本發明涉及一種有序的生物修復材料及其制備方法和用途。

背景技術：

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是一種嚴重的神經系統創傷，具有高度的致殘性。如今，中樞神經損傷后的神經修復被證明是可能的，然而常規的手術手段只能使這些傷者中的極少數人徹底康復。多項研究表明，脊髓內部微環境不適合是造成脊髓再生能力十分有限的主要原因。脊髓損傷后在很短的時間內，在受損部位形成了空洞和疤痕，在這樣一個不利的環境下，軸突即使能夠生長，也很難逾越這樣的一個障礙。目前，對于脊髓損傷，應用生物支架來橋接損傷兩側的脊髓，結合神經營養因子或藥物或干細胞，從而促進軸突再生是一個重要的治療策略。在制備用于神經再生的生物支架材料時，材料的取向性非常重要，因為脊髓神經纖維(軸突)的生長是有方向的。目前，神經損傷修復材料主要由化學合成的材料制成，它們往往細胞相容性不好，容易引起免疫排斥問題。

此外，肌腱損傷是最常見的運動損傷，損傷機率高，致殘率也高。肌腱損傷后，若未予以及時修復，常會導致肢體功能障礙，重者甚至殘廢。對于較嚴重的肌腱損傷往往需要手術干預，對于缺損性肌腱損傷往往需要植入修復體，如：自體肌腱、同種異體肌腱、異種肌腱或人工肌腱。前三者由于移植體來源有限或者排異反應等諸多原因，不能滿足臨床治療需求，因此開發人工肌腱具有重要現實意義。肌腱獨特的生物力學性能主要歸因于肌腱細胞外基質(ECM)的高度組織性。細胞外基質主要由I型膠原蛋白構成，肌腱中的ECM呈等級束狀且分不同層面平行地排列在基質蛋白中，棱形的肌腱成纖維細胞(也稱肌腱細胞)呈縱向排列且大量鞘樣細胞延伸至細胞外基質。I型膠原可以誘導肌腱胞外基質的形成增加410％。因此，基于膠原的并有一定取向性的材料是用于肌腱損傷修復的良好材料。

牛的肌肉表面存在一層保護組織，通常稱為筋膜，屬于肌腱的延伸部分，其主要成分與肌腱一樣，由I型與III型膠原纖維構成。這種材料具有平行排列的纖維狀結構，如圖1所示，有可能作為一種合適的神經導向材料和肌腱修復材料。

技術實現要素：

一方面，本發明涉及一種制備有序修復材料的方法，其包括：

(1)使筋膜在氫氧化鈉溶液中處理；

(2)使所得物在去污劑溶液中處理；

(3)使所得物干燥。

在實施方式中，筋膜可以取自哺乳動物，例如牛、羊、馬等，優選為牛。筋膜是新鮮的筋膜。

在實施方式中，在步驟(1)之前，除去筋膜組織上粘附的組織，例如肌肉組織等。在實施方式中，還包括在步驟(1)之前去除筋膜組織中的脂肪。

在實施方式中，氫氧化鈉溶液可以是氫氧化鈉的水溶液。氫氧化鈉溶液的濃度可以是約2～5N，例如約2N、3N、4N或5N。步驟(1)可以在約4℃～16℃進行，例如約4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或16℃。此外，步驟(1)可以進行約30分鐘至300分鐘，例如約30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘、70分鐘、80分鐘、90分鐘、100分鐘、110分鐘、120分鐘、150分鐘、300分鐘等。在步驟(1)中，可以更換新的氫氧化鈉溶液，例如更換2～4次新的氫氧化鈉溶液。

在實施方式中，步驟(2)中的去污劑可以是化學去污劑，例如吐溫-80、吐溫-20、TritonX-100等。去污劑溶液的濃度可以是約1～5％，例如約1％、2％、3％、4％、5％等。去污劑的溶液可以是去污劑的水溶液、緩沖液溶液等，其中緩沖液可以是磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液等。

在實施方式中，在步驟(3)之前，對所得物進行充分清洗。其中，可以用去熱源水對材料進行清洗；也可以用其他水例如蒸餾水、去離子水進行清洗。

在實施方式中，在步驟(3)中，可以采用低溫干燥使所得物干燥，例如冷凍真空干燥等。在所得物干燥之后，可以進行滅菌，例如輻照滅菌等。

另一方面，本發明提供由上述方法制備得到的有序修復材料，其為線性膠原纖維。該線性膠原纖維包含I型膠原纖維和III型膠原纖維，其保留有天然膠原纖維的結構，并可以根據需要聚集成不同直徑的束狀，也可以修剪成任意形狀和長度。此外，這些線性纖維具有利于細胞貼附的粗糙表面，并具有良好的生物相容性和生物可降解性。而且，在細菌和病毒殺滅方面更徹底，且排異反應更小。

