本發明是在韓國教育部的支援下根據項目編號NN11700實現的，上述項目的研究管理專業機關為韓國研究財團，研究事業名稱為“支援一般研究者事業(基本)”，研究項目名稱為“開發與用于治療急性骨髓性白血病的口服用FMS樣酪氨酸激酶3(FLT3)抑制劑相關的研究”，主管機關為光州科學技術院，研究期間為2013年11月1日至2014年10月31日。

本專利申請主張2014年6月2日在韓國專利廳提交的韓國專利申請第10-2014-0067083號的優先權，上述專利申請的公開內容作為參照引入本說明書中。

本發明涉及包含葉綠素a或脫鎂葉綠酸a的皮膚狀態改善用組合物。

背景技術：

皺紋、下垂及松弛是由環境因素和遺傳因素，如紫外線(UV)、紅外線及激素的變化等各方面引起的皮膚老化的特征[1、2]。老化的皮膚的結構特征主要表現為真皮(dermis)的變化，而真皮由膠原(collagen)、透明質酸(hyaluronic acid)、彈性蛋白(elastin)、纖維連接蛋白(fibronectin)、蛋白聚糖(proteoglycan)及其他細胞外基質蛋白質(extracellular matrix protein)形成。在這種結構的結構要素中，主要由成纖維細胞(fibroblast)合成的第一型膠原在皮膚結合組織中，作為最豐富的蛋白質，對皮膚起支援強度和彈力性的作用[3]。

長期暴露于紫外線下成為早期皮膚老化或光輻射皮膚老化的主要原因[23]。光輻射皮膚老化可解釋為由紫外線造成的反復性的炎癥過程所引起的。皮膚炎癥生產出多種基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，這將會在真皮及表皮中以非正常方式分解細胞外基質，且引起喪失功能的基質結構要素的蓄積[24]。因基質分解和皮膚炎癥等，而所積累的皮膚損傷會導致生產過多的基質金屬蛋白酶，且這與皺紋的形成有關。

據報告，多種化合物及植物提取物對皮膚具有抑制炎癥及改善皺紋的效果。對動物范例(無毛小鼠)口服給藥維生素C、E、碧容健及月見草油(evening primrose oil)復合體的情況下，具有可以緩解因長期暴露于紫外線而產生的皺紋的效果[27]。據報告，人參成分、鞣花酸(ellagic acid)及綠茶的多酚(polyphenol)也具有改善由紫外線引起的皮膚老化的效果[28、29、30]。被解釋為，大多數的多酚的皺紋改善效果與抗氧化作用有關[30]，呈現改善皺紋效果的作用方式與基質金屬蛋白酶的生成抑制有關。

在本發明中，發明人們發現了葉綠素a(Chlorophyll a)及脫鎂葉綠酸a(Pheophorbide a)具有緩解由紫外線引起的皮膚炎癥，及改善皺紋的效果。并且，脫鎂葉綠酸a呈現出了抑制由紫外線誘導的基質金屬蛋白酶生產的效果。這種研究結果表現出葉綠素a及脫鎂葉綠酸a可以以皮膚狀態改善用物質來被使用。

在本說明書全文中參照了多篇論文及專利文獻，且其引用有所標記。所引用的論文及專利文獻的公開內容，作為參照其全部插入于本說明書中，從而明確說明了本發明所屬技術領域的水準及本發明的內容。

技術實現要素：

技術問題

本發明人們為了開發能夠有效改善如紫外線等外部刺激引起的皮膚損傷的物質，研究并作出了努力。其結果發現，葉綠素a及脫鎂葉綠酸a對如皮膚皺紋的改善及皮膚炎癥的緩解等皮膚狀態改善非常有效，從而完成了本發明。

因此，本發明的目的為提供皮膚狀態改善用組合物。

本發明的另一目的及益處根據下述的發明的詳細說明、發明要求保護范圍及附圖來更加明確。

解決問題的方案

根據本發明的一實施方式，本發明提供皮膚狀態改善用組合物，包含葉綠素a或脫鎂葉綠酸a有效成分。

根據本發明的再一實施方式，本發明提供紫外線引起的皮膚損傷預防、改善或治療用組合物，包含葉綠素a或脫鎂葉綠酸a作為有效成分。

根據本發明的另一實施方式，本發明提供曬傷預防或治療用組合物，包含葉綠素a或脫鎂葉綠酸a作為有效成分。

本發明人們為了開發能夠有效改善如紫外線等外部刺激引起的皮膚損傷狀態的物質，研究并作出了努力，其結果確認到，葉綠素a及脫鎂葉綠酸a對如皮膚皺紋的改善及皮膚炎癥的緩解等皮膚狀態改善非常有效。

