本發明涉及丙二烯氧化物合酶在輔助生殖技術的通用領域的用途。特別是，本發明涉及改善精液(和精子)的穩定性，該精液(和精子)用于輔助受精過程(包括人工授精、體外受精、精子分離)且用于體外操作卵母細胞以改善其生存力和可育性。本發明涉及源自人、牛、馬、豬、家禽和其它動物的配子。

背景技術：

丙二烯氧化物合酶(AOS)為細胞色素p450酶家族成員(CYP74A；EC 4.2.1.92)，其首先分離自銀膠菊橡膠植物灰白銀膠菊(Parthenium argentatum)(GenBank CAA55025.2)。AOS也已知為銀膠菊橡膠顆粒蛋白(RPP)，其已從銀膠菊橡膠植物純化并克隆(US 5,633,433和US 6,132,711)。

AOS為在生物系統中對脂質過氧化物具有特異性的抗氧化酶。如US 6,132,711所報告，AOS快速將游離或酯化的脂肪酸過氧化物或氫過氧化物轉化為其對應的環氧化物，然后環氧化物又轉化為酮醇。該酶的脂質過氧化物和氫過氧化物底物據稱對生物有機體有毒且可通過鏈增長反應產生另外的過氧化物，以及引起蛋白質和DNA的氧化損傷。在AOS的存在下，這些化合物被快速轉化為環氧化物且鏈反應被破壞。

相比脂質過氧化物，AOS作用產生的酮醇物質為相對生物惰性的，因此US 6,132,711推測AOS的抗氧化作用可在多種應用中有用。這些應用包括保存植物種子、治療嚴重失血的創傷患者、在一些疾病的治療中促進細胞凋亡，包括在煙草植物中對除草劑的抗性、增加用于人工授精或體外受精的精子的壽命，和增加生物有機體的平均和最大壽命。然而，在US 6,132,711中這些用途完全是推測的，沒有實驗支持。

許多藥物，無論是單一化合物還是多組分物質，無論是來源于天然生物源還是合成制備，都已知顯示抗氧化劑行為。一些為廣譜抗氧化劑，即它們在一系列生物體系中都顯示抗氧化作用，而其它的為選擇性的且在特定的一組生物參數中具有抗氧化作用。

此外，抗氧化劑可分類為‘自殺’種類(意思是一個抗氧化劑分子在中和一個活性氧化性物質分子時被消耗)或可分類為酶類，其中酶的單一分子可中和許多氧化性分子。

AOS已顯示在治療嚴重缺血性損傷和局部缺血-再灌注損傷中具有益處(US 7,157,082)。缺血性損傷通過創傷事件(如中風或心臟病發作)引起，其導致血液供給缺乏，引起組織的氧短缺。局部缺血–再灌注是指當在局部缺血或缺氧一段時間后血液供給返回至組織引起的組織損傷。

精液(以及精子和卵子)的穩定性廣泛被認為是在動物人工授精和輔助生殖技術階段非常顯著的約束條件。精液不穩定性增加了成本、低效性和邏輯復雜性。對新鮮精液和冷凍精液都是這種情況，且除了牛繁殖情況之外還包括多種物種。冷凍精子在冷凍和解凍步驟中都具有失去生存力的問題，且新鮮精液受到其非常有限的保存期限(～3天)極大的約束。工業上已通過一系列手段處理穩定性問題以改善效率。例如，在稀釋組合物和加工中進行了漸進式的改進以改善存活率。盡管這樣，仍然廣泛認為精液穩定性是主要的問題且存在持續的需求以尋找改善精液性能的方式。此外，更先進的精液處理技術，如涉及基于精子為X或Y(雌性或雄性)的精子分選的技術，由于所使用的方法而對精子生存力提供了另外的挑戰。這些本質上通常為氧化性的，其是由于在加工過程中對細胞造成的熱、壓力、光、化學或生物化學損害所產生。

本申請人目前發現AOS對新鮮和冷凍精液都為有效的穩定性增強劑。因此，本發明一個目的是提供新的方式以延長用于人和其它動物的輔助生殖過程的精液的功能壽命，或至少提供對現有方法的有效替代方式。

技術實現要素：

在一方面本發明提供丙二烯氧化物合酶作為精液的保存劑的用途。該丙二烯氧化物合酶可為源自銀膠菊橡膠植物灰白銀膠菊的丙二烯氧化物合酶，或可由銀膠菊橡膠植物灰白銀膠菊的丙二烯氧化物合酶克隆。該丙二烯氧化物合酶優選具有SEQ ID No.1的氨基酸序列或為其功能等價的變體。

