一種天然組織來源的全椎間盤脫細胞材料及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種天然組織來源的全椎間盤脫細胞材料及其制備方法，本發明取脊椎動物椎間盤，摘除骨性碎片，無菌PBS漂洗3次，然后在濃度為10%的含10KIU/ml蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液中，在搖床150rpm震蕩4小時；再在濃度為4%的含TritonX-100的PBS緩沖液，加入混合抗菌液，在搖床150rpm震蕩48小時；接著用濃度為5%的含SDS的PBS緩沖液，加入的混合抗菌液，在搖床150rpm震蕩48小時；最后用濃度為0.5mg/ml的含DNA酶的PBS緩沖液，加入混合抗菌液，在搖床150rpm震蕩12小時，再用PBS沖洗1小時，本發明取材廣，安全性高，能實現正常椎間盤重構。
【專利說明】一種天然組織來源的全椎間盤脫細胞材料及其制備方法

【技術領域】
[0001]本發明主要涉及用于組織或器官修復及其再生的生物領域，具體是一種天然組織來源的全椎間盤脫細胞材料極其制備方法。

【背景技術】
[0002]椎間盤退變常常引起背部疼痛及椎間盤突出。據統計，在美國約有84%的人有過腰背部疼痛病史，與之相關花費每年更是高達1000億美元。并且椎間盤退變則被認為是一個不可逆的并且隨年齡加重的病變過程。而目前傳統的保守治療和手術切除-融合均不能達到理想的根治效果。
[0003]再生醫學和組織工程技術的出現使根治椎間盤退變成為可能。近年來，許多研究者嘗試運用組織工程(金屬-塑料復合椎間盤)、分子生物學(注射生長因子或細胞因子抑制齊IJ)和干細胞治療等技術治療椎間盤退變。但是由于天然椎間盤(髓核和纖維環)具有復雜的三維結構和許多目前尚未明確的具體組成成分使得效果總是不盡如人意。例如，人工合成材料由于生物力學、生物相容性、材料性質和遠期磨碎等問題使其運用受到很大限制；而生長因子和細胞因子抑制劑的有效作用時間短暫也使治療效果不佳；同樣干細胞技術目前還無法解決椎間盤結構破壞所導致的一系列疾病進程。因此找到真正符合正常椎間盤生物學和力學性質的材料或是治療技術，從而替換并逆轉退變椎間盤是一個亟待解決醫學難題。
[0004]細胞外基質(ECM)含有正常組織或器官細胞所需的各種生化因子，并且具有天然宏觀及超微三維的立體結構。ECM可調節生物物理刺激、生物化學及分子信號等一系列組織或器官發育及修復所需的各種因素，從而實現組織或器官的恢復和再生。因此ECM作為一個新型的天然生物材料正被廣泛的運用于心臟瓣膜、氣管、肌肉、肌腱、軟骨等一系列組織或器官的修復及再生。而目前尚無關于天然來源的完整椎間盤(髓核和纖維環)脫細胞材料制備的報道。


