本發明涉及一種可引導組織再生的膀胱膜生物支架及其制備方法和用途。

背景技術：

膀胱作為泌尿系統的一個重要器官，常常由于一些先天性的原因或炎癥、感染、腫瘤、創傷等引起一定的損害或缺損，這些均可以導致膀胱變小和受損，這就最終需要進行膀胱擴大和修補替代。因此需要使用一定的替代材料進行修復。傳統的替代材料主要有三種來源，有機合成材料、非泌尿系來源的天然替代材料、以及患者自體的泌尿系組織。但由于上述材料存在生物相容性問題或存在代謝異常、感染、尿路結石、攣縮甚至惡變的問題，或由于組織來源有限而導致術后膀胱容量過小等一系列的問題，均在不同程度上限制了這些材料在臨床上的應用。

膀胱脫細胞基質屬于一種天然的細胞外基質，是新開發的泌尿系統組織器官替代用生物材料，其仿生的機械性能和優良的組織相容性是多數生物和高分子材料所不能媲美的。這種材料作為細胞支架具有良好的生物相容性和結構相容性，有利于細胞生長、繁殖、分化和形成組織化，與以前應用的其他材料相比，具有生理再生重建膀胱組織、生物替代膀胱功能的顯著優勢。這類材料一般通過SDS和TritonX-100的處理而得到。

技術實現要素：

一方面，本發明提供一種制備膀胱膜生物支架的方法，包括：

(1)用NaOH處理膀胱組織；

(2)用TritonX-100和SDS以任意順序處理所得物，并重復一遍該步驟；

(3)用NaOH處理所得物；

(4)將所得物低溫干燥。

具體而言，在步驟(2)中，相繼用TritonX-100、SDS、TritonX-100和SDS進行處理；或者相繼用SDS、TritonX-100、SDS和TritonX-100進行處理。

在實施方式中，處理中使用的NaOH、TritonX-100和SDS的濃度分別為約1～5N、約0.5～5％和約0.5～5％。例如，NaOH的濃度可以是約1N、2N、3N、4N或5N。TritonX-100的濃度可以是約0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。SDS的濃度可以是約0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。NaOH可以溶于水溶液或緩沖液例如PBS、Tris等。TritonX-100和SDS可以分別溶于水或常用緩沖液例如PBS、Tris等。

在實施方式中，NaOH處理包括將膀胱組織浸泡在NaOH溶液中，例如約1～5N的NaOH溶液中。Triton X-100和SDS處理分別包括將膀胱組織浸泡在Triton X-100和SDS溶液中并攪拌。

在實施方式中，NaOH、TritonX-100和SDS的處理可以在約4～16℃下進行。

在實施方式中，在步驟(1)之前，使用蛋白酶抑制劑對膀胱組織進行處理。蛋白酶抑制劑可以是PMSF、胃蛋白酶抑制劑、亮抑蛋白肽酶等。

在實施方式中，在步驟(2)中，在TritonX-100和SDS的一遍處理之后，使用核酸酶對膀胱組織進行處理。核酸酶可以是脫氧核糖核酸酶、或脫氧核糖核酸酶加核糖核酸酶。

在實施方式中，可以在所得物的低溫干燥之前，除去所得物上的核酸、脂肪和其他雜質(包括前面處理中殘留的化學物質)。核酸、脂肪和其他雜質的去除可以通過例如在乙醇和異丙醇的混合水溶液、生理鹽水中完成。

在實施方式中，可以對得到的膀胱膜生物支架進行滅菌。滅菌可以在所得物的低溫干燥之前或之后進行。在所得物的低溫干燥之后進行的滅菌可以例如通過輻照滅菌等進行。

在實施方式中，膀胱組織取自哺乳動物，尤其是大型哺乳動物，例如牛、羊、豬等。

一方面，本發明提供一種由上述方法制得的膀胱膜生物支架，由膀胱組織的脫細胞基質構成。其中，本發明的膀胱膜生物支架的特征在于，DNA含量小于0.5wt％，脂肪含量小于0.5wt％，抗拉強度大于4MPa，標準膠原含量大于85wt％，縫合線撕裂力大于10N，疏松層的孔徑為約20～100μm。

