霉 素， 任選地，所述神經細胞為選自少突膠質前體細胞、成熟少突膠質細胞、神經元細胞、神 經膠質細胞的至少一種， 任選地,所述非神經細胞為人類細胞，所述人類細胞為選自成纖維細胞、上皮細胞、成 人細胞和新生兒細胞的至少一種。
5. -種用于制備神經細胞的試劑盒，其特征在于，包含： 第一培養基，所述第一培養基包含： 第一基礎培養基， 蛋白激酶抑制劑， 腦原性神經營養因子， 神經營養因子3， 丙戊酸鈉， 雙丁酰環腺苷酸，以及 視黃酸， 其中，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制劑、AKT/mTOR抑制劑、 PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑。
6. 根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，進一步包含： 第二培養基，所述第二培養基包含： 第二基礎培養基， 蛋白激酶抑制劑， N2細胞培養基添加劑， B27細胞培養基添加劑， 谷氨酰胺， 刺猬蛋白， 成纖維細胞生長因子， 重組人血小板衍生生長因子，以及 視黃酸； 或/和 第三培養基，所述第三培養基包含： 第三基礎培養基， 蛋白激酶抑制劑， N2細胞培養基添加劑， B27細胞培養基添加劑， 谷氨酰胺， 刺猬蛋白， 頭發生素蛋白， 雙丁酰環腺苷酸， 胰島素樣生長因子， 神經營養因子3,以及 視黃酸， 其中，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制劑、AKT/mTOR抑制劑、 PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑， 任選地，所述神經細胞為選自少突膠質前體細胞、成熟少突膠質細胞、神經元細胞、神 經膠質細胞的至少一種， 任選地，所述第一基礎培養基為神經細胞基礎培養基，所述第二基礎培養基為DMEM/ F12培養基，所述第三基礎培養基為DMEM/F12培養基， 任選地，所述蛋白激酶抑制劑為選自ROCK抑制劑Y27632、AKT/mTOR抑制劑Palomid 529、PI3K抑制劑LY294002、FAK抑制劑PF562271以及免疫抑制劑雷帕霉素的至少一種，優 選ROCK抑制劑Y27632， 任選地，所述第一培養基包含： 5 μ Μ - 20 μ Μ 的 ROCK 抑制劑 Y27632， 5ng/ml - 20ng/ml的腦原性神經營養因子， 20ng/ml - 80ng/ml的神經營養因子3， 0. 5mM- 1. 5mM的丙戊酸鈉， 25 μ Μ-100 μ Μ的雙丁酰環腺苷酸，以及 0· 5 μ Μ - 1 μ Μ的視黃酸； 所述第二培養基包含： 5 μ Μ - 20 μ Μ 的 ROCK 抑制劑 Υ27632， lx N2細胞培養基添加劑， lx B27細胞培養基添加劑， lx谷氨酰胺， 100ng/ml - 400ng/ml 的刺猬蛋白， lOng/ml -40ng/ml的成纖維細胞生長因子， 10ng/ml - 40ng/ml的重組人血小板衍生生長因子，以及 0· 5 μ Μ - 1 μ Μ的視黃酸； 所述第三培養基包含： 5 μ Μ - 20 μ Μ 的 ROCK 抑制劑 Υ27632， lx N2細胞培養基添加劑， lx B27細胞培養基添加劑， lx谷氨酰胺， 100ng/ml - 400ng/ml 的刺猬蛋白， 20ng/ml - 80ng/ml的神經營養因子3， 50ng/ml - 200ng/ml的頭發生素蛋白， 50ng/ml - 200ng/ml雙丁酰環腺苷酸， 50ng/ml - 200ng/ml胰島素樣生長因子，以及 0· 5μΜ - ΙμΜ的視黃酸， 任選地，所述第一培養基包含： 10 μ Μ 的 ROCK 抑制劑 Υ27632， l〇ng/ml的腦原性神經營養因子， 10ng/ml的神經營養因子3， ImM的丙戊酸鈉， 50 μ Μ的雙丁酰環腺苷酸，以及 0. 5 μ Μ的視黃酸； 所述第二培養基包含： 10 μ Μ 的 ROCK 抑制劑 Υ27632， lx N2細胞培養基添加劑， lx B27細胞培養基添加劑， lx谷氨酰胺， 200ng/ml的刺猬蛋白， 20ng/ml的成纖維細胞生長因子， 20ng/ml的重組人血小板衍生生長因子，以及 0. 5 μ Μ的視黃酸； 所述第三培養基包含： 10 μ Μ 的 ROCK 抑制劑 Υ27632， lx N2細胞培養基添加劑， lx B27細胞培養基添加劑， lx谷氨酰胺， 200ng/ml的刺猬蛋白， 100ng/ml的頭發生素蛋白， 100ng/ml的雙丁酰環腺苷酸， 100ng/ml的胰島素樣生長因子， lOng/ml的神經營養因子3,以及 0. 5 μ Μ的視黃酸。
7. 權利要求5或6所述的試劑盒在從非神經細胞制備神經細胞中的用途。