【發明內容】

[0005]本發明目的在于填補現有技術中，組織工作人椎間盤在材料組成、結構、生物力學方面的不足以及僅有單一髓核或纖維支架的缺陷，提供一種可適宜椎間盤細胞生長、重構及治療不可逆性椎間盤退變的全椎間盤脫細胞材料的制備方法
一種天然組織來源的全椎間盤脫細胞材料及其制備方法，具體包括以下步驟:
(1)取脊椎動物椎間盤，摘除骨性碎片，無菌PBS漂洗3次，每次漂洗20分鐘，去除血液、殘余肌肉組織和韌帶等；
(2)在濃度為10%的含10KIU/ml蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液中，恒溫45°C搖床150rpm震蕩4小時；并用PBS沖洗I小時；
(3)在濃度為4%的含TritonX-100的PBS緩沖液，加入10KIU/ml, 10g/ml的混合抗菌液，緩沖液和混合抗菌液體積比為5:1，緩沖液和混合抗菌液比例5:1，恒溫45°C搖床150rpm震蕩48小時；并用PBS沖洗I小時；所述的混合抗菌液由青霉素和鏈霉素組成，青霉素和鏈霉素的體積比為1:1;
(4)濃度為5%的含SDS的PBS緩沖液，加入10KIU/ml，10g/ml的混合抗菌液，緩沖液和混合抗菌液體積比為5:1，恒溫45°C搖床150rpm震蕩48小時；再用PBS沖洗I小時；所述的混合抗菌液由青霉素和鏈霉素組成，青霉素和鏈霉素的體積比為1:1 ；
(5)濃度為0.5mg/ml的含DNA酶的PBS緩沖液，加入10KIU/ml，10g/ml的混合抗菌液，緩沖液和混合抗菌液體積比為5:1,37°C搖床150rpm震蕩12小時，再用PBS沖洗I小時，所述的混合抗菌液由青霉素和鏈霉素組成，青霉素和鏈霉素的體積比為1:1。
[0006]本發明的主要優點如下:
(1)本發明所采用的全椎間盤是天然來源的生物材料，具有很好的生物相容性和取材廣泛性；
(2)采用脫細胞技術獲得的全椎間盤不含細胞等抗原物質，可使受體的免疫排斥反應降到最低限度，同時可不含細菌病毒等有害成分生物安全性高；
(3)脫細胞技術在去除異種細胞的同時，可保留原先ECM的完整性，具有良好的細胞外微環境、生化因子和生物力學性質等，可以最大限度的模擬正常椎間盤成分和結構；
(4)本發明材料不僅可以用于種植各種干細胞(胚胎干細胞、骨髓間充質干細胞(MSCs)、脂肪間充質干細胞等)和椎間盤細胞以實現正常椎間盤重構，為病人訂制具有個體化、可供移植的全椎間盤，還可以將其研磨制成粉末，將正常椎間盤所含有的生化因子溶解用于治療退變的椎間盤。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1是本發明的全椎間盤(纖維環和髓核)大體外觀圖；
圖2是纖維環支架的HE染色無細胞及無細胞核成分殘留圖；
圖3是髓核支架的HE染色無細胞及無細胞核成分殘留圖；
圖4是纖維環支架的阿爾新藍染色保留大量糖胺聚糖成分圖；
圖5是髓核支架的阿爾新藍染色保留大量糖胺聚糖成分圖；
圖6是全椎間盤DNA定量檢測幾乎不含有DNA成分圖；
圖7是纖維環掃描電鏡檢測膠原纖維排布和空間立體結構完整保留圖；
圖8是髓核掃描電鏡檢測膠原纖維排布和空間立體結構完整保留圖；
圖9是CCK-8檢測不同支架浸提液濃度下MSCs的增值情況圖；
圖10是Live/Dead細胞染色MSCs在全椎間盤脫細胞支架上的生長情況圖。
具體實施方案
[0008]下面結合附圖及實施例對本發明進行詳細描述，但本發明的實施不僅限于此。
[0009]1、制備全椎間盤脫細胞基質
(I)取材:取4個月(雌雄均可)健康家兔胸5到腰3的椎間盤，摘除骨性碎片，無菌PBS充分漂洗去除血液和其他雜質，椎間盤長軸約Icm,短軸0.8cm,厚度約5mm。
[0010]脫細胞步驟如下:
步驟一:在10ml濃度為10%的含10KIU/ml蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩4小時；并用PBS沖洗I小時；
步驟二:在500ml濃度為4%的含Triton X-100的PBS緩沖液，加入10ml青霉素和鏈霉素(10KIU/ml，10g/ml)混合抗菌液，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩48小時；并用PBS沖洗I小時；
步驟三:在500ml濃度為5%的含SDS的PBS緩沖液，加入10ml青霉素和鏈霉素(10KIU/ml, 10g/ml)混合抗菌液，低溫(4°C)搖床150rpm震蕩48小時；并用PBS沖洗I小時；
步驟四:用10ml濃度為0.5mg/ml的含DNA酶的PBS緩沖液，加入20ml青霉素和鏈霉素(101(幾/1111，108/1111)混合抗菌液，37°(:搖床150rpm震蕩12小時后，并用PBS沖洗I小時得到全椎間盤脫細胞支架，如圖1所示；
全椎間盤脫細胞支架的組織學評價
圖2和圖3是本發明全椎間盤脫細胞支架(纖維環和髓核)HE染色放大100倍無細胞及無細胞核成分殘留圖；圖4和圖5是本發明全椎間盤脫細胞支架(纖維環和髓核)阿爾新藍染色放大100倍保留大量糖胺聚糖成分圖。
[0011](4)全椎間盤脫細胞支架的抗原成分定量檢測
圖6是本發明全椎間盤脫細胞支架(纖維環和髓核)DNA定量檢測幾乎不含有DNA成分圖。
[0012](5)全椎間盤脫細胞支架的超微立體結構觀察
圖7和圖8是本發明全椎間盤脫細胞支架(纖維環和髓核)掃描電鏡檢測膠原纖維排布和空間立體結構完整保留圖。
[0013](6)全椎間盤脫細胞支架的生物相容性評價
圖9是本發明全椎間盤脫細胞支架CCK-8檢測不同支架浸提液濃度下MSCs的增值情況圖。圖10是本發明全椎間盤脫細胞支架Live/Dead細胞染色MSCs在全椎間盤脫細胞支架上100倍的生長情況圖。
【權利要求】
1.一種天然組織來源的全椎間盤脫細胞材料及其制備方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟: (1)取脊椎動物椎間盤，摘除骨性碎片，無菌PBS漂洗3次，每次漂洗20分鐘，去除血液、殘余肌肉組織和韌帶等； (2)在濃度為10%的含10KIU/ml蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液中，恒溫45°C搖床150rpm震蕩4小時；并用PBS沖洗I小時； (3)在濃度為4%的含TritonX-100的PBS緩沖液，加入10KIU/ml, 10g/ml的混合抗菌液，緩沖液和混合抗菌液體積比為5:1，緩沖液和混合抗菌液比例5:1，恒溫45°C搖床150rpm震蕩48小時；并用PBS沖洗I小時；所述的混合抗菌液由青霉素和鏈霉素組成，青霉素和鏈霉素的體積比為1:1; (4)濃度為5%的含SDS的PBS緩沖液，加入10KIU/ml，10g/ml的混合抗菌液，緩沖液和混合抗菌液體積比為5:1，恒溫45°C搖床150rpm震蕩48小時；再用PBS沖洗I小時；所述的混合抗菌液由青霉素和鏈霉素組成，青霉素和鏈霉素的體積比為1:1 ； (5)濃度為0.5mg/ml的含DNA酶的PBS緩沖液，加入10KIU/ml，10g/ml的混合抗菌液，緩沖液和混合抗菌液體積比為5:1，37°C搖床150rpm震蕩12小時，再用PBS沖洗I小時，所述的混合抗菌液由青霉素和鏈霉素組成，青霉素和鏈霉素的體積比為1:1。
【文檔編號】A61L27/36GK104307044SQ201410538175
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月13日 優先權日:2014年10月13日
【發明者】林賢豐, 范順武, 胡志軍 申請人:浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院