另一方面，本發明提供上述膀胱膜作為膀胱修復材料的用途。

本發明通過優化脫細胞基質的制備方法，即以NaOH處理開始，并以NaOH處理結束，中間用SDS和TritonX-100進行處理，由哺乳動物的膀胱組織制備出組織相容性、生物降解性和力學強度良好，并且引導組織再生能力強的膀胱膜生物支架。在加以成本低廉的NaOH的處理后，可以有效殺滅膀胱膜生物支架上的細菌和病毒，并減少排異反應，得到的產品比傳統方法得到的更優。這種膀胱膜生物支架既能防止尿液外滲，又能為細胞提供生長代謝等的場所，是組織再生的基礎。由于可以取材自大型哺乳動物，所制得的膀胱膜生物支架的尺寸足以應用至人體的膀胱修復。在數個月的修復之后，新生膀胱與原膀胱具有相同結構和功能。

附圖說明

圖1示出根據本發明示例性實施方式的膀胱膜的外觀圖。

圖2示出根據本發明示例性實施方式的膀胱膜的疏松層的顯微照片。

圖3示出根據本發明示例性實施方式的膀胱膜包埋于大鼠皮下2周，取材后切片的HE染色圖，標尺為50μm。

圖4示出使用本發明示例性實施方式的膀胱膜進行6個月膀胱修復的比格犬以及正常比格犬的膀胱造影圖。

圖5A、5B和5C示出使用本發明示例性實施方式的膀胱膜進行6個月膀胱修復的比格犬以及正常比格犬的膀胱尿動力學檢測結果。

圖6A和6B分別示出使用本發明示例性實施方式的膀胱膜修復6個月后比格犬的膀胱切片的HE染色圖以及正常比格犬的膀胱切片的HE染色圖，標尺為50μm。

圖7A和7B分別示出使用本發明示例性實施方式的膀胱膜修復6個月后比格犬膀胱切片的α-平滑肌肌動蛋白的熒光染色圖以及正常比格犬膀胱切片的α-平滑肌肌動蛋白的熒光染色圖，標尺為50μm。

圖8示出使用本發明示例性實施方式的膀胱膜修復6個月后比格犬膀胱切片的CD31熒光染色圖，標尺為50μm。

具體實施方式

本發明提供的膀胱膜生物支架是膀胱組織的脫細胞基質，即除去細胞成分并保留細胞外基質的膀胱處理物。這種膀胱膜不僅抗原性低，而且可以很好地模擬組織器官的微環境。

脫細胞基質通常通過NaOH消蝕、SDS法或TritonX-100法來制備，各方法適用不同組織，且各有利弊。比如，TritonX-100較為柔和，一般不破壞細胞外基質的天然結構和成分，但是處理時間較長，且會損失一部分細胞外基質中的蛋白。SDS法可以保留較多細胞外基質，但是膠原纖維間可能有細胞碎片殘留。NaOH由于比較容易洗去，因此沒有在最終產品上的殘留問題，對修復的組織和細胞沒有毒性。

本發明的膀胱膜生物支架制備方法，通過結合上述三種方法，優化各方法的處理順序，使得制備出組織相容性好、生物降解性好、機械強度好并能引導組織再生的膀胱脫細胞基質。具體而言，在本發明中，有兩種處理順序。第一種是相繼用NaOH、TritonX-100、SDS、TritonX-100、SDS和NaOH進行處理。第二種是相繼用NaOH、SDS、TritonX-100、SDS、TritonX-100和NaOH進行處理。本發明的發明人注意到，當以NaOH處理開始，并以NaOH處理結束，可以有效殺滅細菌和病毒，并減少膀胱膜生物支架的排異反應。其中，本發明的膀胱膜生物支架以0.1g/ml比例浸提，內毒素含量小于0.5EU/ml。由于NaOH成本低廉，且有上述效果，使得本發明的產品優于傳統方法得到的產品。NaOH通常以約1～5N的濃度溶于水溶液或緩沖液例如Tris、磷酸鹽緩沖液等，優選為約2N的濃度。TritonX-100和SDS通常以0.5～5％的濃度分別溶于水或常用緩沖液例如PBS、Tris等，優選為約1％的濃度。NaOH每次處理的時間優選為約30分鐘，而TritonX-100和SDS每次處理的時間優選為約24小時。NaOH、TritonX-100和SDS 的處理可以在約4～16℃下進行。在各溶液的各個處理步驟中，為使處理效果更佳，可以數次更換新溶液。

