抗Ⅱ型糖尿病長效納米復合肽及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種抗Ⅱ型糖尿病長效納米復合肽及其制備方法與應用。以納米硒為載體，殼聚糖為連接，實現活性多肽與納米硒粒子的共價結合。本發明所制得的納米復合肽在生理環境中具有攜帶、保護和緩釋治療性多肽、有效延長治療性多肽半衰期的作用，發揮治療作用的有效劑量可顯著低于單獨使用治療性多肽的用藥量，且可發揮藥物緩釋、長效治療的生物學作用；克服了單獨使用治療性多肽時，由于分子量小，在體內易被快速代謝清除的缺點，可有效提高小分子治療性多肽的體內半衰期和生物利用度。本發明的納米復合肽可應用于制備治療如下疾病的藥物：糖尿病，高血糖癥。本發明的制備方法效率高、成本低，應用前景廣闊。
【專利說明】抗II型糖尿病長效納米復合肽及其制備方法與應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于納米生物【技術領域】，特別涉及一種抗II型糖尿病長效納米復合肽及其 制備方法與應用。

【背景技術】
[0002] 垂體腺苷酸環化酶激活肽（PACAP)是1990年被發現由腦垂體分泌的具有重要生 物學功能的神經多肽，是促胰液素/高血糖素 ΛΙΡ家族中的新成員。PACAP有兩種存在形 式：PACAP38,由38個氨基酸組成；PACAP27,由PACAP38氮端的27個氨基酸組成。PACAP通 過激活其特異的G蛋白偶聯受體，提高靶細胞cAMP等第二信使的濃度，從而發揮廣泛而重 要的生物學功能。PACAP有三類G蛋白偶聯受體：PAC1、VPAC1和VPAC2 ;三類受體在生物體 中分布不同，所起的作用也不相同。其中VPAC2型受體分布于胰島等組織，與能量代謝密切 相關，從臨床觀點看，作為VPAC2型受體特異激動劑的特定PACAP衍生物可有效地降低血液 葡萄糖水平，保護β-細胞功能及阻止疾病發展的潛力，且無低血糖癥風險，為公認的治療 Π 型糖尿病的新型藥物。
[0003] PACAP與VPAC2受體作用主要與腺苷酸環化酶（AC)藕聯：通過cAMP信號傳導通 路，激活AC，催化ATP轉化為cAMP，cAMP隨之激活其依賴性蛋白激酶A (PKA)，PKA可使細胞 內多種蛋白質磷酸化，產生生理效應，尤其是在促進相關基因轉錄有重要作用。PACAP通過 VPAC2受體介導的生物學功能主要有：神經遞質/調質、促進激素分泌，調節內分泌平衡；調 節性腺功能和生殖細胞的產生；調節能量代謝平衡等。
[0004] 研究表明，VPAC2型受體特異激動劑可有效促進葡萄糖依賴的胰島素分泌，提高機 體對高濃度血糖的應急能力有效降低血糖濃度，保護胰腺β細胞功能、增加 β細胞數量和 抑制β細胞凋亡。但PACAP及其許多衍生物，如DBAYL、ΒΑΥ55-9837等，由于分子量較小 (<6000Da.)，在體內由于腎小球的濾過作用，易被腎快速排泄和代謝，因此，其體內半衰期 較短、生物利用度受到影響。
[0005] 納米硒（SeNPs)具有良好的生物相容性，在體內還具有清除自由基的功能，其逐 漸被探索和初步應用于藥物傳輸與治療體系。殼聚糖是由（l，4)-linked2-amino_2-deoxy -β -D-glucose組成一種無毒可生物降解的陽離子多聚糖。殼聚糖與納米粒子作用后仍然 具有高分子聚合物的優良性能，如生物相容性、生物降解性、無毒性、成本低等。殼聚糖納米 粒子用于藥物運載和治療，越來越受到科研工作者的關注。
[0006] VPAC2型受體特異激動劑類活性多肽具有良好的葡萄糖依賴性降血糖作用，但往 往分子量較小，其體內半衰期較短、生物利用度降低，若要長效發揮這些具有良好降血糖作 用的活性多肽的生物學作用，把這些活性多肽與殼聚糖修飾的納米載體粒子偶聯作為新型 藥物體系，可有效改善多肽藥物的水溶性和體內穩定性、控制藥物的體內釋放及革巴向選擇 性，有效延長活性多肽藥物的半衰期，具有重要的藥用價值。


【發明內容】

