光動力學療法及設(shè)備和光敏劑在治療骨肉瘤中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新的治療骨肉瘤的方法、以及光動力學方法、設(shè)備和光敏劑在治療骨肉瘤中的應(yīng)用，所述光敏劑能夠選擇性地聚集于骨肉瘤細胞中。動物體內(nèi)實驗表明，HMME作為光敏劑的PDT能夠有效抑制骨肉瘤的生長，并通過HE染色觀察到腫瘤部位出現(xiàn)廣泛的均質(zhì)紅染的壞死區(qū)，呈黑色并周邊結(jié)痂，周圍有大量炎性細胞浸潤，殘留的腫瘤細胞出現(xiàn)核固縮，空泡樣變性等改變。本發(fā)明還首次證實，HMME-PDT主要誘導(dǎo)骨肉瘤細胞發(fā)生凋亡且與caspase依賴的凋亡通路密切相關(guān)。
【專利說明】光動力學療法及設(shè)備和光敏劑在治療骨肉瘤中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種治療骨肉瘤的方法、設(shè)備和光敏劑，尤其涉及一種光動力學療法 及其設(shè)備和光敏劑在治療骨肉瘤中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 骨與軟組織肉瘤（骨肉瘤）約占各類惡性腫瘤的1%，雖然較一些常見腫瘤如腸 癌、乳腺癌、肺癌等少見，但由于此類腫瘤好發(fā)于青少年和中年人，惡性程度高。病情復(fù)雜多 變，治療有相當困難，預(yù)后差，致殘致死率高，給患者帶來很大的痛苦，對社會造成很大的危 害。
[0003] 近年來，骨與軟組織腫瘤的診斷和治療都有了較大發(fā)展。尤其新輔助化療的規(guī)范 化實施以來，保肢手術(shù)得以廣泛開展，隨著瘤體滅活與再植術(shù)、外科重建（人工假體置換 術(shù)、大段異體骨移植、自體骨移植、和骨延長）等技術(shù)的發(fā)展，保肢治療的效果有了長足的 進步，大大提高了患者生存質(zhì)量。但是，由于腫瘤本身的高侵襲性和化療耐藥性的存在，腫 瘤局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移仍沒有得到很好的解決，成為影響骨與軟組織腫瘤預(yù)后和生存率的 關(guān)鍵問題。
[0004] 骨與軟組織肉瘤在未來的一段時間內(nèi)仍將以手術(shù)治療、放療和化療為主，盡管手 術(shù)原則為盡可能完整地切除腫瘤，然而此類腫瘤往往呈浸潤性生長，與周圍組織粘連緊密， 侵襲性強，臨床中經(jīng)常遇到的情況是骨與軟組織惡性腫瘤在就診時往往體積很大，完整切 除相當困難，如果解剖位置特殊，尤其是鄰近關(guān)節(jié)、重要神經(jīng)血管的腫瘤，在實行保肢手術(shù) 的同時，周圍瘤床可能殘留鏡下病灶；發(fā)生于骶骨、脊椎、脊柱旁、腹膜后區(qū)的骨與軟組織惡 性腫瘤與周圍重要組織臟器粘連，往往累及重要的神經(jīng)血管和鄰近臟器，很難行根治性切 除而只能選擇邊緣切除或病灶內(nèi)切除，導(dǎo)致局部腫瘤細胞殘留，即使行根治性切除也無法 完全保證切緣陰性。
[0005] 此外，大多數(shù)此類腫瘤對化療敏感性不高，全身化療無法有效地控制殘留腫瘤的 生長，這些均是骨與軟組織肉瘤易局部復(fù)發(fā)的原因。加之高劑量強度的毒副作用、多耐藥 性，導(dǎo)致骨肉瘤化療失敗。因而，目前大部分多次復(fù)發(fā)患者的臨床結(jié)局往往是截肢、或發(fā)生 腫瘤遠處轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致死亡。
[0006] 如何有效地提高手術(shù)徹底性，減少骨與軟組織肉瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率、做到局部控制的 難題一直困擾著臨床醫(yī)師，成為臨床工作中亟待解決的難題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對目前缺乏安全、有效治療骨肉瘤的方法的問題，本發(fā)明提供了一種新的治療 骨肉瘤的方法、以及光動力學方法、設(shè)備和光敏劑在治療骨肉瘤中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明第一個方面是提供一種光動力學治療骨肉瘤的方法，包括：
[0009] 提供光敏劑，所述光敏劑能夠選擇性地聚集于骨肉瘤細胞中；
[0010] 進行光照，使光敏劑分解。
[0011] 其中，所述光敏劑可以是選自血卟啉、苯卟啉、血卟啉單甲醚中的任意一種或幾 種，更優(yōu)選為血卟啉單甲醚。
[0012] 其中，所述光照時間優(yōu)選為至少為lh，更優(yōu)選為至少l-12h，更優(yōu)選為2-8h，更優(yōu) 選為2_4h，最優(yōu)選為4h。
[0013] 其中，所述光敏劑優(yōu)選為能夠吸收600-800nm波長的光。
[0014] 其中，所述光照優(yōu)選為采用600-800nm波長的光進行照射。
[0015] 其中，所述光照能力密度優(yōu)選為3-15J/cm2,更優(yōu)選為3-lOJ/cm 2,更優(yōu)選為6-9J/ cm2。
[0016] 本發(fā)明第二個方面是提供一種光敏劑在制備光動力學治療骨肉瘤光敏劑中的應(yīng) 用。