再一方面，本發明提供本文有序修復材料作為組織修復材料的用途。

在實施方式中，本發明的有序修復材料可以用于組織的修復，尤其是神經和肌腱的修復。

本發明以天然筋膜為基礎，用NaOH處理結合常見的去污劑處理，即可以以簡單的處理工藝在短時間內得到有序排列的線性膠原纖維。NaOH處理可以有效殺滅細菌和病毒，并且減少最終產品的排異反應。這些線性膠原纖維保持有天然膠原纖維的結構，可以根據需要構成任意長度的片狀或任意直徑和長度的束狀。此外，這些線性膠原材料具有可以引導神經細胞和成纖維細胞等在膠原纖維方向上生長的有序方向性、利于細胞粘附的粗糙纖維表面、應用于有機體的良好的生物相容性和生物可降解性。因此，本發明的線性膠原纖維可以用作組織修復材料，特別是用作神經修復材料和肌腱修復材料。

附圖說明

圖1示出天然牛筋膜的平行排列的纖維狀結構。

圖2A示出根據本發明示例性實施方式的線性膠原纖維的宏觀外觀圖，其中圖下方為cm尺，可見纖維長為約7cm，圖2B示出根據本發明示例性實施方式的線性膠原纖維的掃描電鏡圖。

圖3A示出大鼠背根神經節神經元在普通培養平皿中的軸突生長方向，圖3B示出大鼠背根神經節神經元在根據本發明示例性實施方式的線性膠原纖維上的軸突生長方向，圖3C示出大鼠小腦顆粒細胞在根 據本發明示例性實施方式的線性膠原纖維上的生長情況，其中各圖中的標尺均為200μm。

圖4A示出大鼠間充質干細胞在根據本發明示例性實施方式的線性膠原纖維上的生長情況，圖4B示出人成纖維細胞在根據本發明示例性實施方式的線性膠原纖維上的生長情況，其中各圖中的標尺均為200μm。

具體實施方式

天然筋膜的結構緊密，成分較為復雜，不適合細胞的貼附和生長，而且有引起機體免疫排斥的風險。

本發明通過氫氧化鈉消蝕與去污劑處理的結合，除去筋膜中的細胞成分并保留細胞外基質，得到具有有序結構、良好的生物相容性和良好的生物可降解性的線性膠原纖維。而且，這種線性膠原纖維在細菌和病毒殺滅方面更徹底，且排異反應更小。

本發明人發現，氫氧化鈉和去污劑均可以起到脫細胞的作用，但強度不同。去污劑例如吐溫-80、TritonX-100的處理較為柔和，一般不破壞細胞外基質的天然結構和成分，但是處理時間較長，且會損失一部分細胞外基質中的蛋白。而NaOH的作用更為劇烈，但是由于比較容易洗去，沒有在最終產品上的殘留問題，對修復的組織和細胞沒有毒性。兩種處理的結合可以較好地去除筋膜的抗原性，并保留其I型和III型膠原纖維，主要保留I型膠原纖維。比起單獨去污劑的處理，NaOH的在先處理可以有效殺滅細菌和病毒，并且減少最終產品的排異反應。由于NaOH成本低廉，且有上述效果，使得本發明的產品優于傳統方法得到的產品。具體地，本發明提供一種制備有序修復材料的方法，其包括：

(1)使筋膜在氫氧化鈉溶液中處理；

(2)使所得物在去污劑溶液中處理；

(3)使所得物干燥。

筋膜可以是取自哺乳動物，例如牛、羊、馬等的新鮮筋膜。由于來源較為便利且價廉，而處理后得到的材料沒有免疫原性，因此本發明的修復材料可以大量應用于臨床。

所使用的氫氧化鈉溶液為氫氧化鈉的水溶液，濃度可以是約2～5N，例如約2N、3N、4N或5N。當氫氧化鈉的濃度小于2N時，脫細胞效果不好，而當濃度大于5N時，對膠原材料的物理性能具有一定破壞作用。步驟(1)可以在約4℃～16℃的低溫下進行，優選為約10℃。此外，步驟(1)可以進行30～300分鐘，并且優選在此過程中更換新的氫氧化鈉溶液，例如更換2～4次新的氫氧化鈉溶液。延長的處理時間和溶液的更新可以使處理效果更好，即更好地去除細胞成分。