丙二烯氧化物合酶可為適于使用的任何形式，例如適于在pH-緩沖的水性介質中使用的形式。該丙二烯氧化物合酶可以任何合適的濃度(例如1至10μg/ml)存在于介質中。

在本發明一些實施方案中，所述精液為牛精液。在本發明的一些其它實施方案，該精液為人精液。在其它實施方案中，該精液可源自馬、羊、豬或家禽。

在第二方面本發明提供延長精液的壽命的方法，其通過將精液與丙二烯氧化物合酶接觸。通常，所述精液在丙二烯氧化物合酶的存在下儲存。

在本發明一些實施方案中，所述丙二烯氧化物合酶被添加至精液且將精液冷凍，儲存一段時間，然后在使用前解凍。在其它實施方案中，所述精液為新鮮的精液。

優選延長精液的壽命使得精液中至少50％的精子在射精4天后有活力。

在另一方面本發明提供包含丙二烯氧化物合酶的精液。該精液可為冷凍的或新鮮的。

在另一方面本發明提供包含丙二烯氧化物合酶的精液在人工授精過程、體外受精過程或精子分選過程中的用途。該人工授精過程包括人工授精人類女性、母牛、馬、豬、羊或家禽的步驟。

在另一方面本發明提供用于保存精液的組合物，其包含有效量的丙二烯氧化物合酶。

附圖簡述

圖1顯示使用標準‘新鮮’方法儲存4天的稀釋的公牛精液中精子的平均相對存活率。

圖2顯示AOS對冷凍公牛精液的精子活力的作用。

圖3顯示AOS對精子活力表現的作用。

圖4為SEQ ID No.1的氨基酸序列。

發明詳述

本發明總體上涉及AOS作為精液的保存劑的用途。本發明還涉及包含AOS作為保存劑的精液；涉及包含AOS的精液在人工授精過程、體外受精過程或精子分選過程中的用途；和涉及包含AOS的用于保存精液的組合物。

應理解本說明書中當提及精液保存時，是指將其功能壽命延長至超過未處理或未加工的精液的功能壽命，且包括保存在該精液中的精子。

本說明書使用的術語“丙二烯氧化物合酶”或“AOS”是指將脂氧合酶-衍生的脂肪酸氫過氧化物轉化為丙二烯環氧化物(其為植物中的生長調節劑茉莉酸的前體)的任何酶，且包括例如從橡膠植物灰白銀膠菊分離的丙二烯氧化物合酶。該術語還包括AOS的任何功能等價的肽或蛋白質，且包括從任何來源或通過任何方法得到的AOS，例如通過化學合成和/或基因表達或克隆技術。該說明書中當提及AOS時都被認為包括提及其功能等價的變體，除非另有所述。

本說明書使用的術語“功能等價的變體”包括那些具有一個或多個(例如1至50個、1至30個、1至20個、1至10個或1至5個)缺失、添加和/或取代的同時基本上保持AOS所需功能的肽或蛋白質，或涉及通過對選擇的氨基酸或總體氨基酸結構的化學修飾而衍生出的變體。氨基酸取代通常為保守氨基酸取代。應理解功能等價的變體可具有比原蛋白質(所述變體為該蛋白質的變體)更高或更低的活性水平。在本發明的多種實施方案中，功能等價的變體具有該蛋白質(所述變體為該蛋白質的變體)的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％的活性水平。功能等價的變體將具有抗氧化活性。例如，它們可具有在脂質/細胞膜界面將脂質過氧化物/氫過氧化物轉化為脂質環氧化物的能力。

在本發明一些實施方案中，該AOS為Genbank CAA55025.2中所述的AOS或該蛋白質的功能等價的變體。

本領域技術人員基于本說明書的信息并使用已知技術能夠容易評價其功能并確定蛋白質活性水平。作為實例，抗氧化活性可使用Pinchuk等人，Chemistry and Physics of Lipids，164(2001)，42-48所述的方法，或使用通過Sigma-Aldrich可獲得的可商購測試試劑盒而確定。

本說明書使用的術語“保守氨基酸取代”是指具有相似生物化學性質的氨基酸取代。應理解合適的保守氨基酸取代是基于不同氨基酸之間的相對相似性，包括氨基酸側鏈取代基的相似性(例如其尺寸、電荷、親水性，疏水性等)。作為實例，保守取代包括一個脂族氨基酸取代另一脂族氨基酸，具有含羥基或含硫的側鏈的氨基酸被另一具有含羥基或含硫的側鏈的氨基酸取代，芳族氨基酸被另一芳族氨基酸取代，堿性氨基酸被另一堿性氨基酸取代，或酸性氨基酸被另一酸性氨基酸取代。保守氨基酸取代的實例包括:

-甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸中的一種對另一種的取代；

-絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸或蛋氨酸中的一種對另一種的取代；

-苯基丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的一種對另一種的取代；

-組氨酸、賴氨酸或精氨酸中的一種對另一種的取代；

-天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺中的一種對另一種的取代。

本發明的AOS可從天然源分離，或通過化學合成衍生(例如，以下所述的fmoc固相肽合成：Fields G.B.，Lauer-Fields J.L.，Liu R.Q.和Barany G.，(2002)Principles and Practice of Solid-Phase peptide Synthesis；Grant G.，(2002)Evaluation of the Synthetic Product.Synthetic Peptides,A User’s Guide，Grant G.A.，第二版，93-219；220-291，Oxford University Press，New York)或基因表達技術。標準重組DNA和分子克隆技術描述于例如Sambrook和Maniatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Silhavy等人，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1984)；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)。也考慮通過合適的轉基因動物、微生物或植物制備用于本發明的蛋白質或肽。

AOS可連接至一個或多個其它化合物。例如，其可連接至這樣的化合物，其有助于AOS的功能或活性、防止AOS降解、或者改善其半衰期、幫助在制備過程中分離和/或純化AOS(例如泛素、his-tag或生物素)、或幫助細胞膜易位或細胞特異的靶向。這些其它化合物可包括，例如，肽、核酸、脂質和碳水化合物。

所述其它化合物可連接至AOS，或作為構建體的一部分而合成，其使用任何允許AOS保持至少其所需功能的水平的合適的手段。術語“連接”應被廣泛認為包括AOS和化合物之間任何形式的相連、鍵合、融合或締合(例如，共價鍵合、離子鍵合、氫鍵合、芳香堆疊相互作用、酰胺鍵、二硫鍵、螯合)，且不應被認為是指特定強度的連接。該AOS和化合物可以不可逆或可逆的方式連接，使得在給藥后該AOS從化合物釋放。

因為AOS為酶抗氧化劑，其相比傳統化學/非酶抗氧化劑如維生素E，提供了另外的益處，因為每一個AOS分子能催化數以千計的抗氧化反應。相反，大多數化學/非酶抗氧化劑僅具有參與一個反應的能力。因此，AOS在非常低的濃度時就有效。其它必須以更高濃度(通常高幾個數量級)使用的抗氧化劑會具有毒性問題。

而且，幾乎所有抗氧化劑酶，如過氧化氫酶和超氧化物歧化酶，也產生次級促氧化自由基物質，其需要第二種酶來將其去除。認為AOS對抗脂質氫過氧化物起作用且能單獨作用，即在不存在第二種酶的情況下作用。

本申請人已發現AOS為精液(新鮮精液和冷凍精液二者)的有效保存劑。因此AOS在輔助生殖過程中具有潛在應用，包括用于人和用于動物繁殖工業，特別是牛和馬的繁殖。

僅關于新西蘭的牛繁殖和乳品工業，據估計在100只人工授精的母牛中，70只不會被退回(return)且約60只懷孕。盡管多種因素(包括母牛本身不育)可用來解釋剩余的30只動物，但也廣泛認識到精液質量為需要關鍵考慮的因素，其也許是10-15只不懷孕的動物的原因。在財務術語中，可育性增加1％據估計僅對新西蘭的乳品工業就有$4M的價值。因此不育問題的發展尤其與人工授精和相關的精液加工工業(如涉及X/Y分選的那些工業)相關聯。除了改善母牛的懷孕成功率，精液質量的改善也可預期能以其它方式導致成本效益，如減少所需的受精劑量同時增加用于每次射精的吸管(straws)。

關于人的輔助生殖技術，AOS可用作體外受精(IVF)過程中的卵子培養介質的添加劑，且用于在胞漿內精子注射(ICSI)之前直到胚胎培養、分選、儲存和移植(transfer)過程中穩定精子。

盡管動物精液中精子細胞死亡可能存在多種機理，但顯然有兩個主要機理，凋亡和氧化應激，其各自以脂質過氧化作為因果途徑中的中心步驟。在這些機理中，細胞膜(包括線粒體膜)的脂質成分的氧化損傷導致膜完整性的喪失、細胞功能障礙和壞死。重要的是，這些過程的生物化學涉及膜脂質被氧化為脂質過氧化物，然后其級聯反應引起細胞蛋白質、DNA和其它脂質的氧化性損傷。這種細胞死亡的氧化途徑在細胞暴露于苛刻環境挑戰(包括加熱/冷卻、冷凍/解凍，剪切力和曝光)的情況下也是重要的。