葉綠素(Chlorophyll)作為在植物中最豐富的成分，一般在以3:1至3:2的比率具有a、b型，存在于高等植物中。傳統上，植物的葉綠素通過抗-炎癥效果來用于管理傷口、燒傷及潰瘍等的受傷[4]，也作為用于增進健康的健康食品來使用過[5]。此外，包含葉綠素的植物提取物的化妝品組合物也為了管理皮膚損傷而被使用[6]。

葉綠素生成多個種類的派生物，而其中包含脫鎂葉綠素(pheophytin)、脫鎂葉綠酸(pheophorbide)、氯(chlorin)及植烷酸(phytanic acid)。以往的研究者闡明了包含葉綠素、脫鎂葉綠素及脫鎂葉綠酸的葉綠素派生物具有潛在的化學性癌預防功能[7、8]。并且，還闡明了，成罐頭的綠色蔬菜共同包含的脫鎂葉綠素、原焦脫鎂葉綠酸(pyropheophytin)及脫鎂葉綠酸派生物具有潛在腫瘤抑制效果[9、10]。可知的是，脫鎂葉綠酸也用作對于癌進行光動力學治療的光毒性(phototoxic)物質[11]。但是，現在還不知道脫鎂葉綠酸或葉綠素對皮膚皺紋改善具有何種效果。

本說明書中的“皮膚狀態改善”雖然意味著改善皮膚皺紋、緩解皮膚炎癥或防止皮膚老化，但不局限于此。

皮膚皺紋是由包括陽光的多種因素引起真皮中的膠原纖維、彈力纖維等發生變性，且由于皮膚水分減少則皮膚彈性下降，從而皮膚發生折疊而形成的。在多種因素中紫外線為最主要的原因。

根據本發明任一實施例，若對小鼠照射紫外線后，口服給藥葉綠素a或脫鎂葉綠酸a，則具有改善皺紋的效果。

在皮膚炎癥反應中免疫細胞的活性起重要的作用。被活化的免疫細胞或免疫細胞生產的細胞因子等通過不斷刺激周圍輔助細胞引起細胞的過度的活化或細胞凋亡，來誘發組織的破壞等副作用，從而引發炎癥反應。在皮膚炎癥反應中，黏附分子(adhesion molecule)在角化細胞(kerat inocyte)、單核細胞(monocyte)及淋巴細胞(lymphocyte)間的結合中起重要的作用，而黏附分子包括細胞內粘附分子-1(Intracel lular adhesion molecule-l，ICAM-l)、血管粘附分子-1(vascular adhesion molecules-1，VCAM-1)和E-選擇(E-selection)等。如上所述的黏附分子將多種免疫相關細胞用皮膚組織浸潤，從而通過皮膚細胞和免疫細胞間的各種相互反應來引發了炎癥反應。因此，抑制這種粘合分子的表達，從而可以緩解皮膚炎癥的反應。

根據本發明的任一實施例，在對小鼠照射紫外線后口服給藥葉綠素a或脫鎂葉綠酸a的情況下，細胞內粘附分子-1的表達降低，且真皮中的炎癥細胞的浸潤也減少了。這種結果表明，葉綠素a或脫鎂葉綠酸a具有緩解由紫外線引起的皮膚炎癥反應的效果。

皮膚老化根據對老化的影響因素可分為內因性老化(intrinsic aging)和外因性老化(extrinsic aging)。內因性老化為隨著年齡的增長皮膚的結構和生理功能與環境無關的減退，外因性老化是因為皮膚長時間暴露于太陽光等外部環境而產生的。尤其，將光造成的老化稱為光輻射皮膚老化(photoaging)，紫外線會成為皮膚老化的生理學及形態學變化的主要原因。因紫外線生成有害活性氧后，若無法借助體內的多種保護裝置來有效地去除，則會引發一系列的炎癥反應來造成皮膚損傷。

本發明的葉綠素a或脫鎂葉綠酸a具有改善紫外線引起的皮膚皺紋及緩解皮膚炎癥的效果，這意味著，在皮膚老化中具有改善由光輻射皮膚老化引起的皮膚狀態的效果。

紫外線分為紫外線A(UVA，200～280nm)、紫外線B(UVB，280～320nm)、紫外線C(UVC，320～400nm)三種，紫外線C基本上被臭氧層吸收，只有紫外線A和紫外線B到達地表，而對皮膚產生影響。尤其，其中紫外線B為在紫外線中對皮膚造成的損傷最為嚴重。紫外線B到達真皮上部，迅速引起燒傷或紅斑，若進一步進行，則形成皮膚表層黑色素且造成色素的沉積，還會導致上皮細胞的增殖、DNA損傷等，從而誘發皮膚皺紋及皮膚癌。并且，據悉還會在皮膚細胞中誘發炎癥反應。