在步驟(2)中，去污劑的選擇要考慮其強度以及其殘留對所得材料應用的影響。經測試，吐溫-80、吐溫-20、TritonX-100可以用在本發明中，并具有良好的效果。而且，本領域技術人員可知，這幾種去污劑可以替換使用。去污劑的濃度在約1～5％的范圍內，濃度過低會使處理效果變差，而濃度過高會影響材料的性能。此外，去污劑的處理時間和溫度可以由本領域技術人員適當確定。

在步驟(3)中，可以采用低溫干燥對所得物進行干燥。低溫真空干燥可以除去所得物中的水分和溶液殘留，完好保持筋膜處理后剩余部分的結構。低溫干燥可以通過例如冷凍真空干燥的方法，在冷凍干燥儀中進行。

如果本發明方法的所得物要用于醫療用途，需要對所得物進行充分清洗，并進行殺菌消毒。其中，可以用去熱源水對材料進行清洗；也可以用其他水例如蒸餾水、去離子水進行清洗并輻照殺菌。其中，去熱源水為不含熱源物質的水。去熱源水的制備方法為本領域技術人員所知，如用超濾膜、反滲透、層析等方法處理水等而得到。

使用本發明方法制備得到的有序修復材料是線性膠原纖維。該線性膠原纖維保留有天然膠原纖維的結構，可以根據要求隨意聚集成不同直徑的束狀，也可以修剪成任意長度，方便用于任意大小和任意部位的組織修復。

本發明的線性膠原纖維還具有方向性。這種方向性對于神經纖維和肌腱成纖維細胞的生長尤其重要。其中，神經纖維(軸突)的方向性是準確有效傳送神經脈沖的基礎，而本領域人員已知肌腱的成纖維細胞呈縱向排列。本發明的線性膠原纖維不僅給神經纖維和肌腱成纖維細胞的生長提供支持，還可以與藥物等結合使用來促進兩種細胞的 生長。

另外，本發明的有序修復材料具有良好的生物相容性。本發明的有序修復材料由I型和III型天然膠原蛋白構成，主要為I型膠原蛋白，沒有免疫原性，因此可以應用到組織修復中。在損傷的脊髓中，本發明的膠原材料可以搭接損傷脊髓的兩側，為軸突的生長提供支持，并且可以結合神經營養因子或藥物等促進神經再生。而本發明神經纖維的粗糙表面，有利于細胞的貼附。此外，已經證實，肌腱的獨特生物力學性能主要歸因于肌腱細胞外基質的高度組織性，而本發明的有序修復材料中包含的I型膠原可以誘導肌腱細胞外基質的形成增加410％。

目前用于組織損傷修復的膠原生物材料，主要從酸溶的膠原制備，工藝復雜，步驟較多，而且主要以無序的管狀和膠原凝膠為主。本發明的加工方法，以機體天然筋膜為基礎，利用獨特的處理工藝，開發出可用于脊髓和肌腱損傷修復的新材料，其對細胞具有良好相容性，免疫原性低。更重要的是，這種材料可以使神經元或肌腱再生種子細胞沿著膠原纖維的方向有序生長，這對于肌腱及脊髓損傷的修復非常重要。因此，本發明的有序修復材料具有很好的臨床應用前景。