[0017] 其中，所述光敏劑選自η卜啉、苯η卜啉、血η卜啉單甲醚中的任意一種或幾種，更優(yōu)選 為血卟啉單甲醚。
[0018] 本發(fā)明第三個方面是提供一種發(fā)光設(shè)備在制作光動力學治療骨肉瘤設(shè)備中的應(yīng) 用，其中，所述發(fā)光設(shè)備包括能夠發(fā)出600-800nm波長的光。
[0019] 其中，所述發(fā)光設(shè)備為激光機。
[0020] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，血卟啉單甲醚等光敏劑可選擇性的聚集于骨腫瘤細胞中，而周圍的 正常細胞吸收極少，其在骨肉瘤的胞內(nèi)吸收呈現(xiàn)出孵育時間及光敏劑濃度依賴性，其熒光 強度隨著孵育時間的延長及光敏劑濃度的增加而增強，因此，可作為臨床治療骨腫瘤重要 靶向光敏劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1A為不同時間條件下成肌細胞與骨肉瘤細胞中光敏劑濃度變化；
[0022] 圖1B為不同濃度條件下成肌細胞與骨肉瘤細胞中光敏劑濃度變化；
[0023] 圖2為光敏劑HMME不同孵育時間情況下LM8細胞存活率對比；
[0024] 圖3為光敏劑抑制骨腫瘤細胞存活率，a為LM8細胞，b為MG63細胞，c為Saos-2 細胞，d為SW1353細胞，e為TC71細胞，f為RD細胞；
[0025] 圖4為HMME-PDT處理前（A)、后⑶腫瘤細胞形態(tài)變化；
[0026] 圖5A為流式細胞儀檢測HMME-PDT誘導(dǎo)貼壁骨肉瘤細胞凋亡情況，其中，a為LM8 細胞，b為MG63細胞，c為Saos-2細胞；
[0027] 圖5B為圖5A所述骨肉瘤細胞凋亡率對比；
[0028] 圖6A為流式細胞儀檢測HMME-PDT誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)骨肉瘤細胞凋亡情況，其中，a為 LM8細胞，b為MG63細胞，c為Saos-2細胞；
[0029] 圖6B為圖6A所述骨肉瘤細胞凋亡率對比；
[0030] 圖7為Hoechst33342染色法觀察到骨肉瘤細胞凋亡照片（200X)，其中，a為LM8 細胞，b為MG63細胞，c為Saos-2細胞。
[0031] 圖8為QRT-PCR檢測通路凋亡基因 mRNA表達水平；
[0032] 圖 9 為 Western blotting 初篩檢測 caspase-3、Bcl-x、p53、RelA 蛋白相對表達 電泳照片和柱狀對比；
[0033] 圖10為Western blotting檢測caspase_l、3、6、9和PARP蛋白相對表達電泳照 片和柱狀對比；
[0034] 圖11為Z-VAD-FMK及Nec-Ι檢測HMME-PDT介導(dǎo)細胞死亡結(jié)果；
[0035] 圖12為HMME-PDT對鼠骨肉瘤抑制效果；
[0036] 圖13為HE染色觀察腫瘤組織形態(tài)學改變
[0037] 圖14為體內(nèi)抗腫瘤實驗中caspase_l、3、6、9和PARP蛋白相對表達量。

【具體實施方式】
[0038] 血卟啉單甲醚（HMME)結(jié)構(gòu)如下：
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 一種光敏劑在制備光動力學治療骨肉瘤光敏劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述光敏劑 為卟啉、苯卟啉、血卟啉單甲醚中的任意一種或幾種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述光敏劑為血卟啉單甲醚。
3. -種發(fā)光設(shè)備在制作光動力學治療骨肉瘤設(shè)備中的應(yīng)用，其中，所述發(fā)光設(shè)備包括 能夠發(fā)出600-800nm波長的光。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)光設(shè)備為激光機。
5. -種光動力學治療骨肉瘤的方法，其特征在于，包括： 提供光敏劑，所述光敏劑能夠選擇性地聚集于骨肉瘤細胞中； 進行光照，使光敏劑分解。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述光敏劑選自血卟啉、苯卟啉、血卟啉 單甲醚中的任意一種或幾種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述光敏劑為血卟啉單甲醚。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述光照時間至少為lh。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述光照時間為4h。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述光照采用600-800nm波長的光。
【文檔編號】A61K41/00GK104189902SQ201410367676
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】蔡鄭東, 曾輝, 華瑩奇, 周承豪, 孫夢熊, 尹飛, 單連成, 孫偉, 王卓瑩, 陳泉池 申請人:上海市第十人民醫(yī)院