[0007] 為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種抗II型糖尿病 長效納米復合肽的制備方法。該制備方法生產效率高，生產成本低。
[0008] 本發明的另一目的在于提供通過上述制備方法得到的抗II型糖尿病長效納米復 合肽。該納米復合肽P印tide-CS-SeNPs具有協同作用，具有更高穩定性、更長半衰期， Peptide指DBAYL、BAY55-9837等VPAC2受體特異激動劑類活性多肽。以納米硒為載體，殼 聚糖（Chitosan，CS)為連接linker,實現活性多肽與納米硒粒子（SeNPs)的共價結合。
[0009] 本發明的再一目的在于提供所述的抗II型糖尿病長效納米復合肽的應用。
[0010] 本發明的目的通過下述技術方案實現：一種抗II型糖尿病長效納米復合肽的制備 方法，包括如下步驟：
[0011] (1)納米硒粒子（SeNPs)制備
[0012] 常溫常壓下，吸取抗壞血酸（Vc)溶液，逐滴加入Na2Se03溶液，邊加邊搖勻，待顏色 不再加深，轉移到低溫反應，得到納米硒粒子溶液；
[0013] ⑵多肽和殼聚糖偶聯
[0014] 稱取多肽，用雙蒸水溶解，再加入0. 8mg/mL的殼聚糖（Chitosan，CS)溶液，攪拌反 應，得到多肽-殼聚糖偶聯物溶液；
[0015] (3)納米復合肽 Peptide-CS-SeNPs 的制備
[0016] 將步驟（1)制備的納米硒粒子溶液和步驟（2)制備的多肽-殼聚糖偶聯物溶液混 合后，攪拌反應，反應完成后，于雙蒸水中透析過夜，得到高純度的抗II型糖尿病長效納米 復合膚 Peptide-CS-SeNPs。
[0017] 步驟⑴中所述的Vc溶液的濃度優選為20?60mM ;更優選為20mM ;
[0018] 步驟⑴中所述的Na2Se03溶液的濃度優選為5?15mM ;更優選為5mM ;
[0019] 步驟⑴中所述的納米硒粒子溶液，其中Vc與Na2Se03的終濃度比優選為4:1 ;
[0020] 步驟⑴中所述的低溫優選為0?4°C ;
[0021] 步驟（1)中所述的反應的時間優選為3?5h，更優選為4h ;
[0022] 步驟（2)中所述的多肽優選為DBAYL、BAY55-9837、RMBAY或RMR0M等VPAC2受體 特異激動劑類活性多肽；更優選為DBAYL或BAY55-9837 ;
[0023] 步驟⑵中所述的反應的時間優選為10?16h ;更優選為12h ;
[0024] 步驟（2)中所述的多肽-殼聚糖偶聯物溶液，其中多肽的終濃度優選為lmg/mL ; 多聚糖的終濃度優選為〇. 〇8mg/mL ;
[0025] 步驟（3)所述的混合優選為步驟（1)制備的納米硒粒子溶液與步驟（2)制備的多 肽-殼聚糖偶聯物溶液按體積比2: (0. 5?3)進行混合；更優選為2:1 ;
[0026] 步驟（3)中所述的反應的時間優選為10?16h ;更優選為12h ;
[0027] -種抗II型糖尿病長效納米復合肽，通過上述制備方法制得。
[0028] 所述的抗II型糖尿病長效納米復合肽應用于制備治療如下疾病的藥物：糖尿病， 1?血糖癥。
[0029] 所述的抗II型糖尿病長效納米復合肽應用于制備治療II型糖尿病相關疾病的藥 物，有如下作用：長效促進葡萄糖依賴的胰島素分泌，提高機體對高濃度血糖的應急能力， 長效降低血糖濃度，保護胰腺β細胞功能、增加 β細胞數量和抑制β細胞凋亡及調節免 疫系統功能等作用。
[0030] 本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：
[0031] (1)本發明所制備的納米復合肽P印tide-CS-SeNPs藥物體系中，共價偶聯的 P印tide-CS-SeNPs在生物體內借助天然酶或生理環境（如PH等理化性質變化），可緩慢 釋放P印tide(DBAYL、BAY55-9837等活性多肽），在納米復合肽中，殼聚糖（Chitosan，CS) 修飾的納米硒粒子（SeNPs)具有對治療性多肽P印tide的載體攜帶、保護和緩釋作用， 且釋放Peptide后的SeNPs仍具有保護和修復β -細胞功能等作用；Peptide對復合肽 Peptide-CS-SeNPs具有靶向引導作用，且可通過VPAC2受體介導發揮治療II型糖尿病的生 物學作用。
