姜黃素衍生物DIMMO在制備自噬誘導劑中的應用一、技術領域：本發明涉及一種姜黃素衍生物的應用，特別是涉及一種姜黃素衍生物DIMMO在制備自噬誘導劑中的應用。姜黃素衍生物DIMMO即(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮((3E,5E)-3-(3,4-dimethoxybenzylidene)-5-[(1H-indol-3-yl)methylene]-1-methylpiperidin-4-one，簡稱DIMMO)。二、

背景技術：
：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮簡稱DIMMO，其結構式為：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮的分子式為C24H24N2O3，分子量(M)為388.46。姜黃是一種傳統中藥材，是從姜科、天南星科類的植物根莖中提取的一種二酮類化學成分。姜黃素則是從姜黃中提取的一類酚類色素，是姜黃的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和降血脂等作用。有報道稱姜黃素能夠有效抑制人子宮內膜癌細胞(HEC1B)的增殖，并且可以引起細胞凋亡。其誘導凋亡的機制是將細胞周期阻滯在G2/M期。但姜黃素本身水溶性差，生物利用率較低，限制其廣泛應用。自噬(autophagy)是存在于真核細胞內的一種普遍生理現象，由Ashford和Porter在1962年發現并提出，自發現以來受到越來越多科研工作者的關注。自噬分為三類：巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)及分子伴侶介導的自噬(Chaperone-mediatedautophagy,CAM)，這里主要討論巨自噬(以下簡稱“自噬”)。在自噬研究中，尋找能夠有效誘導細胞自噬的化學小分子至關重要。根據檢索，關于姜黃素及姜黃素衍生物的研究以抗腫瘤居多。例如：1、申請號為201010183509.6、名稱為“苯丁酰基姜黃素衍生物及其在制備抗腫瘤藥物中的應用”的發明專利，該專利公開了姜黃素衍生物在抑制肝癌中的作用。2、申請號為201110201683.3、名稱為“姜黃素在制備甲狀腺癌治療劑中的應用”的發明專利，該專利公開了姜黃素可以殺傷甲狀腺癌細胞并且對正常甲狀腺細胞影響較小。3、申請號為201110435234.5，名稱為“姜黃素衍生物C2在抗結腸癌藥物中的應用”的發明專利，該專利公開了一種姜黃素衍生物比母本姜黃素本身穩定，親脂性更強；同時，姜黃素衍生物C2與母本姜黃素相比對結腸癌細胞具有更強的殺傷毒性，對正常結腸細胞的殺傷作用較小，這為姜黃素衍生物被開發成新的抗結腸癌藥物提供了理論基礎。目前，僅有研究表明姜黃素能夠誘導自噬，對于姜黃素衍生物誘導細胞自噬的報道甚少。三、

技術實現要素：
：本發明要解決的技術問題是：提供一種(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在制備自噬誘導劑中的應用。本發明提供的一種自噬誘導劑，在癌細胞和正常細胞中均有明顯效果。為了解決上述問題，本發明采用的技術方案是：本發明提供一種(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在制備自噬誘導劑中的應用。根據上述的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在制備自噬誘導劑中的應用，所述(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在誘導A549細胞或血管內皮細胞自噬中的應用。根據上述的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在制備自噬誘導劑中的應用，所述(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在誘導A549細胞或血管內皮細胞自噬中應用的有效濃度為10μM～40μM。本發明利用的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮(DIMMO)已有論文公開其制備方法。該論文的詳細信息：期刊名為JOURNALOFCHEMICALRESEARCH，發表年份為2012年2月(February2012)，題目為“Synthesisandbiologicalevaluationofcurcuminanalogueshavingapiperidonecoreaspotentialantioxidantagents”；作者為JianWang,GangchunSun*,ZhichengLi*,WenpengMaiandJingxiXie(*代表通訊作者)；卷期為Volume36,Number2；頁碼為pp.63-65(3)。實驗證明：下面結合(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮的藥理實驗及結果，證明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮誘導細胞自噬的效果，即在制備自噬誘導劑中的應用。血管內皮細胞及A549細胞的制備：以常規方法培養血管內皮細胞及A549細胞，選取生長狀態良好的、且處于對數生長期的血管內皮細胞及A549細胞備用。結合細胞生物學和分子生物學的方法，進行如下實驗，以觀察(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮誘導細胞自噬的效果。