氧化性損傷的作用已在產業上被認識到了一段時間，這導致用于精液和IVF稀釋劑的抗氧化添加劑的開發，并取得了一些成功。一個實例為Caprogen^TM，其為包含過氧化氫酶的牛肝的蛋白質提取物。Caprogen^TM的使用是昂貴的，且作為牛內臟提取物，在出口市場面臨著限制。

AOS通常以水性組合物的形式使用，其包含緩沖劑和精液增充劑(extender)。該增充劑通常由稀釋緩沖劑、蛋白質和脂質組分組成。該AOS可以任何合適的濃度存在，例如其范圍為1至10μg/ml。其它范圍包括，但不限于，1至10內的任何整數范圍，包括其下限為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μg/ml且其上限為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μg/ml的任何范圍。

申請人已確定AOS能在4天后在新鮮公牛精液中使精子存活率增加～50％。

實施例1顯示AOS為新鮮公牛精液的有效保存劑。在濃度為3μg/ml時，AOS在4天后使精子存活率增加約50％。對于多種輔助生殖技術方法該數量級的改善是顯著的。應理解新鮮未處理的精液的短‘保存期限’對其應用有顯著的限制，尤其是如果例如其首先要求在使用前進行運輸的話。由于這個原因，在采集4天后精子存活率增加50％對于牛繁殖在經濟上是重要的，因為其顯著增加精液用于實現其使母牛受精的預期用途的機會窗口?？梢灶A期其它動物，包括人的精液的功能壽命的類似的改善。

實施例2證實AOS在保持解凍后精子活力方面具有顯著的積極作用。檢測的參數包括解凍后的存活率和活力，和酶劑量/響應作用。申請人確定在酶濃度為2μg/ml時AOS顯著增加解凍后的存活率(P<0.05)且在解凍后24h提高活力達～120％(P<0.01)。此外，發現更多精子為膜完整的且可用于受精。從該研究總體來說，可以認為AOS可有效改善牛精子對稀釋、冷凍和解凍后過程的耐受性。在牛繁殖的情況下，這意味著每次射精有更多的吸管(straws)可使用，從而增加每次射精對繁殖工業的價值。

排卵為雌性生物(包括奶牛)中非常分散的生物事件，為了發生受精，卵子必須在其短期的功能壽命中遇到有活力的精液。應理解這在以下情況更可能發生，即如果精子在授精后保持其活力更久以增加其推動自身到達與卵子的接觸點的可能性。因此在24h時延長的活力強烈表明可預期AOS處理的精液的總體生存力(可育性)更大。在牛繁殖中，未能受精的動物數量因此更低，這又可預期降低成本并增加AOS處理的精液的價值。

實施例2顯示解凍后精子活力(圖2)和精子活力表現指數隨時間的下降(遷徙效率，圖3)。特別是，2μg/ml的AOS的結果顯示在整個時程中活力趨向顯著。在解凍后24小時，活力超過對照水平的兩倍(+120％)且差異為高度顯著的(P<0.01)。此外，AOS的作用顯示為劑量響應的且最大值發生在酶濃度為2μg/ml時。AOS的積極作用在活力指數分析中更明顯(圖3)，在24小時后將該精子性能的測量值提升2.9倍。

AOS明顯對精子存活率和精子活力的度量具有顯著的積極作用，而這兩者是已知的精子性能和生育力的關鍵指示。此外，發現更多精子是膜完整的且可用于在AOS處理后的受精。在高稀釋度(2μg/ml)時，發現AOS可有效改善牛精子對稀釋、在冷凍的精液方法中的冷凍和解凍后的處理的耐受性以及精液在‘新鮮’過程中的性能。

實施例3顯示對發展為胚胎的卵母細胞總數沒有影響，但對具有可移植質量(transferable quality)的胚胎的數量具有顯著作用，該數量來自變成熟的卵母細胞的數量和裂解的數量。該數據指示AOS對發展為胚胎的卵母細胞沒有有害作用且增加了在IVF過程中發展成熟的胚胎的‘產率’。