如上所述，本發明的葉綠素a或脫鎂葉綠酸a呈現出改善紫外線引起的皮膚皺紋及緩解皮膚炎癥的效果，可有效地用于預防、改善及治療紫外線引起的皮膚損傷。

本說明書中“曬傷(sunburn)”的主要原因為紫外線，若紫外接到達皮膚上，則不僅直接作用于血管壁，而且大部分被皮膚細胞吸收來進行刺激，使得分泌組織胺、前列腺素等炎癥物質。其炎癥物質通過增加血管壁的滲透性來將炎癥細胞從血管移動至皮膚組織。即，由于紫外線皮膚發生炎癥反應，從而出現紅斑、熱疳、疼痛、浮腫等癥狀。因此，若抑制炎癥細胞在血管中向皮膚組織浸潤，則抑制炎癥反應，從而可以預防或治療曬傷。

根據本發明的任一實施例，在對小鼠照射紫外線后口服給藥葉綠素a或脫鎂葉綠酸a的情況下，在真皮減少了炎癥細胞的浸潤。

根據本發明的任一實施例，向人體皮膚纖維芽細胞中照射紫外線后用脫鎂葉綠酸a處理的情況下，減少了基質金屬蛋白酶-1及基質金屬蛋白酶-3的生產。

基質金屬蛋白酶為鉛-依賴性的肽鏈內切酶。它們可以分解所有種類的細胞外基質，且在細胞的增殖、分化、移動、血管的生成及細胞自殺中起重要的作用。尤其，紫外線增加皮膚中基質金屬蛋白酶的生產來分解膠原，從而引起皮膚老化反應，如形成皺紋等。即，若在暴露于紫外線的皮膚中抑制基質金屬蛋白酶生產，則可以預防或治療紫外線引起的皮膚損傷。

可知的是，基質金屬蛋白酶-1不僅參與在正常的生理反應分解細胞外基質，而且在疾病的進行過程中也分解細胞外基質，尤其，起分解第一、第二及第三型膠原的作用。

基質金屬蛋白酶-3起分解Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅸ及Ⅹ類型膠原、蛋白聚糖(proteoglycans)、纖維連接蛋白(fibronectin)、層粘連蛋白(laminin)及彈性蛋白(elastin)的功能，并且，還活化其他基質金屬蛋白酶，如基質金屬蛋白酶-1、基質金屬蛋白酶-7及基質金屬蛋白酶-9等。因此，基質金屬蛋白酶-3被認為在重組皮膚組織中最為主要的因子。

本發明的組合物可以以口服的皮膚改善用化妝品組合物來所提供。本發明的化妝品組合物包含上述葉綠素a或脫鎂葉綠酸a作為有效成分以外，還包含食品組合物或在口服用醫藥上通常使用的成分，還可以包含通常的輔助劑，例如，抗氧化劑、安定化劑、增溶劑、維生素、顏料及香料等，并且包含載體。

本發明的口服用化妝品組合物所包含的載體為當制劑時通常所使用的，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油等，但是不局限于此。本發明的口服用化妝品組合物包含上述成分以外，還包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、保鮮劑等。

并且，本發明的組合物可以以藥學組合物來所提供。

根據本發明的優選實施例，本發明的組合物為(a)本發明的葉綠素a或脫鎂葉綠酸a的藥學有效量；以及(b)包含藥學上可接受的載體的藥學組合物。本說明書中的用語“藥學有效量”意味著達成葉綠素a或脫鎂葉綠酸a的效能或活性的充足的量。

本發明的組合物在以藥學組合物制成的情況下，本發明的組合物包含藥學上課接受的載體。被包含在本發明的藥學組合物的藥學上可接受的載體為當制劑時通常所利用的，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油等，但是不局限于此。除了上述成分之外，本發明的藥學組合物還可以包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、保鮮劑等。在Remington's Pharmaceut ical Sciences(19th ed.，1995)中詳細記載了合適的藥學上可接受的載體及制劑。

本發明的藥學組合物可以口服給藥。

本發明的藥學組合物的合適的給藥量為根據如制劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、病態、飲食、給藥時間、給藥路徑、排泄速度及反應靈敏性等因素來可以給予多種處方。