在方法的步驟(1)之前，在處理溶液中添加蛋白酶抑制劑，比如PMSF等。在使用NaOH、SDS或TritonX-100對膀胱組織進行處理時，組織中的細胞破裂，細胞中的蛋白酶會釋放出來。如果不事先使用蛋白酶抑制劑進行處理，這些釋放出來的蛋白酶會降解細胞外基質中的蛋白，從而破壞膠原蛋白和彈性纖維等形成的支架結構。而這種支架結構正是膀胱修復中起重要作用的部分，一來可以為尿液容納提供足夠的機械和力學強度，二來可以作為引導組織再生的框架和基礎。

在步驟(2)中，在用TritonX-100和SDS以任意順序處理一遍之后，通過添加核酸酶來降解細胞中的DNA和RNA。此處，核酸酶指脫氧核糖核酸酶和/或核糖核酸酶。RNA一般自身并不穩定，在沒有添加核糖核酸酶的情況下，經過一段時間，也會自然降解。而DNA在細胞外的存在較為穩定，因此添加一定量的脫氧核糖核酸酶，可以保證DNA的降解，從而保證最后制得的膀胱膜的低抗原性。

在步驟(4)之前，一般要除去膀胱膜上殘留的核酸、脂肪和其他雜質(包括前面處理殘留的化學物質)。一般采用乙醇和異丙醇的混合水溶液。乙醇和異丙醇均能沉淀核酸和脂肪，并在蒸發時帶走其他一些雜質。也可以進一步用生理鹽水進行清洗，可以去除化學物質殘留。

在去除核酸和脂肪等之后，將所得的膀胱處理物低溫干燥。低溫干燥可以除去所得物中的水分和溶液殘留，完好保持膀胱組織剩余部分的結構。低溫干燥可以通過例如冷凍干燥的方法，在冷凍干燥儀中進行。

如果膀胱膜要用于醫療用途，例如用于臨床的膀胱修復，則需要對其進行滅菌。滅菌可以在所得物的低溫干燥之前或之后進行。在低溫干燥之后的滅菌可以通過輻照進行，例如鈷源照射等。

按照本發明方法得到的膀胱膜無毒性，抗原性極低，生物組織相容性好，具有生物可降解性(體內降解速度為約3個月)及降解可調節性，并具有可塑性和一定的機械強度。具體而言，本發明制得的膀胱膜包括致密層和疏松層，其中致密層為膀胱的粘膜層，而疏松層則主要是膀胱的肌肉層。致密層具有儲尿以及防止尿液外滲等功能特征。 疏松層富含膠原、彈性蛋白等，構成的三維空間可以引導細胞的生長和延伸，并為這些細胞提供真實原始的細胞外微環境，這些細胞可以在此獲取營養，進行氣體交換、排泄廢物以及生長代謝。疏松層在降解的同時，細胞分泌的基質逐漸替代本發明的膀胱膜，從而完成組織修復。

由于本發明的膀胱膜可以由哺乳動物，特別是大型哺乳動物制得，因此膀胱膜的尺寸可以足夠大，以在膀胱修復中提供足夠的儲尿空間。進行原材料采集時，要選取處死半小時以內的動物新鮮膀胱，迅速置于冰盒內保存。在使用之前，要去除多余的周圍組織。