[0032] (2)納米復合肽P印tide-CS-SeNPs克服了單獨使用治療性多肽P印tide (DBAYL、 BAY55-9837等活性多肽）時，由于分子量小（小于6000Da.)，在體內易被快速代謝清除的 缺點，可有效提高小分子治療性多肽的體內半衰期和生物利用度。
[0033] 這些區別使得納米復合肽P印tide-CS-SeNPs在生理環境中具有攜帶、保護和緩 釋治療性多肽、有效延長治療性多肽半衰期的作用，納米復合肽發揮治療作用的有效劑量 可顯著低于單獨使用治療性多肽的用藥量，且可發揮藥物緩釋、長效治療的生物學作用。生 理條件下釋放的釋治療性多肽可與VPAC2受體特異結合后，促進胰島素的產生和分泌，保 護胰腺β細胞功能、增加 β細胞數量和抑制β細胞凋亡，并激活胰島素受體信號通路，從 而發揮治療II型糖尿病的功效。而SeNPs具有保護和修復β-細胞功能的作用。
[0034] (3)本發明所制備的納米復合肽Ρ印tide-CS-SeNPs在治療糖尿病及其并發癥，高 血糖癥及肥胖癥疾病中有顯著的療效。
[0035] (4)利用本發明所述的制備方法得到的納米復合肽P印tide-CS-SeNPs使得治療 性多肽P印tide (DBAYL、BAY55-9837等活性多肽）的消除半衰期延長25倍以上。本發明的 制備方法效率高、成本低，應用前景廣闊。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1是納米復合肽Peptide-CS-SeNPs的結構示意圖。
[0037] 圖 2 是制備的納米復合肽 DBAYL-CS-SeNPs (圖 2A)和 BAY55-9837-CS-SeNPs (圖 2B)的透射電鏡（TEM)分析的結果圖。
[0038] 圖 3 是制備的納米復合肽 DBAYL-CS-SeNPs 和 BAY55-9837-CS_SeNPs 的 Zeta 電位 分析的結果圖。
[0039] 圖 4 是制備的納米復合肽 DBAYL-CS-SeNPs 和 BAY55-9837-CS-SeNPs 在 db/db 小 鼠體內的半衰期的結果圖。

【具體實施方式】
[0040] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0041] 實施例1
[0042] 納米復合肽 DBAYL-CS-SeNPs 和 BAY55-9837-CS-SeNPs 的制備
[0043] DBAYL的氨基酸序列為：
[0044] MHSDAVFTDQYTRLRKQLAAKKYLQSLKQKRY ；
[0045] BAY55-9837的氨基酸序列為：
[0046] HSDAVFTDNYTRLRKQVAAKKYLQSIKNKRY ；
[0047] 常溫常壓下，稱取8. 7mg Na2Se03溶解于雙蒸水中，定容到10mL，即得到5mM Na2Se0 3溶液；稱取35. 2mg抗壞血酸（Vc)，溶解于雙蒸水中，定容到10mL，即得到20mM的Vc 溶液；稱取8mg殼聚糖，溶解于雙蒸水中，定容到10mL，即得到0. 8mg/mL的殼聚糖溶液。吸 取lmL配制好的Vc溶液于小燒杯中，逐滴加入lmL Na2Se03溶液，邊加邊搖勻，待顏色不再 加深，轉移到低溫（〇?4°C )反應4小時，即得到粗制的納米硒粒子溶液。
[0048] 稱取lmg多肽P印tide (指DBAYL或BAY55-9837)于小燒杯中，加入900 μ L雙蒸 水溶解，再加入100 μ L 0. 8mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌反應12小時。然后將反應液加入到 粗制的納米砸粒子溶液中，定各到5mL，再攬祥反應12小時。反應完成后，于雙蒸水中透析 過夜，即得到納米復合肽 DBAYL-CS-SeNPs 或 BAY55-9837-CS-SeNPs。