本發明的藥學組合物在該發明所屬技術領域內，隨著普通技術人員可以容易地實施的方法，通過利用藥學上可接受的載體及/或成型添加劑來制劑，從而以單位用量形態來進行制備或放入大用量容器內來可以進行制備。此時，劑型可以是油或水性媒介中的溶液、懸浮液、糖漿劑或油滑液形態或也可以是濃縮劑、散劑、粉末劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑形態，還可以包含分散劑或安定化劑。

并且，本發明的組合物可以以食品組合物來進行提供。

根據本發明的優選實施例，本發明的組合物為(a)本發明的葉綠素a或脫鎂葉綠酸a的食品學有效量；以及(b)包含食品學上可接受的載體的食品學組合物。

本發明的組合物在以食品組合物來制成的情況下，作為有效成分，不僅包含葉綠素a或脫鎂葉綠酸a，而且還包含當制作食品時通常所添加的成分，例如：蛋白質、碳水化合物、脂肪、營養素、調味劑及香味劑。上述碳水化合物的例有單糖類，例如葡萄糖、果糖等；二糖類，例如麥芽糖、蔗糖、低聚糖等；以及多糖類，例如一般的糖，如糊精、環糊精等，以及糖醇，如木糖醇、山梨醇、赤藻糖醇等。作為香味劑可以使用天然香味劑[索馬甜，甜菊提取物(例如甜葉菊甙A、甘草素等)]及合成香味劑(糖精、阿斯巴甜等)。例如，本發明的食品組合物在以口服液來制成的情況下，可以將包含本發明的土茯苓提取物之外，還可以包含檸檬酸、液態果糖、砂糖、葡萄糖、醋酸、蘋果酸、果汁、杜仲提取物、大棗提取物、甘草提取物等。

發明的效果

概括本發明的特征及益處為如下：

(a)本發明提供皮膚狀態改善用組合物，包含葉綠素a或脫鎂葉綠酸a作為有效成分。

(b)根據本發明，葉綠素a或脫鎂葉綠酸a具有改善紫外線引起的皮膚皺紋的效果。

(c)根據本發明，葉綠素a或脫鎂葉綠酸a具有緩解紫外線引起的炎癥反應的效果。

(d)本發明的組合物以口服給藥為特征，可以以化妝品組合物、藥學組合物及食品組合物來進行提供。

附圖說明

圖1a為在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的小鼠背部皮膚中，示出皺紋減少的圖片。

圖1b為在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的小鼠群體中，示出視覺上的皺紋等級比僅照射紫外線的群體顯著減少的圖表。

圖1c為在小鼠中因陰性復制物而出現的皺紋。

圖1d為將背部的皺紋區域利用影子區域來所計算的圖表。

圖2a為在給藥脫鎂葉綠酸a的小鼠的真皮中，示出炎癥細胞浸潤與僅照射紫外線的小鼠相比減少的圖片。

圖2b為在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的小鼠中，示出表皮厚度顯著減少且真皮中的膠原束變得更厚的圖片。

圖2c為在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的小鼠中，示出表皮厚度與僅照射紫外線的小鼠相比減少的圖表。

圖3a為在給藥脫鎂葉綠酸a的小鼠真皮中，示出炎癥細胞浸潤與僅照射紫外線的小鼠相比減少的圖片。

圖3b為示出在照射紫外線的小鼠的真皮上部和表皮中的細胞內粘附分子-1的表達與僅給藥賦形劑(vehicle)的小鼠相比相當高的圖片。在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的小鼠中細胞內粘附分子-1的表達與僅照射紫外線的小鼠相比減少了。

圖3c為示出在表皮中，將炎癥細胞的浸潤用顯微鏡觀察計算結果，給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的小鼠中的炎癥細胞的浸潤與照射紫外線光的小鼠相比減少的圖表。

圖4a為在人皮膚成纖維細胞(hDF)照射紫外線且用各種濃度的脫鎂葉綠酸a處理后，分析細胞存活率的圖表。

圖4b為在人皮膚成纖維細胞照射紫外線且用各種濃度的脫鎂葉綠酸a處理后，用蛋白質印跡法分析基質金屬蛋白酶-1、基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-3的表達水平變化的圖片。

圖4c為在人皮膚成纖維細胞照射紫外線且用各種濃度的脫鎂葉綠酸a處理后，用實時逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT PCR)法分析基質金屬蛋白酶-1的mRNA表達水平的圖表。