實驗1、倒置相差顯微鏡觀察細胞形態：實驗方法：1)細胞接種：將細胞按一定密度傳到24孔板中；2)加藥：種板24h后，吸去舊培養液，每次采用1mL、1×PBS洗2遍；3)24孔板中每孔分別加入1mL濃度為1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮藥物溶液；4)加藥處理后置于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，并拍照。按下列實驗分組處理血管內皮細胞，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。溶劑對照組：40μM的二甲基亞砜(DMSO)孵育細胞0.5、1、3、6小時，細胞形態正常。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮處理組：分別用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育細胞0.5、1、3、6、24小時，細胞出現時間和濃度依賴性的空泡化。按下列實驗分組處理A549細胞，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。溶劑對照組：40μM的二甲基亞砜(DMSO)孵育細胞3、6、12或24小時，細胞形態正常。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮處理組：分別用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育A549細胞3、6、12或24小時，與對照組相比，細胞趨圓變亮。實驗結果顯示：用不同濃度的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮處理A549細胞3、6、12、或24小時，細胞明顯產生空泡化，并呈時間和濃度的依賴性，同時細胞在高濃度時細胞趨圓變亮(詳見附圖1)。不同濃度的姜黃素衍生物(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮處理血管內皮細胞0.5、1、3、6、24小時，相比對照組細胞出現時間和濃度依賴的明顯空泡化，引起細胞自噬(詳見附圖2)。實驗2、熒光顯微鏡觀察吖啶橙染色后觀察細胞酸性小泡聚集：實驗方法：1)接種細胞及加藥處理同實驗1；2)加藥處理時間結束后棄各孔中原有培養液，采用700μL、1×PBS洗細胞2次；3)加入1×吖啶橙染液700μL染色40s；4)時間到，棄去吖啶橙染液，1×PBS清洗細胞2次；5)加入1×PBS700μL，置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照；6)先在白光下找到細胞，然后換為藍光，在藍光激發下細胞核為綠色，酸性膜泡為紅色；7)PS處理和分析實驗結果。按下列實驗分組處理血管內皮細胞，吖啶橙染色后熒光顯微鏡下觀察酸性小泡聚集。溶劑對照組：40μM的二甲基亞砜(DMSO)孵育細胞0.5、1、3、6小時，未觀察到明顯的酸性小泡聚集。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮處理組：分別用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育細胞0.5、1、3、6、24小時，吖啶橙染色后熒光顯微鏡下觀察到明顯的酸性小泡聚集且呈濃度和時間依賴性。按照實驗1中實驗分組處理A549細胞3、6、12或24小時，吖啶橙染色40秒，激光掃描熒光顯微鏡下觀察細胞酸性小泡聚集情況。實驗結果顯示：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮顯著誘導了細胞內酸性小泡的聚集，并且呈現濃度和時間的依賴性(詳見附圖3、4)。實驗3、蛋白質印跡法檢測LC3蛋白表達量變化：細胞總蛋白提取：1)取出細胞，棄培養液，加入4℃預冷的PBS清洗兩次；2)將培養皿內PBS吸干，每個小皿加入50μL蛋白裂解液；3)冰上裂解10min；4)用細胞刮將裂解后的細胞刮下，轉移至0.5mL離心管中；5)100℃變性5min；6)取出5μL測蛋白濃度，其余分裝后-20℃保存。Bradford比色法測定總蛋白濃度：1)取6只5mL小試管，分別加入標準蛋白BSA：0、3、6、9、12和15μg，加蒸餾水補足到100μL；2)取2uL待測樣品，加水補足到100μL；3)每管加入1.9mL考馬斯亮藍(G-250)染料溶液，振蕩混勻；4)加入96孔板，根據情況每組4個平行以上，每孔100μL；5)酶標儀檢測590nm的吸光值(以含0μgBSA的一組孔調零)；6)利用Excel軟件繪出標準曲線，相關系數在0.96以上可用；7)根據標準曲線，確定待測樣品的濃度。蛋白質印跡法：1)制膠：15％分離膠，5％濃縮膠；2)蛋白樣品100℃變性5min，上樣10μg；3)恒壓60v進膠，當溴酚藍/蘭前沿剛進入分離膠后，恒壓100v跑膠；4)據目標蛋白分子量將膠進行適當剪切；5)用轉移槽恒流轉膜，LC3用0.22μm孔徑PVDF膜轉1.5h，內參用0.45μm孔徑PVDF膜轉3h；6)用含8％脫脂奶粉的PBST溶液在室溫下封閉1h；7)用一抗稀釋液稀釋目的蛋白的單克隆一抗，一抗應用液與相應的PVDF膜在4℃孵育過夜；8)用PBST溶液浸泡膜3次，每次10min；9)用PBS緩沖液浸泡膜1次，10min；10)用PBS緩沖液稀釋二抗(1：5000)，室溫孵育1h；11)用PBST緩沖液浸泡膜3次，每次10min；12)用PBS緩沖液浸泡膜1次，10min；13)用ECL顯色法在暗盒中顯色；14)處理并分析結果。按下列實驗分組處理血管內皮細胞，提取總蛋白，蛋白質印跡法檢測LC3蛋白表達情況。