通過本發明的方法，可以以便利和廉價的方式得到可引導組織再生的膀胱膜生物支架，該膀胱膜生物支架在不引起機體免疫排斥反應的情況下，一邊替代原損傷組織發揮膀胱功能，例如儲尿等，一邊引導細胞的生長和延伸，逐漸生成新的膀胱組織。經動物體內實驗驗證，新生膀胱與原膀胱具有同樣的結構和功能。

以下提供本發明的具體實施例，實施例僅為示例說明本發明，而并不限制本發明的范圍。

實施例

制備例1

分別取處死半小時以內的牛、豬、羊的新鮮膀胱，迅速置于冰盒內PBS緩沖液(pH 7.4)中保存。修剪去除膀胱周圍的肌肉、脂肪等多余組織，自膀胱頸部以下剪除，然后正中剪開膀胱直至圓頂部，整個膀胱成片狀攤開。PBS漂洗三遍后待用。

之后，按照以下步驟制備膀胱膜生物支架：

(1)將膀胱浸于Tris(pH 8.0，Amresco，code：0497)緩沖液中，緩沖液內含有蛋白酶抑制劑PMSF(sigma貨號78830)(濃度0.35ml/L)，室溫下持續浸泡攪拌24小時，間隔8小時更換一次緩沖液；

(2)將膀胱置于PBS(pH 7.4，Nissui，貨號ZZR05913)中，在15℃下置于搖床上60～80rpm漂洗1小時；

(3)在4℃下，在2N的NaOH水溶液中浸泡30分鐘；

(4)置于PBS中，在15℃下漂洗1小時；

(5)置于含有1％TrionX-100(Amresco，code:0694)的PBS緩沖液(即TBS)中，于15℃持續浸泡攪拌24小時，間隔8小時更換一次TBS緩沖液；

(6)置于PBS中，在15℃下漂洗1小時；

(7)置于含有1％SDS(Amresco code:0227)的Tris(pH 8.0)緩沖液中，在15℃下持續浸泡攪拌24小時，間隔8小時更換一次緩沖液；

(8)置于PBS中，在15℃下漂洗24小時，間隔8小時更換一次緩沖液；

(9)置于含有核糖核酸酶(sigma，貨號：6513，40u/ml)和脫氧核糖核酸酶(sigma，貨號：DN25，40u/ml)的1mol/L NaCl溶液中，室溫持續浸泡攪拌12小時；