圖4d為在人皮膚成纖維細胞照射紫外線且用各種濃度的脫鎂葉綠酸a處理后，用實時逆轉錄聚合酶鏈式反應法分析基質金屬蛋白酶-2的mRNA表達水平的圖表。

圖4e為在人皮膚成纖維細胞照射紫外線且用各種濃度的脫鎂葉綠酸a處理后，用實時逆轉錄聚合酶鏈式反應法分析基質金屬蛋白酶-3的mRNA表達水平的圖表。

圖5a為在人皮膚成纖維細胞照射紫外線且用各種濃度的脫鎂葉綠酸a處理后，用蛋白質印跡法分析磷酸化c-Jun氨基末端激酶(pJNK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化細胞外信號調節激酶l/2(pERKl/2)及細胞外信號調節激酶l/2(ERK1/2)的蛋白質的表達水平變化的圖片。

圖5b為示出在人皮膚成纖維細胞中處理脫鎂葉綠酸a且用共聚焦顯微鏡(confocal)觀察2小時的脫鎂葉綠酸a與濃度成比列地位于細胞質的圖片。

具體實施方式

以下，通過實施例本來對本發明進行更詳細的說明。這些實施例僅是用于更具體地說明本發明的，對本發明所屬領域內的普通技術人員而言，本發明的保護范圍不隨本發明的主旨而局限于這些實施例是不言自明的。

實施例

實驗材料及實驗方法

細胞培養

人皮膚成纖維細胞(primary human dermal fibroblast，hDF)細胞株由全南大學醫科大學金誠貞教授提供。細胞培養為在37℃，5％的CO₂條件使用添加5％胎牛血清(fetal bovine serum，Gibco Laboratories，Grand Island，NY，USA)及1％青霉素(penici 11in，100units/ml)/鏈霉素(streptomycin，100mg/ml)的達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM，Gibco Laboratories，Grand Island，NY，USA))培養。

紫外線照射方法

使用了紫外光源具有280nm及380nm發光范圍的飛利浦TL20W/12盧比的熒光日光燈(Philips TL 20W/12RS fluorescent sun lamp)。采用紫外線測定儀(GUVx-TlxGS5-LA2，Genicom Daejeon，Korea)測定了皮膚表面的紫外線強度。與紫外光源相距30cm處的紫外線照射強度為1.0mW/cm²。在培養皿將細胞培養至75～80％，然后用磷酸鹽緩沖液清洗兩次后，照射紫外線并處理了實驗物質。此后，在遮光的狀態下，直到進行下一個分析為止繼續培養。

為了對動物照射紫外線，首先對小鼠背部皮膚照射了最小紅斑劑量(minimal erythema dose，MED)。最小紅斑劑量意味著，在照射24小時后可以誘導具有顯著界限的紅斑(erythema)的最小量。將紫外線以每周3次對小鼠照射了8周。前3周，每次將照射量增加1MED(本發明中1MED＝30mJ/cm2)，此后維持3MED。

細胞存活率分析(Cell viability assay)

為了分析細胞活性采用了水溶性四氮唑試驗(water soluble tetrazolium test)方法。利用EZ Cytox細胞活力檢測試劑盒(Ez-cytox Cell Viability Assay Kit(Daei 1Lab Co，Seoul，Korea))分析了活細胞的定量。通過利用變色龍多標簽讀板(Chameleon multi-label plate reader(Hidex Personal Life Science，Hidex Oy，Finland))在450nm下測定吸光度，來用光譜測定法分析了甲月替染料(formazan dye)。

實時逆轉錄聚合酶鏈式反應(Real-time RT-PCR)

根據制備者的指示使用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，分離了所有RNA。利用ImProm IITM反轉錄系統(ImProm-IITM Reverse Transcription system(Pr omega，Madison，WI，USA))來用2.5μg的所有RNA合成了cDNA。為了分析各基因的表達水平，利用熒光定量DNA擴增儀(DNA Engine Opticonl(MJResearch，Waltham，MA，USA))來用上述合成的cDNA進行了PCR擴增。為了在PCR擴增過程中探測熒光，利用了SYBR Premix Ex Taq(Takara Bio，Otsu，Japan)，通過將全部分量為10μl，其中1μl的cDNA/control及個基因包含特異性引物來進行了PCR擴增。所使用的引物如下：

基質金屬蛋白酶-1

正方向CTG AAG GTG ATG AAG CAG CC

逆方向AGT CCA AGA GAA TGG CCG AG

基質金屬蛋白酶-2

正方向GAT ACC CCT TTG ACG GTA AGG A

逆方向CCT TCT CCC AAG GTC CAT AGC

基質金屬蛋白酶-3

正方向ATT CCA TGG AGC CAG GCT TTC

逆方向CAT TTG GGT CAA ACT CCA ACT GTG

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)