[0049] 制備的納米復合肽P印tide-CS-SeNPs的結構如圖1所示。
[0050] 實施例2
[0051] 制備的納米復合肽 DBAYL-CS-SeNPs 和 BAY55-9837-CS-SeNPs 的透射電鏡（TEM) 檢測
[0052] 用TECNAI-10型透射電子顯微鏡（Philips)觀察納米復合肽DBAYL-CS-SeNPs和 BAY55-9837-CS-SeNPs的形貌：將納米復合肽分散均勻，用銅網蘸取樣品，以確定所得樣品 微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。
[0053] 實驗結果如圖2，制備的納米復合肽DBAYL-CS-SeNPs (圖2A)和 BAY55-9837-CS-SeNPs (圖2B)，具有良好的分散性，其粒徑大小約lOOnm，微粒形如球狀，均 勻性好。
[0054] 實施例3
[0055] 制備的納米復合肽DBAYL-CS-SeNPs和BAY55-9837-CS_SeNPs的Zeta電位及傅里 葉變換紅外光譜（FT-IR)檢測
[0056] 用 Nano-ZS (Malvern Insruments Limited)測定 SeNPs、SeNPs-CS 和兩種納米 復合肽DBAYL-CS-SeNPs和BAY55-9837-CS-SeNPs的Zeta電位，比較它們之間的差別。 實驗結果如圖3所示，SeNPs的zeta電位為-8. 5mV，SeNPs-CS的zeta電位為47. 5mV， DBAYL-CS-SeNPs 的 Zeta 電位為 34. 9mV，BAY55-9837-CS-SeNPs 的 Zeta 電位為 29. 8mV。
[0057] 實施例4
[0058] 制備的納米復合肽 DBAYL-CS-SeNPs 和 BAY55-9837-CS-SeNPs 在 db/db 小鼠體內 的半衰期檢測
[0059] 實驗分為四組，每組6只db/db小鼠，分別靜脈注射500 μ g/kg納米復合肽 DBAYL-CS-SeNPs、BAY55-9837-CS-SeNPs、DBAYL 或 BAY55-9837,注射藥物 1 ?20 小時后 的小鼠血液樣本從尾靜脈被收集，各時間點血樣收集在含有抗凝劑檸檬酸鈉的離心管中。 樣品離心后，利用LC/MS/MS技術進行檢測。高效液相色譜分析條件為：流動相A(100% 的純水，含有1 %的甲酸），流動相B (100 %的乙腈，含有1 %的甲酸），梯度變化為：0. 0? 0· 流動相 A ;0· 4 ?0· 8min，從 90%流動相 A to 10%流動相 A ;0· 8 ?1. 8min, 10 %流動相A ;1· 8?2. Omin,從10 %流動相A to 90 %流動相Α ;2· 0?3. Omin, 90 %流 動相A ;上樣體積為10 μ L。DBAYL或BAY55-9837的各時間點濃度利用建立的標準曲線和 Win-Nonlin version 3. 1軟件（Pharsight Inc.公司產品，美國）計算平均值所得。
[0060] 實驗結果如圖4所示，納米復合肽DBAYL-CS-SeNPs和BAY55-9837-CS-SeNPs在 db/db小鼠體內的消除半衰期分別為19. 7小時和17. 3小時；多肽DBAYL和BAY55-9837在 db/db小鼠體內的消除半衰期分別為0. 77小時和0. 35小時；實驗結果表明，治療性多肽與 殼聚糖修飾的納米硒粒子復合后的納米復合肽的體內的消除半衰期，顯著長于單獨的治療 性多肽。
[0061] 實施例5
[0062] 制備的納米復合肽 DBAYL-CS-SeNPs 和 BAY55-9837-CS-SeNPs 對 db/db 小鼠血糖 的影響