(10)置于含有1％TrionX-100的PBS緩沖液(即TBS)中，15℃下持續浸泡攪拌24小時，間隔8小時更換一次TBS緩沖液；

(11)置于PBS中，在15℃下漂洗1小時；

(12)置于含有1％SDS的Tris(pH 8.0)緩沖液中，于15℃持續浸泡攪拌24小時，間隔8小時更換一次緩沖液；

(13)置于PBS中，在15℃漂洗2小時；

(14)在4℃下，于2N的NaOH水溶液中浸泡30分鐘；

(15)置于PBS中，在15℃漂洗2小時；

(16)置于乙醇(95％)水溶液與異丙醇(100％)的(體積比1:1)混合液中，15℃持續浸泡攪拌24小時，間隔8小時更換一次緩沖液；

(17)置于生理鹽水中漂洗，每隔2小時更換一次生理鹽水，共更換3～5次；

(18)將所得物放置在LABCONCO 6L Freeze Dry System凍干機中，-40℃冷凍4小時，-10℃凍干20小時；

(19)鈷源照射(15KGY)，密封保存。

由此，得到樣品1(牛)、樣品2(豬)和樣品3(羊)。

制備例2

使用牛的膀胱，如同制備例1進行膀胱膜的制備，除其中步驟(5)與步驟(7)交換順序并且步驟(10)與步驟(12)交換順序外。得到 樣品4。

制備比較例

使用牛的膀胱，如同制備例1進行膀胱膜的制備，除不進行其中的步驟(3)和步驟(14)外。得到比較樣品1。

實施例1：膀胱膜的理化特性

樣品1～4和比較樣品1的外觀和理化性質均相似，但是產品1～4在細菌和病毒殺滅方面更徹底，且排異反應更小。其中，樣品1的外觀如圖1所示。

(1)DNA含量：根據《中華人民共和國藥典》第三部附錄IX B規定方法檢測。

結果表明，樣品1～4和比較樣品1的DNA含量小于0.5wt％。

(2)脂肪含量：按GB/T 5009.3-2010第一法的規定方法進行。

結果表明，樣品1～4和比較樣品1的脂肪含量小于0.5wt％。

(3)抗拉強度：使用上海傾技產的QJ212型抗拉強度試驗機進行測定。

結果表明，樣品1～4和比較樣品1的抗拉強度為大于4MPa。

(4)標準膠原含量：按照羥脯氨酸含量測定法進行

A.1采用BergmanⅠ和Loxley R方法檢測

A.2試劑

2.1羥脯氨酸標準品(中科院上海生化所)1.6mmol/L：稱取20.98mg(0.02098g)羥脯氨酸，溶于0.001mol/L鹽酸溶液中，使總體積為100ml，4℃可保存數月。

2.2羥脯氨酸標準溶液(0.08mmol/L)：移取上述儲備液5.00ml，用水稀釋至100ml。

2.3氧化劑溶液：

a.氯氨T水溶液：稱取7.0g氯氨T(SIGMA產，貨號SIAL-23270-50G)溶于100ml水中，貯存在棕色瓶中置于暗處，可保存1～2周。

b.醋酸－檸檬酸緩沖溶液(pH 6.0)：稱取醋酸鈉(3H₂O)57.0g，檸檬酸三鈉(2H₂O)37.5g，檸檬酸(H₂O)5.5g，加少量水溶解，再加入385ml異丙醇，用水稀釋至1000ml，此溶液可長期保存使用。

臨用前將(a)和(b)液按1：4體積混合，即得到氧化劑溶液，置于 棕色瓶中。

2.4艾氏試劑(顯色劑)：對二甲氨基苯甲醛(國藥產，貨號10008792)1.18mol/L,高氯酸(國藥產，貨號10015161)2.44mol/L,異丙醇0.74(體積分數)，臨用前配制，置于棕色瓶中。

2.56mol/l鹽酸溶液：取54ml鹽酸，用水稀釋至100ml。

2.66mol/l氫氧化鈉溶液：稱取24g氫氧化鈉，用水稀釋至100ml。

2.7甲基紅指示劑：取甲基紅(國藥產，貨號71025214)0.1g，加0.05mol/L氫氧化鈉溶液7.4ml使之溶解，再加水稀釋至200ml。變色范圍pH 4.2～6.3(紅→黃)。

2.80.001mol/l鹽酸：9ml鹽酸稀釋至100ml得1mol/l鹽酸溶液。取1ml的1mol/l鹽酸溶液稀釋至1000ml。

A.3檢測方法

3.1樣品處理

取供試品0.1g，放入具塞試管(或安瓿)中，加入6mol/l鹽酸溶液10ml，封口后置135℃烤箱中水解4小時，冷卻后打開封口加入2滴甲基紅指示劑使之呈紅色，用6mol/l氫氧化鈉溶液中和該液至中性呈微黃色，然后用純化水稀釋至1000ml，過濾，作為樣品供試液。

3.2樣品測定

于帶塞的比色管中，加入0.5ml樣品供試液，加入0.5ml純化水，作為樣品溶液，再加入2ml異丙醇和1ml氧化劑溶液，搖勻，室溫放置4分鐘使其氧化。再加入2ml艾氏試劑，加塞搖勻，放入60℃水浴中加熱顯色，20分鐘后室溫放置1小時。用1cm比色皿，以純化水做參比液，在560nm處測定吸光度，并以試劑空白進行校正。