正方向CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT

逆方向AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC

PCR擴增反應進行條件如下：

(1)在95℃下，變性(denaturation)10分鐘

(2)循環40回：變性(95℃下，一秒)，退火(60℃下，5秒)伸展(72℃下，25秒)。

蛋白質印跡法分析

從樣品到所有蛋白質提取物準備在溶解試劑50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1mM EGTA，1％NP-40，0.25％sodium deoxycholate，1mM PMSF，and phosphatase inhibitor mixture(Sigma，St Louis，MO，USA)}里后加熱5分鐘。利用Bio-Rad蛋白測定染料試劑濃縮物(Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA))來將溶解的蛋白質定量后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離并移至聚偏氟乙稀(polyvinylidene di fluoride，PVDF)膜(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ，USA)。在4℃下，將膜用特定的一次抗體反應一個晚上后，利用化學發光檢測試劑盒(chemiluminescence detection kit(Amersham Pharmacia Biotech))對與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)相連接的二次抗體和蛋白質帶進行了視覺化。所使用的各個一次抗體如下：基質金屬蛋白酶-1(Chemicon，Bedford，MA，USA)、基質金屬蛋白酶-2(Chemicon，Bedford，MA，USA)、基質金屬蛋白酶-3(Epitomics，Burl ingame，CA，USA)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phospho c-Jun N-terminal kinase，pJNK)、c-Jun氨基末端激酶、磷酸化細胞外信號調節激酶(phospho extracellular signal-regulated kinase，pErk)及細胞外信號調節激酶(所有Cell Signaling Technology，Beverly，MA，USA)。

共聚焦顯微鏡(Confocal microscopy)

在蓋玻片(coverslip)上，以5×10⁴/well培養人皮膚細胞后，將脫鎂葉綠酸a在37℃下不部暴露于光的狀態下處理了2小時。而且，在磷酸緩沖鹽溶液中用4％的多聚甲醛固定了細胞。在440nm的激發波長(excitation wavelength)及655nm的發射波長(emission wavelength)下，利用FV1000共聚焦顯微鏡(FV1000confocal microscope(Olympus，Tokyo，Japan))對脫鎂葉綠酸a的熒光進行了視覺化。熒光強度決定了細胞內是否吸收脫鎂葉綠酸a。

實驗動物

使從查爾斯河實驗室(Charles River Laboratories(Wilmington，MA))購買的6周齡雌性SKH-1無毛小鼠適應一周。有空調的房間以12小時有光/12小時無光的周期，在可以自由地吃的條件下，飼養小鼠。房間溫度維持在23士3℃，濕度維持在55士15％。所有實驗由光州科學技術學院動物實驗倫理委員會(animal care and use committee)承認。

試驗物質的口服給藥

適應期滿后，將小鼠以每個群體6只分成了4個群體。各群體如下：

(a)陰性對照組

(b)僅照射紫外線的陽性對照組

(c)照射紫外線的同時每天給藥5mg/kg葉綠素a的群體

(d)照射紫外線的同時每天給藥5mg/kg脫鎂葉綠酸a的群體

將葉綠素a(Ca，Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)或脫鎂葉綠酸a(Pa，Frontier Scientific，Logan，UT，USA)分別溶解于40％的400溶液的聚乙二醇(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)中使用。作為控制的賦形劑(vehicle)，僅用40％的400溶液的聚乙二醇制備后給藥陰性對照組及陽性對照組群體的小鼠。在照射紫外線后立即進行了試驗物質的給藥。

背部皮膚的皺紋評價

繼續暴露于低用量的紫外線后，為了獲得背部皮膚的臨床的圖像(clinical)，使用了數碼相機(Sony Cyber shot DSC-W570，5Xoptical zoom，16.1megapixels，Sony Corporation，Tokyo，Japan)。放大的皺紋可以使用數碼相機上的 IIHybridM(3Gen，LLC，San Juan Capistrano，CA，USA)來獲得。根據Bissett等[20]記述的方法對小鼠背部的皺紋定了等級。由此定的等級如下：

等級0-無任何粗皺紋的情況；

等級1-由少數的淺的粗皺紋的情況；

等級2-由一些粗皺紋的情況；

等級3-由多個粗皺紋的情況。

為了分析皮膚的皺紋，使用了以陰性雕刻的復制物，此方法由柳等[21]所記述的方法。即，將半流動體的硅聚合物與催化劑(Imprint II GarantTM Light Body，3M)相混合后，在背部皮膚上適用了，使足以滲透至越過輪廓線滲入到皺紋內。形成了復制物，在具有設定的入射角(incident angle)的標準燈光下，對此復制物進行了分析，使得生成與皺紋的高度成比例的反射影子。采用圖像分析軟件(ImageJ software，NIH Image，National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA；online at:http://rsb.info.nih.gov/ij/)從圖像影子區域測定了所截的圖像。