溶劑對照組：40μM的二甲基亞砜(DMSO)每個小皿加3mL孵育細胞1小時。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮處理組：分別用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮每個小皿加3mL孵育血管內皮細胞1小時。按下列實驗分組處理A549細胞，提取總蛋白，蛋白質印跡法檢測LC3蛋白表達情況。溶劑對照組：40μM的二甲基亞砜(DMSO)每個小皿加3mL孵育細胞24小時。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮處理組：分別用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮每個小皿加3mL孵育A549細胞24小時。實驗結果顯示：處理組細胞中LC3蛋白表達隨濃度增多明顯增多，細胞出現了自噬現象(詳見附圖5、6)。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在誘導A549細胞和血管內皮細胞中具有的明顯作用，為制備自噬誘導劑的開發提供了誘人前景。四、附圖說明：圖1是倒置相差顯微鏡下，溶劑對照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組處理3、6、12、24小時后的非小細胞腫瘤A549細胞。圖1中：A(3小時)、G(6小時)、M(12小時)、S(24小時)為溶劑對照組；B(3小時)、H(6小時)、N(12小時)、T(24小時)為1μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組；C(3小時)、I(6小時)、O(12小時)、U(24小時)為5μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組；D(3小時)、J(6小時)、P(12小時)、V(24小時)為10μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組；E(3小時)、K(6小時)、Q(12小時)、W(24小時)為20μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組；F(3小時)、L(6小時)、R(12小時)、X(24小時)為40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組。圖2是倒置相差顯微鏡下，溶劑對照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組處理0.5、1、3、6、24小時后的血管內皮細胞。圖2中：A(0.5小時)、G(1小時)、M(3小時)、S(6小時)、Y(24小時)為溶劑對照組；B(0.5小時)、H(1小時)、N(3小時)、T(6小時)、Z(24小時)為1μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組；C(0.5小時)、I(1小時)、O(3小時)、U(6小時)、α(24小時)為5μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組；D(0.5小時)、J(1小時)、P(3小時)、V(6小時)、β(24小時)為10μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組；E(0.5小時)、K(1小時)、Q(3小時)、W(6小時)、γ(24小時)為20μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組；F(0.5小時)、L(1小時)、R(3小時)、X(6小時)、Δ(24小時)為40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組。圖3是吖啶橙染色，熒光顯微鏡下溶劑對照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組處理3、6、12、24小時后的非小細胞腫瘤A549細胞。圖3中：A(3小時)、G(6小時)、M(12小時)、S(24小時)為溶劑對照組；B(3小時)、H(6小時)、N(12小時)、T(24小時)為1μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組；C(3小時)、I(6小時)、O(12小時)、U(24小時)為5μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組；D(3小時)、J(6小時)、P(12小時)、V(24小時)為10μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組；E(3小時)、K(6小時)、Q(12小時)、W(24小時)為20μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組；F(3小時)、L(6小時)、R(12小時)、X(24小時)為40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組。圖4是吖啶橙染色，熒光顯微鏡下溶劑對照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組處理0.5、1、3、6、24小時后的血管內皮細胞。