8. -種制備神經細胞的方法，其特征在于，包括： (1) 利用第一培養基，培養非神經細胞， 其中， 所述第一培養基包含： 第一基礎培養基， 蛋白激酶抑制劑， 腦原性神經營養因子， 神經營養因子3， 丙戊酸鈉， 雙丁酰環腺苷酸，以及 視黃酸， 其中，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制劑、AKT/mTOR抑制劑、 PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑， 任選地，進一步包括： (2) 利用第二培養基或第三培養基，培養經過第一培養基培養的非神經細胞， 其中， 所述第二培養基包含： 第二基礎培養基， 蛋白激酶抑制劑， N2細胞培養基添加劑， B27細胞培養基添加劑， 谷氨酰胺， 刺猬蛋白， 成纖維細胞生長因子， 重組人血小板衍生生長因子，以及 視黃酸； 所述第三培養基包含： 第三基礎培養基， 蛋白激酶抑制劑， N2細胞培養基添加劑， B27細胞培養基添加劑， 谷氨酰胺， 刺猬蛋白， 頭發生素蛋白， 雙丁酰環腺苷酸， 胰島素樣生長因子， 神經營養因子3,以及 視黃酸， 其中，所述蛋白激酶抑制劑為選自下列的至少一種：ROCK抑制劑、AKT/mTOR抑制劑、 PI3K抑制劑、FAK抑制劑以及免疫抑制劑， 任選地，所述神經細胞為選自少突膠質前體細胞、成熟少突膠質細胞、神經元細胞、神 經膠質細胞的至少一種， 任選地,所述非神經細胞為人類細胞，所述人類細胞為選自成纖維細胞、上皮細胞、成 人細胞和新生兒細胞的至少一種， 任選地，所述第一基礎培養基為神經細胞基礎培養基，所述第二基礎培養基為DMEM/ F12培養基，所述第三基礎培養基為DMEM/F12培養基， 任選地，所述蛋白激酶抑制劑為選自ROCK抑制劑Y27632、AKT/mTOR抑制劑Palomid 529、PI3K抑制劑LY294002、FAK抑制劑PF562271以及免疫抑制劑雷帕霉素的至少一種，優 選ROCK抑制劑Y27632， 任選地， 所述第一培養基包含： 5 μ Μ - 20 μ Μ 的 ROCK 抑制劑 Y27632， 5ng/ml - 20ng/ml的腦原性神經營養因子， 20ng/ml - 80ng/ml的神經營養因子3， 0. 5mM- 1. 5mM的丙戊酸鈉， 25 μ Μ-100 μ Μ的雙丁酰環腺苷酸，以及 0· 5 μ Μ - 1 μ Μ的視黃酸； 所述第二培養基包含： 5 μ Μ - 20 μ Μ 的 ROCK 抑制劑 Υ27632， lx N2細胞培養基添加劑， lx B27細胞培養基添加劑， lx谷氨酰胺， 100ng/ml - 400ng/ml 的刺猬蛋白， 10ng/ml -40ng/ml的成纖維細胞生長因子， 10ng/ml - 40ng/ml的重組人血小板衍生生長因子，以及 0· 5 μ Μ - 1 μ Μ的視黃酸； 所述第三培養基包含： 5 μ Μ - 20 μ Μ 的 ROCK 抑制劑 Υ27632， lx N2細胞培養基添加劑， lx B27細胞培養基添加劑， lx谷氨酰胺， 100ng/ml - 400ng/ml 的刺猬蛋白， 20ng/ml - 80ng/ml的神經營養因子3， 50ng/ml - 200ng/ml的頭發生素蛋白， 50ng/ml - 200ng/ml雙丁酰環腺苷酸， 50ng/ml - 200ng/ml胰島素樣生長因子，以及 0· 5μΜ - ΙμΜ的視黃酸， 任選地，所述第一培養基包含： 10 μ Μ 的 ROCK 抑制劑 Υ27632， l〇ng/ml的腦原性神經營養因子， 10ng/ml的神經營養因子3， ImM的丙戊酸鈉， 50 μ Μ的雙丁酰環腺苷酸，以及 0. 5 μ Μ的視黃酸； 所述第二培養基包含： 10 μ Μ 的 ROCK 抑制劑 Υ27632， lx N2細胞培養基添加劑， lx B27細胞培養基添加劑， lx谷氨酰胺， 200ng/ml的刺猬蛋白， 20ng/ml的成纖維細胞生長因子， 20ng/ml的重組人血小板衍生生長因子，以及 0. 5 μ Μ的視黃酸； 所述第三培養基包含： 10 μ Μ 的 ROCK 抑制劑 Υ27632， lx N2細胞培養基添加劑， lx B27細胞培養基添加劑， lx谷氨酰胺， 200ng/ml的刺猬蛋白， 100ng/ml的頭發生素蛋白， 100ng/ml的雙丁酰環腺苷酸， 100ng/ml的胰島素樣生長因子， l〇ng/ml的神經營養因子3,以及 0. 5 μ Μ的視黃酸。
9. 一種神經細胞或其衍生物，其特征在于，所述神經細胞是根據權利要求3-4和8中任 一項所述的方法獲得的。
10. 權利要求9所述的神經細胞或其衍生物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療 中樞神經系統紊亂疾病以及脊髓損傷， 任選地，所述中樞神經系統紊亂疾病為選自阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性脊髓側 索硬化癥、多發性硬化癥和腦白質營養不良的至少一種。
【文檔編號】A61K35/12GK104195108SQ201410367556
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】魯曉華, 楊佳銀, 楊波 申請人:深圳市三啟生物技術有限公司