組織學檢查

將從照射紫外線的小鼠背部辟出取出的組織樣品固定在4％的多聚甲醛后，被包含于石蠟中。對厚度為4μm的薄的切片用蘇木精(hematoxylin)及曙紅(eosin)溶液進行了染色。為了視覺化膠原的沉積，用Accustain tr ichrorae stain(Sigma-Aldr ich，St.Louis，Missouri，USA)對切片進行了染色。采用i-Solution DT image acquisition and analysis program(IMT i-solution，Vancouver，Canada)及Leica microscope(Leica，Wetzlar，Germany)測定了從顆粒型角膜層的接合部位到真皮-表皮的接合部位的表皮厚度。為了評價表皮的厚度，在載玻片下測定了任意的十個部位。在高性能場計算了從表皮到皮下脂肪層的炎癥細胞。

棉衣組織化學法(Immunohistochemistry)

使用厚度為5μm的石蠟切片，進行了對基質金屬蛋白酶-1(Chemicon International，Temecula，CA，USA)、細胞內粘附分子-1(Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA，USA)及Type 1Collagen(Santa Cruz Biotechnology，Sant Cruz載玻片，CA，USA)的免疫組織化學染色。使用二甲苯(xylene)及酒精從載玻切片去除石蠟并進行了水化。為了去除切片上的內生的(endogenous)過氧化物酶(peroxidase)，在3％的H2O2中培養后，為了阻斷非特異性的抗體結合部位，用3％的牛血清進行了培養。為了檢出基質金屬蛋白酶-1、type 1collagen及細胞內粘附分子-1，分別準備了小鼠抗-人類基質金屬蛋白酶-1單克隆抗體(1:100)、山羊抗-人類type 1collagen多克隆抗體(1:100)及小鼠抗-人類細胞內粘附分子-1單克隆抗體(1:100)。隨后，為了視覺化各抗體的特定靶，通過采用DAKO LSAB+system-HRPkit(DAKO Corporation，Carpinter ia，CA，USA)來適用了avidin-biot in-peroxidase complex方法。使用蘇木精作為對照染色。

統計分析

各個的離體(in vitro)實驗進行了3次，所有數據以平均±標準誤差來表示。群體之間的顯著差異用T檢驗(Student T test)及方差分析(ANOVA)進行了分析。p-value<0.05為在統計學上是顯著的。

實驗結果

在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的群體中，皺紋的臨床分數(clinical score)得到了改善。

連續8周對反復照射紫外線的無毛小鼠皮膚皺紋作出了評價。在小鼠的背部用數碼相機拍攝了皺紋及陰性的復制圖像(negative replica image)的皮膚特性，且用圖像分析軟件進行了分析(圖1)。在將小鼠背部皮膚長時間反復暴露于紫外線的情況下，回誘導作為光輻射皮膚老化的典型特征的皺紋和皮膚變粗的現象。在照射紫外線后立即給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的情況下，與對照組相比皺紋的厚度明顯被減少了，且顯示出微細的皺紋。并且，兩名熟練的專家確認了對于臨床圖片的視覺化的皺紋等級，結果示出給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的群體中的皺紋等級下降了。在復制圖像中，給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的群體與對照組相比皺紋區域也減少了。

給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的小鼠的背部皮膚組織病理學得到了改善。

為了調查脫鎂葉綠酸a或葉綠素a對由照射紫外線被誘導的炎癥反應的影響，將照射紫外線的小鼠背部皮膚切片化后，用H&E進行了染色(圖2)。在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的情況下，確認到了，與對照組相比表皮和真皮上部的炎癥細胞和浸潤減少了。

表皮變厚意味著有過因照射紫外線而被誘導的炎癥反應，將表皮的厚度用馬森三色(Masson-trichrome)染色法作出了評價。在照射紫外線的情況下，與僅用賦形劑(vehicle)處理的群體相比表皮厚度增加了。在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的群體中厚度減少表示的是炎癥程度下降了。并且，觀察到了，給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的群體與對照組的群體相比真皮中的膠原破壞更少。即，在僅照射紫外線的群體中觀察到了表皮中的微細的膠原束，且隨著真皮-表皮結合部位和上部真皮觀察到退化的變透明的(hyalinized)物質被沉積而擴散。與此相反，在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的群體中觀察到，與對照組相比在真皮中厚的膠原束和上部真皮中退化的物質減少了。