圖4中：A(0.5小時)、G(1小時)、M(3小時)、S(6小時)、Y(24小時)為溶劑對照組；B(0.5小時)、H(1小時)、N(3小時)、T(6小時)、Z(24小時)為1μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組；C(0.5小時)、I(1小時)、O(3小時)、U(6小時)、α(24小時)為5μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組；D(0.5小時)、J(1小時)、P(3小時)、V(6小時)、β(24小時)為10μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組；E(0.5小時)、K(1小時)、Q(3小時)、W(6小時)、γ(24小時)為20μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組；F(0.5小時)、L(1小時)、R(3小時)、X(6小時)、Δ(24小時)為40μM的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組。圖5在A549細胞中蛋白質印跡法結果。圖6在血管內皮細胞中蛋白質印跡法結果。五、具體實施方式：以下結合實施例進一步闡述本發明，但并不限制本發明的內容。實施例1：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在促進非小肺癌細胞A549細胞自噬中的應用。非小肺癌細胞A549細胞的制備：以常規方法培養非小肺癌細胞A549細胞，選取生長狀態良好的、且處于對數生長期的A549細胞備用。將所培養的細胞分為溶劑對照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組。溶劑對照組細胞用濃度為40μM的DMSO孵育3、6、12或24小時；(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組細胞用不同濃度的(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育3、6、12或24小時；每隔3小時于倒置相差顯微鏡下觀察，分別在3、6、12和24小時，記錄細胞形態學變化并拍照。實驗結果顯示：對照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組處理A549細胞3h，細胞形態無肉眼可見變化；但(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮不同濃度處理組細胞隨著時間增加明顯產生空泡化，并且細胞在高濃度時明顯趨圓變亮；在24小時，40μM處尤為明顯。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮促進細胞空泡化，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮促進非小肺癌細A549自噬(詳見附圖1)。實施例2：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在促進非小肺癌細胞A549細胞自噬中的應用非小肺癌細胞A549細胞的制備：以常規方法培養非小肺癌細胞A549細胞，選取生長狀態良好的、且處于對數生長期的A549細胞備用。將所培養的細胞分為溶劑對照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組。溶劑對照組細胞用濃度為40μM的DMSO孵育3、6、12或24小時；(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組細胞用不同濃度的(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育3、6、12或24小時。吸棄各孔中原有培養液，1×PBS清洗細胞1次，0.1mg/mL吖啶橙染液染色40s，1×PBS再次清洗，在倒置熒光顯微鏡下觀察酸性膜泡，先在白光下找到細胞，然后換為藍光，在藍光激發下細胞核為綠色，酸性膜泡為紅色。實驗結果顯示：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮明顯誘導細胞產生酸性膜泡，在24小時，40μM處尤為明顯。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮誘導細胞產生酸性膜泡，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮促進非小肺癌細胞A549細胞自噬(詳見附圖3)。實施例3：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在促進非小肺癌細胞A549細胞自噬中的應用。非小肺癌細胞A549細胞的制備：以常規方法培養非小肺癌細胞A549細胞，選取生長狀態良好的、且處于對數生長期的A549細胞備用。將所培養的細胞分為溶劑對照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組。溶劑對照組細胞用濃度為40μM的DMSO孵育24小時；(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組細胞用不同濃度的(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育24小時。孵育細胞24小時后，用蛋白裂解液提取蛋白，考馬斯亮藍G-250測得蛋白濃度，接著蛋白質印跡法檢測自噬相關蛋白LC3的表達水平。