如本說明書所用，詞語“包括”、“包含”和類似詞語不應解釋為排他或或窮舉的含義。換句話說，它們應是指“包括，但不限于”。

本發明進一步參考以下實施例描述。應理解要求保護的本發明不應以任何方式被這些實施例所限制。

說明書提及的任何現有技術文獻不應理解為承認該現有技術是廣泛已知或構成本領域公知常識的一部分。

實施例

實施例1-新鮮公牛精液

使用已建立的步驟通過來自5只公牛的射精物而進行該研究。精液在42℃使用人造陰道收集且轉移至實驗室以用于初始質量保證(體積、活力、精子濃度)。樣品然后在37℃使用各實驗增充劑稀釋至每毫升10X 10 ⁶個精子的標準精子濃度。該實驗增充劑包含1.856g/100ml的檸檬酸鈉、1g/100ml的葡萄糖、20ml/100ml的卵黃(包含抗生素防腐劑)，且調節至pH 7.0。然后將實驗添加劑添加至以下1–5所示的該增充劑基質。稀釋的樣品(20ml)然后以0.25℃/分鐘冷卻至5℃且在5℃儲存5天。樣品在第1天和第4天取出且使用標準步驟確定精子存活率百分比和活力指數。

結果示于圖1，其中:

1.對照–僅稀釋劑；

2.過氧化氫酶–稀釋劑加10μg/ml過氧化氫酶；

3.Caprogen^TM–稀釋劑加標準濃度的Caprogen^TM；

4.AOS–稀釋劑加3μg/ml AOS；

5.AOS–稀釋劑加1μg/ml AOS。

圖1顯示在有和沒有測試添加劑的情況下使用標準‘新鮮’方法儲存4天的稀釋的公牛精液中精子的平均相對存活率。4天時存活率的總體對照水平為第0天的～55％。相對于對照組將結果歸一化。因此，相比于對照，3μg/ml AOS的AOS濃度導致存活率提高～50％。這種差異是高度顯著的P<0.01。在AOS濃度為1μg/ml時，該差異達到顯著性為0.05的水平。過氧化氫酶和Caprogen^TM得到的結果并不顯著。

實施例2-冷凍的公牛精液

進行該研究以確定AOS是否可改善牛精子對冷凍-解凍步驟的耐受性。測量解凍后的活力。將5只公牛的精液樣品在介質中稀釋至標準濃度且各自分為2等份。將AOS添加至1等份至終濃度為2μg/ml，且各公牛的第二等份作為對照。該精液被分配至吸管(straws)中以進行冷凍。然后使用標準程序降低吸管溫度且將吸管儲存在液氮中。在室溫解凍后，將吸管使用標準程序充氧。然后將吸管在室溫儲存至多24h，隨后評價存活率、活力和活力指數。

解凍后精子隨時間的活力示于表1和圖2。活力％是指全部顯示運動的精子的百分比。對照處理是無AOS的稀釋劑和增充劑(系列1)。AOS處理是指具有2μg/ml AOS的稀釋劑和增充劑(系列2)。在圖2中，1為冷凍前的活力％，2為解凍后0小時的活力，3為解凍后3小時的活力，4為解凍后6小時的活力，且5為解凍后24小時的活力。

表1:精子活力

活力指數(顯示向前推進的運動精子的相對比例)示于表2和圖3。在圖3中，1為冷凍前的活力指數(MI)，2為解凍后0小時的MI，3為解凍后3小時的MI，4為解凍后6小時的MI，且5為解凍后24小時的MI。

表2:精子活力指數

實施例3-體外胚胎培養

該實驗檢測了3種濃度(0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml)的AOS對體外胚胎生產系統中的胚胎發育和質量的作用。標準體外胚胎生產步驟用于胚胎的成熟、受精和培養。在培養皿中的包含胚胎培養緩沖液或稀釋劑的小液滴介質(20-50μL)用礦物油覆蓋。在添加卵母細胞、受精卵或胚胎至液滴后調節介質中AOS的初始濃度以得到正確的終濃度。培養后，將胚胎在第7天進行形態學評估，且按照IETS(國際胚胎移植學會)手冊記錄胚胎的階段和級別以將胚胎分級。使用Binomial Generalised線性模型分析發育的比例數據。胚胎發育數據總結于表3。

表3:可移植級別IVF胚胎的發育

¹＝μg AOS/ml介質

²p<0.05

在1μg/ml AOS處理組中顯著更高比例的卵母細胞發育為可移植質量的胚胎。0.1μg/ml AOS對發育沒有影響，而更高水平(10μg/ml AOS)具有不利作用。添加1μg/ml AOS至培養基對胚胎質量具有有利作用，導致所產生的可移植胚胎增加7％。

盡管本發明已通過實施例進行了描述，但應理解可在不偏離權利要求所限定的本發明的范圍的情況下進行改變和修飾。而且，當存在特定特征的已知等價物時，如同本說明書具體提及一樣摻入這些等價物。