給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的群體與僅照射紫外線的對照組相比細胞內粘附分子-1表達降低了。

細胞內粘附分子-1為媒介白細胞的相互作用并干涉收集炎癥細胞的細胞表面的粘附分子(surface adhesion molecule)。紫外線的照射會在角質細胞中誘導細胞內粘附分子-1，眾所周知細胞內粘附分子-1在發生炎癥細胞浸潤的炎癥部位的細胞膜，以高的水平來表達[22]。對細胞內粘附分子-1進行免疫組織化學染色的結果，確認了紫外線處理的群體與僅處理賦形劑(vehicle)的群體相比在表皮和真皮上部細胞內粘附分子-1的表達程度增加了(圖3)。這可能是因為在真皮上部發生了炎癥細胞的浸潤。給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的群體與僅照射紫外線的群體相比在表皮和真皮上部細胞內粘附分子-1的表達程度減少了。

若在人皮膚成纖維細胞(hDF)中照射紫外線后處理脫鎂葉綠酸a，則基質金屬蛋白酶(基質金屬蛋白酶)生產會減少。

為了評價脫鎂葉綠酸a對基質金屬蛋白酶生產的影響，將人皮膚成纖維細胞培養至培養皿的80％后，照射紫外線(20mJ/cm2)并用各種濃度的(0、10、20、50μM)的脫鎂葉綠酸a進行了處理。而且，在遮光的狀態下將細胞培養72小時后，進行了細胞毒性評價。細胞的生存能力不受紫外線的照射及試驗物質的處理的影響(圖4a)。

并且，照射紫外線且處理試驗物質后培養24小時，然后利用實時逆轉錄聚合酶鏈式反應方法分析了基質金屬蛋白酶的mRNA水平。將甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因作為內部的控制來適用，將對于甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基質金屬蛋白酶-1的相對量用條(bar)來表示(圖4c至圖4e)。在僅照射紫外線的情況下，基質金屬蛋白酶-1/甘油醛-3-磷酸脫氫酶mRNA的水平增加了14倍。在處理脫鎂葉綠酸a的情況下，基質金屬蛋白酶-1及基質金屬蛋白酶-3水平顯著的減少了。基質金屬蛋白酶-2mRNA水平基本上不受紫外線照射的影響。

為了確認基質金屬蛋白酶蛋白質的表達水平，進行了蛋白質印跡法。分別對基質金屬蛋白酶-l、基質金屬蛋白酶-2及基質金屬蛋白酶-3用一次抗體分析的結果，基質金屬蛋白酶-1及3的量以與處理脫鎂葉綠酸a的量成比例的方式減少了(圖4b)。總之，呈現出蛋白質水平與mRNA表達水平相一致。

在人皮膚成纖維細胞(WF)中，脫鎂葉綠酸a抑制由紫外線照射所誘導的胞外信號調節激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)磷酸化。

眾說周知的是，基質金屬蛋白酶與由紫外線照射所誘導的基質金屬蛋白酶生產有關。要確認脫鎂葉綠酸a對由紫外線照射引起的MAPK的磷酸化有何影響。為此，對照射紫外線的人皮膚成纖維細胞進行脫鎂葉綠酸a處理，在遮光的狀態下培養2小時后，將溶解細胞來進行了蛋白質印跡法(圖5a)。為了確認被磷酸化c-Jun氨基末端激酶、c-Jun氨基末端激酶、被磷酸化的磷酸化細胞外信號調節激酶及細胞外信號調節激酶蛋白質的表達水平，適用了對各個把蛋白質的一次抗體。蛋白質印跡法分析結果，在處理20μΜ及50μΜ的脫鎂葉綠酸a細胞中，觀察到磷酸化的c-Jun氨基末端激酶及磷酸化的細胞外信號調節激酶的表達水平減少了。并且，基本的c-Jun氨基末端激酶蛋白質水平與脫鎂葉綠酸a量成比例的減少了。

在人皮膚成纖維細胞中，利用共聚焦顯微鏡來對在2個小時內脫鎂葉綠酸a被吸收的圖像進行了視覺化(圖5b)。在用蛋白質印跡法分析MAPK的結果中，在照射紫外線后處理10μΜ的脫鎂葉綠酸a2小時的情況下，MAPK磷酸化抑制效果低于在20μΜ及50μΜ中顯示的效果，這可能是因為與20μΜ及50μΜ相比在10μΜ的脫鎂葉綠酸a中細胞吸收不夠好。

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