以下提供本發明的具體實施例，實施例僅為示例說明本發明，而并不限制本發明的范圍。

制備例.線性膠原纖維的制備

1.取新鮮帶有白色筋膜的成年牛的肌肉組織，用10℃去離子水沖洗3遍；

2.用鑷子和手術刀分離出筋膜，盡量去除內層粘附的肌肉組織；

3.將外層的脂肪、附著的肌肉血管組織去除后，用氫氧化鈉水溶液處理(氫氧化鈉的摩爾濃度、溫度和處理時間見以下表格)；

4.更換新的氫氧化鈉溶液(摩爾濃度、溫度和處理時間與上一步保持一致)，該步驟重復次數見以下表格；

5.用去污劑溶液(去污劑的種類、濃度和溶劑見以下表格)在16℃下處理60分鐘；

6.用去熱源水對材料進行充分清洗；

7.將材料用冷凍干燥儀凍干。

參照以下表格，按照上述步驟進行線性膠原纖維的制備。

在步驟1中采用來自成年羊的肌肉組織，如上進行制備例14～26；在步驟1中采用來自成年馬的肌肉組織，如上進行制備例27～36。

制備比較例.僅使用去污劑制備線性膠原纖維

1.取新鮮帶有白色筋膜的成年牛的肌肉組織，用10℃去離子水沖洗3遍；

2.用鑷子和手術刀分離出筋膜，盡量去除內層粘附的肌肉組織；

3.將外層的脂肪、附著的肌肉血管組織去除后，用5％的吐溫-20水溶液在16℃下處理60分鐘；

4.用去熱源水對材料進行充分清洗；

5.將材料用冷凍干燥儀凍干。

得到比較樣品1。

實施例1.線性膠原纖維的形態觀察

對各個制備例和制備比較例得到的樣品進行形態觀察。可以看到，各個制備例和制備比較例中得到的線性膠原纖維均可以聚集成束狀，如圖2A所示，其長度和束狀直徑可以隨意調節，并且呈現出方向性。之后，通過掃描電鏡來觀察制備例和制備比較例的膠原纖維，其中圖2B示出本發明制備例13膠原纖維的其中一根的結構，發現線狀膠原纖維具有有序結構，其粗糙的表面結構有利于細胞的貼附。

實施例2.線性膠原纖維的內毒素含量測定

盡管制備例和制備比較例得到的樣品在形態上沒有差別，但是制備例得到的產品在細菌和病毒殺滅方面更徹底，且排異反應更小。在各制備例樣品的浸提液中，內毒素含量<0.5EU/ml，而在將制備比較例樣品同樣處理得到的浸提液中，內毒素含量>2.5EU/ml。

內毒素檢測方法：

浸提液的制備：使用注射水按6cm²/ml比例浸提材料24小時，測試浸提液的內毒素含量。

1、選擇所需規格(0.1ml)及靈敏度(0.25EU/ml)的鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司)、細菌內毒素標準品(中國食品藥品檢定研究所，批號250601-201174)及細菌內毒素檢查用水(2ml/支，內毒素含量低于0.003EU/ml，湛江安度斯生物有限公司)。

2、取內毒素標準品(凍干品)1支，用水溶解后稀釋至所需濃度備用。

3、取鱟試劑8支，2支作供試品檢查管，2支作陰性對照管，2支作陽性對照管，2支作供試品陽性對照管。

4、陰性對照管加入0.2ml檢查用水，其余各管加入0.1ml檢查用水；每支供試品檢查管另加入0.1ml樣品；陽性對照管加入0.1ml濃度為2λ的內毒素標準品溶液；供試品陽性對照管加入0.1ml濃度為2λ內毒素的樣品。

5、封閉管口，輕輕搖勻，垂直放入37±1℃恒溫器中孵育60±2分鐘，然后觀察結果。試管孵育期間應避免任何震動。

6、將試管從恒溫器中輕輕取出，緩慢倒轉180°時，若管內形成凝膠，且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為(+)；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為(-)。 保溫和拿取試管過程應避免受到振動造成假陰性結果。

7、陰性對照管必須是陰性，陽性對照管、供試品陽性對照管必須是陽性，否則實驗結果無效。

實施例3.神經元在線性膠原纖維上的生長

分離SD大鼠的背根神經節，分別接種在普通平皿或本發明制備例13的線性膠原纖維上。

具體而言，在解剖顯微鏡下暴露E15胎鼠的椎管和椎間孔，用鑷子將脊髓連帶兩旁的神經節一起取出，用顯微鑷逐個摘除神經節。用0.25％(vol/vol)的胰蛋白酶(Sigma，SH3004201B，溶于PBS緩沖液)37℃消化30min，用約2ml血清(invitrogen，10099141)終止反應。300目篩網過濾，1000rpm離心5min收集細胞。PBS(pH 7.4)清洗一遍后，離心收集，用適量DMEM/F12完全培養液(invitrogen,11330032)吹打成單細胞懸液，分別接種在普通平皿或本發明制備例13的線性膠原纖維上。接種后放在二氧化碳培養箱(品牌和型號：HERAcell 150i)中培養(37℃，5％CO₂)。

接種7天后，在顯微鏡下觀察背根神經節球的生長情況。如圖3A所示，普通平皿中背根神經節球的軸突四散分布，而在本發明的線性膠原纖維上，背根神經節的軸突沿著膠原纖維的方向有序分布，如圖3B所示。