實驗結果顯示：隨著(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮濃度的增加(1、5、10、20、40μM)與對照組相比LC3-Ⅱ的表達量逐漸增高，LC3-Ⅰ的表達量逐漸降低；在40μM處尤為明顯。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮誘導LC3-Ⅱ蛋白表達量的增多，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮促進非小肺癌細胞A549細胞自噬。實施例4：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在促進血管內皮細胞自噬中的應用。血管內皮細胞的制備：以常規方法培養血管內皮細胞，選取生長狀態良好的、且處于對數生長期的血管內皮細胞備用。將所培養的細胞分為溶劑對照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組。溶劑對照組細胞用濃度為40μM的DMSO孵育0.5、1、3、6或24小時；(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組細胞用不同濃度的(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育0.5、1、3、6或24小時；于倒置相差顯微鏡下觀察，在0.5、1、3、6和24小時，記錄細胞形態學變化并拍照。實驗結果顯示：對照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組處理血管內皮細胞后，細胞形態無肉眼可見變化；但(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮不同濃度處理組細胞隨著時間增加明顯產生空泡化，并且細胞在高濃度時明顯趨圓變亮；在24小時，40μM處尤為明顯。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮促進細胞空泡化，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮促進血管內皮細胞自噬(詳見附圖3)。實施例5：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在促進血管內皮細胞自噬中的應用。血管內皮細胞的制備：以常規方法培養內皮細胞，選取生長狀態良好的、且處于對數生長期的血管內皮細胞備用。將所培養的細胞分為溶劑對照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組。溶劑對照組細胞用濃度為40μM的DMSO孵育3、6、12或24小時；(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組細胞用不同濃度的(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育0.5、1、3、6或24小時。吸棄各孔中原有培養液，1×PBS清洗細胞1次，0.1mg/mL吖啶橙染液染色40s，1×PBS再次清洗，在倒置熒光顯微鏡下觀察酸性膜泡，先在白光下找到細胞，然后換為藍光，在藍光激發下細胞核為綠色，酸性膜泡為紅色。實驗結果顯示：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮明顯誘導細胞產生酸性膜泡；在24小時，40μM處尤為明顯。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮誘導細胞產生酸性膜泡，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮促進血管內皮細胞自噬(詳見附圖4)。實施例6：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在促進血管內皮細胞自噬中的應用。血管內皮細胞的制備：以常規方法培養血管內皮細胞，選取生長狀態良好的、且處于對數生長期的血管內皮細胞備用。將所培養的細胞分為溶劑對照組和(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組。溶劑對照組細胞用濃度為40μM的DMSO孵育1小時：(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮實驗組細胞用不同濃度(1μM、5μM、10μM、20μM、40μM)的(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮孵育1小時。孵育細胞1小時后，用蛋白裂解液提取蛋白，考馬斯亮藍G-250測得蛋白濃度，接著蛋白質印跡法檢測自噬相關蛋白LC3的表達水平。實驗結果顯示：隨著(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮濃度的增加(1、5、10、20、40μM)與對照組相比LC3-Ⅱ的表達量逐漸增高，在40μM處尤為明顯。(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮誘導LC3-Ⅱ蛋白表達量的增多，表明(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮促進血管內皮細胞自噬。實施例1～3是(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在促進非小肺癌細胞A549細胞自噬中的應用；實施例4～6是(3E，5E)-1-甲基-3-(3，4-二甲氧基苯亞甲基)-5-(3-吲哚亞甲基)-哌啶-4-酮在促進血管內皮細胞自噬中的應用。