A.4標準曲線

分別取0.00；0.20；0.40；0.60；0.80；1.00ml羥脯氨酸標準溶液加入到6個比色管中，(羥脯氨酸濃度分別為0μmol/l；16μmol/l；32μmol/l；48μmol/l；64μmol/l；80μmol/l)不足1ml的用蒸餾水補至1ml，按上述步驟，測定其吸光度，繪制標準曲線。當標準溶液或待測溶液中羥脯氨酸的含量在0～80μmol/L范圍內時符合朗伯－比爾定律。羥脯氨酸最佳測定范圍為16～56μmol/L，吸光度相應為0.2～0.7Abs，每微克羥脯氨酸可產生0.097的吸光度。(由于顯色劑、氧化劑是用前配制，每一次試驗都需做標準曲線。)

結果表明，樣品1～4和比較樣品1的標準膠原含量為大于85wt％。(5)縫合線撕裂力：參照QB/T 4198-2011撕裂力的測定。

結果表明，樣品1～4和比較樣品1的縫合線撕裂力大于10N。

(6)疏松層的孔徑大小：

在冷凍掃描電子顯微鏡(HITACHI S-3000N&Quorum PP3000T)下觀察樣品1～4和比較樣品1的疏松層，可看到其孔徑大小為約20～100μm，其中樣品1的顯微圖如圖2所示。該孔徑范圍可以使得細胞附著在其中，均勻生長。

(7)內毒素含量：

內毒素檢測方法：

浸提液的制備：使用注射水按0.1g/ml比例浸提樣品24小時，測試浸提液的內毒素含量。

1、選擇所需規格(0.1ml)及靈敏度(0.25EU/ml)的鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司)、細菌內毒素標準品(中國食品藥品檢定研究所，批號：250601-201174)及細菌內毒素檢查用水(2ml/支，內毒素含量低于0.003EU/m，湛江安度斯生物有限公司)。

2、取內毒素標準品(凍干品)1支，用注射水溶解后稀釋至所需濃度備用。

3、取鱟試劑8支，2支作供試品檢查管，2支作陰性對照管，2支作陽性對照管，2支作供試品陽性對照管。

4、陰性對照管加入0.2ml檢查用水，其余各管加入0.1ml檢查用水；每支供試品檢查管另加入0.1ml樣品；陽性對照管加入0.1ml濃 度為2λ的內毒素標準品溶液；供試品陽性對照管加入0.1ml濃度為2λ內毒素的樣品。

5、封閉管口，輕輕搖勻，垂直放入37±1℃恒溫器中孵育60±2分鐘，然后觀察結果。試管孵育期間應避免任何震動。

6、將試管從恒溫器中輕輕取出，緩慢倒轉180°時，若管內形成凝膠，且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為(+)；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為(-)。保溫和拿取試管過程應避免受到振動造成假陰性結果。

7、陰性對照管必須是陰性，陽性對照管、供試品陽性對照管必須是陽性，否則實驗結果無效。

結果表明，在各制備例樣品的浸提液中，內毒素含量<0.5EU/ml，而在將制備比較例樣品同樣處理得到的浸提液中，內毒素含量>2.5EU/ml。

實施例2：膀胱膜的細胞相容性

將樣品1包埋于大鼠皮下，2周后，取出包埋的膀胱膜材料，采用蘇木精(SIGMA-701)和伊紅(BioRY-DH0047)進行HE染色。

圖3示出染色結果，未見炎癥反應，即沒有見到類似免疫細胞形態的細胞出現。

實施例3：膀胱膜的修復功能

取5只比格犬，1周歲，雄性，對其膀胱做半切模型。然后，將樣品1的膀胱膜縫合在剩余的原膀胱上，其中膀胱膜比切除部分稍大一些，留出縫合空間，使得修復面積和切除面積基本一致。

6個月后，采用膀胱造影及膀胱尿動力學檢測膀胱膜修復后的再生膀胱組織的功能。

對實驗比格犬和未做實驗的正常組比格犬(3只)靜脈注射造影劑，然后進行造影。具體操作描述如下，靜脈推注碘油造影劑(2ml/kg)，馬上進行X線連續拍片，觀察雙側腎臟及輸尿管顯影情況。膀胱開始顯影后，逆行插入8F尿管，向膀胱內注射造影劑，同時觀察膀胱顯影情況。