[0063] 40只10周齡的II型糖尿病模型db/db小鼠，根據體重被隨機分成5組，每組 8只。每組小鼠在藥物注射前測定血糖濃度，然后分別靜脈注射500 μ g/kg納米復合肽 DBAYL-CS-SeNPs、BAY55-9837-CS-SeNPs、DBAYL、BAY55-9837 或生理鹽水，在藥物或生理鹽 水注射后的2、4、6、8、10、12小時從尾靜脈取血，用OneTouch Ultra Meter血糖儀（Johnson 公司產品，美國）測定血糖值血糖濃度。
[0064] 表1注射納米復合肽或多肽的db/db小鼠的血糖水平檢測（mmol/L)
[0065]

【權利要求】
1. 一種抗II型糖尿病長效納米復合肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟：以納米 硒為載體，殼聚糖為連接，實現VPAC2受體特異激動劑類活性多肽與納米硒粒子的共價結 合。
2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于包括如下具體步驟： (1) 納米硒粒子制備 常溫常壓下，吸取Vc溶液，逐滴加入Na2Se03溶液，邊加邊搖勻，待顏色不再加深，轉移 到低溫反應，得到納米硒粒子溶液； (2) 多肽和殼聚糖偶聯 稱取多肽，用雙蒸水溶解，再加入〇. 8mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌反應，得到多肽-殼聚 糖偶聯物溶液； (3) 納米復合肽Peptide-CS-SeNPs的制備 將步驟（1)制備的納米硒粒子溶液和步驟（2)制備的多肽-殼聚糖偶聯物溶液混合 后，攪拌反應，反應完成后，于雙蒸水中透析過夜，得到高純度的抗II型糖尿病長效納米復 合膚 Peptide-CS-SeNPs。
3. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟（2)中所述的多肽為DBAYL、 BAY55-9837、RMBAY 或 RMROM。
4. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟⑴中所述的Vc溶液的濃度為 20 ?60mM ; 步驟⑴中所述的Na2Se03溶液的濃度為5?15mM ; 步驟（1)中所述的納米硒粒子溶液，其中Vc與Na2Se03的終濃度比為4:1。
5. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟（2)中所述的多肽-殼聚糖偶 聯物溶液，其中多肽的終濃度為lmg/mL ;多聚糖的終濃度為0. 08mg/mL。
6. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟（3)所述的混合為步驟（1)制 備的納米硒粒子溶液與步驟（2)制備的多肽-殼聚糖偶聯物溶液按體積比2: (0. 5?3)進 行混合。
7. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟（1)中所述的反應的時間為3? 5h ； 步驟（2)中所述的反應的時間為10?16h ; 步驟（3)中所述的反應的時間為10?16h。
8. -種抗II型糖尿病長效納米復合肽，通過權利要求1?7任一項所述的制備方法制 得。
9. 根據權利要求8所述的抗II型糖尿病長效納米復合肽的應用，其特征在于：所述的 抗II型糖尿病長效納米復合肽用于制備治療如下疾病的藥物：糖尿病，高血糖癥。
10. 根據權利要求8所述的抗II型糖尿病長效納米復合肽的應用，其特征在于：所述的 抗II型糖尿病長效納米復合肽應用于制備治療II型糖尿病相關疾病的藥物。
【文檔編號】A61P3/10GK104138602SQ201410367708
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】馬義, 洪岸, 陳填烽 申請人:暨南大學