此后，如下所述制備出大鼠的小腦顆粒細胞。出生一周的SD大鼠，延顱骨中縫打開顱骨，分離小腦置于冷的PBS(pH 7.4)中。將分離腦組織的腦膜和血管剝離干凈。剪碎腦組織至1mm³的小塊。將剪碎的腦組織轉移至2mL 0.25％(vol/vol)的胰酶(Sigma，SH3004201B，溶于PBS緩沖液)中，37℃消化15分鐘，加入100微升胰酶抑制劑(invitrogen，17075-029)終止消化。5分鐘后再加入4mL的DMEM/F121:1基礎培養基，用玻璃滴管將組織吹散，轉移上清至新離心管中，向剩余的沉淀物中加入4mL的新鮮基礎培養基繼續吹打，轉移上清后再吹打一次。將收集的所有上清和沉淀合并在一起，用40μm的濾膜(BD,352340)過濾。將濾后的液體于500g離心5分鐘，去除上清，將沉淀用神經細胞培養基(含2％B27的DMEM-F12)(B27，invitrogen,17504044；DMEM-12，invitrogen,11330032)重懸，計數后接種至添 加有本發明制備例13的線性膠原纖維的包被有多聚賴氨酸(sigma，P0899)的培養皿上。

具體而言，將所得的大鼠小腦顆粒細胞以5×10⁴/mm³的密度接種在本發明的線性膠原纖維上。接種后放在二氧化碳培養箱(品牌和型號：HERAcell 150i)中培養(37℃，5％CO2)。

2天后，可以看到，神經元細胞沿線性膠原纖維的纖維方向生長，呈現出很好的有序性，如圖3C所示。

實施例4.大鼠間充質干細胞及人成纖維細胞在線性膠原纖維上的生長

如下所述制備出大鼠間充質干細胞。選取出生后4周的SD大鼠，脫臼處死，75％酒精浸泡5min，在無菌條件下取出雙側脛骨、股骨，然后清除兩端骨骺及軟組織，在暴露出骨髓腔后，把無血清L-DMEM培養液(HYCLONE，SH3002101B)作為沖洗液，用無菌注射器反復沖洗骨髓至透明為止，然后將所得的沖洗液裝入15mL離心管；1000rpm離心5min，棄上清。用10mL無血清L-DMEM培養液重懸細胞，200目濾網過濾成單細胞。使用血球計數板計數，細胞以1×10⁶/mL接種于含10％血清的L-DMEM培養基中。將細胞置于5％CO₂濃度，37℃培養箱內進行培養。24h半量換液，48h全量換液，然后每3天進行培養液的更換。當細胞增殖并逐漸融合到90％時，用0.25％的胰酶進行消化傳代，然后以1×10⁶/mL的密度，在培養皿內進行傳代，擴增培養。

如下制備得到人成纖維細胞。將人包皮組織用PBS溶液漂洗三次，洗去組織表面附著的血細胞；將包皮組織置于PBS的培養皿中，用眼科剪去除皮膚內表面附著的皮下組織；再將包皮組織置于新的盛有PBS的3.5cm培養皿中，用眼科剪將組織剪成1mm³的組織塊；1000rpm離心2min；用1ml DMEM培養基(GIBCO,11330032)重懸組織塊，轉移至T25培養瓶(Corning，430639)中，用Pasteur管(Fisher，13-678-20A)使組織塊均勻分布，并小心吸出多余培養基；將T25培養瓶倒置，放置于37℃培養箱中；約20～24h后，將T25培養瓶翻轉，加入1～1.5ml培養基；隔日換液，約3～7日后可見細胞從組織塊周圍爬出；約10～14日后可進行傳代(0.25％TE消化)。

取生長狀態良好的大鼠MSC細胞(P3代)或人成纖維細胞(P5代)，0.25％胰酶消化后，將細胞離心后重懸于約1ml DMEM培養基(GIBCO,11330032)中，接種于制備例13的線性膠原纖維上。置于37℃，5％CO₂培養箱中放置4～5h，加入適量DMEM培養基，以淹沒線性膠原纖維為宜。之后，繼續在培養箱中培養。

2天后，可以在顯微鏡下觀察到，大鼠間充質干細胞(圖4A)和人成纖維細胞(圖4B)在本發明的線性膠原纖維上沿材料纖維方向良好生長，如圖4所示。