圖4示出實驗結果，0min顯示兩組均未看到陽性結石影像；3min可見造影劑排出，說明輸尿管排泄通暢，未見明顯梗阻；7min可見造影劑順利進入膀胱。膀胱造影顯示，相比于正常組，實驗組比格犬的膀胱形態基本正常，無明顯結石、憩室、占位。

此外，按照如下步驟，對兩組比格犬進行膀胱尿動力學檢測：

1.尿道外口插入尿動力檢測管；

2.排空比格犬膀胱內尿液，同時往肛門內插入腹壓檢測管；

3.壓力調零后與Nidoc 970A⁺尿動力學分析儀相連接；

4.啟動檢測，灌注速度20ml/min，當尿道外口剛有生理鹽水溢出時，標記為膀胱的最大容量；

6.儀器自動記錄壓力/容積曲線；

7.分析曲線，記錄膀胱最大容量、逼尿肌最大壓力、順應性等指標。

圖5的圖表示出結果，使用樣品1膀胱膜對比格犬的大面積損傷的膀胱進行修復后，修復后的膀胱形態接近正常水平，恢復效果明顯。其中，圖5A示出兩組比格犬的膀胱最大體積，圖5B示出膀胱的最大壓力，圖5C示出膀胱的順應性，順應性反映出膀胱的彈性，是體積和壓力的比值。

在以上兩個實驗之后，處死比格犬，暴露其膀胱組織。觀察膀胱外部結構，可發現，在膀胱膜縫合6個月后，再生的膀胱組織結構完整，無明顯疤痕組織，形狀與正常膀胱組織相似，且無尿液滲漏，手感有彈性，具有儲尿功能。

將再生的膀胱組織取下，用4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，制備厚5μm的病理學切片。經HE染色后，觀察再生組織的微觀結構。圖6示出染色結果，在再生組織中，大部分膀胱膜材料已降解，可見膀胱組織各層的再生，包括粘膜層、肌層和漿膜層。膀胱組織的收縮能力源于其肌層具有豐富的平滑肌組織，經膀胱膜修復后的再生膀胱組織具有明顯的束狀平滑肌組織的再生，與正常膀胱組織的形態結構十分類似。這些結果表明，本發明的膀胱膜具有明顯促進膀胱組織再生的修復效果。

為進一步鑒定膀胱平滑肌組織的再生，對10μm的冰凍切片進行膀胱平滑肌特異性標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的免疫熒光染色， 具體步驟如下：

1.冰凍切片室溫晾15min；

2.PBS(pH7.4)浸泡10min；

3.血清(中杉金橋產羊血清工作液，貨號ZLI-9022)室溫封閉30min；4.加入一抗(ABCAM產，貨號ab119952，1:500稀釋)4℃過夜；

5.第二天，切片PBS清洗5min×3次；

6.血清室溫封閉15min；

7.加入熒光二抗(invitrogen產貨號A-21202，1:500稀釋)，室溫60min

8.PBS清洗5min×3次

9.封片

10.觀察

圖7示出染色結果，膀胱膜在修復6個月后，膀胱平滑肌組織再生明顯，且其結構與正常膀胱平滑肌組織類似。圖中較亮的點為α-SMA特異性陽性纖維，稍暗的點為細胞核。

之后，對10μm的冰凍切片進行血管內皮細胞特異性標志物CD31的熒光染色，具體步驟同上，其中一抗為ABCAM產，貨號ab26975，1:500稀釋，二抗為invitrogen產，貨號A-21202，1:500稀釋。

圖8示出染色結果，在新生的膀胱組織中，有明顯的血管生成(圖中圓圈為血管)。

從以上結果看來，本發明的膀胱膜可以作為膀胱修復膜使用，由于膀胱與尿道、輸尿管細胞外基質的超微結構相似，因此本發明的膀胱膜還可以用于其他組織的再生引導，如尿道、輸尿管等。