本發(fā)明屬于組織工程支架材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種天然植物纖維抗粘連創(chuàng)面敷料的制備方法，更具體地涉及一種絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料的制備方法。

背景技術(shù)：

敷料是一種暫時(shí)性覆蓋傷口用的醫(yī)用材料，其最主要的功能是控制傷口的滲出液及保護(hù)傷口，以免受細(xì)菌及塵粒的污染，提供利于傷口愈合的環(huán)境。細(xì)胞粘附性影響敷料的使用效果。細(xì)胞粘附性強(qiáng)的敷料易粘附肉芽組織，在敷料揭除時(shí)帶來(lái)二次損傷，對(duì)遷移的上皮細(xì)胞、增生的成纖維細(xì)胞的損害。

基于天然植物纖維的海綿體生物相容性好且分子鏈上具有多種可反應(yīng)的活性官能團(tuán)，可通過(guò)改性手段進(jìn)行化學(xué)修飾，改善材料的性能和質(zhì)量，是醫(yī)用敷料的理想材料。目前制備敷料常用的方法是化學(xué)交聯(lián)法和紫外光交聯(lián)法。采用交聯(lián)法制備的材料因有毒的化學(xué)試劑或引發(fā)劑的殘留，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生刺激，安全性不能得到保障。此外，交聯(lián)后材料的分子間距離較小，吸水性能較低，影響敷料的保護(hù)和使用效果。

目前，基于絲瓜植物纖維敷料已被應(yīng)用于創(chuàng)面的修復(fù)。文獻(xiàn)1(中國(guó)組織工程研究，2012，16(8)，1505-1508)采用封閉負(fù)壓引流技術(shù)，證明了絲瓜絡(luò)創(chuàng)面敷料能有效引流，避免患者毒素入血保護(hù)肝腎功能，優(yōu)于常規(guī)切開(kāi)減壓敷料包扎組。同時(shí)，肉芽組織顆粒的新鮮度滿意，可為后期植皮提供良好的組織創(chuàng)面，并且具有良好的生物相容性。文獻(xiàn)2(中國(guó)組織工程研究，2012，16(34)，6445-6448)考察了絲瓜絡(luò)創(chuàng)面敷料在四肢脫套傷治療中的臨床效果。結(jié)果表明，采用封閉負(fù)壓引流后，與常規(guī)傳統(tǒng)換藥組比較，絲瓜絡(luò)敷料組能明顯改善創(chuàng)面循環(huán)，降低回植皮膚壞死率，減輕術(shù)后患者局部功能障礙程度。說(shuō)明絲瓜絡(luò)創(chuàng)面敷料能有效引流，減輕創(chuàng)面靜脈負(fù)荷，改善四肢脫套傷術(shù)后癥狀。文獻(xiàn)3(中國(guó)組織工程研究，2014，18(8)，1295-1300)對(duì)比了封閉負(fù)壓引流天然絲瓜絡(luò)和合成材料創(chuàng)面敷料在創(chuàng)面植皮中的臨床效果，結(jié)果顯示采用絲瓜絡(luò)治療組植皮覆蓋率及創(chuàng)面愈合時(shí)間均明顯優(yōu)于合成材料創(chuàng)面敷料，提示采用絲瓜絡(luò)封閉負(fù)壓引流可以有效促進(jìn)引流，改善循環(huán)，抑制細(xì)菌增生及促進(jìn)修復(fù)過(guò)程。

然而，上述方法制得的基于絲瓜絡(luò)的敷料細(xì)胞粘附性存在很大的缺陷，創(chuàng)面肉芽組織易向敷料內(nèi)生長(zhǎng)而引起組織粘連，在敷料揭除時(shí)造成二次創(chuàng)傷。因此，尋找抗粘連的敷料，滿足臨床應(yīng)用需求，具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中絲瓜絡(luò)創(chuàng)面敷料易粘附肉芽組織，揭除時(shí)易帶來(lái)二次損傷的缺陷，本發(fā)明提供了一種絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案為：一種絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料的制備方法，以絲瓜絡(luò)海綿體為基材，采用接枝改性技術(shù)制備而成，具體包括以下步驟：

步驟1，室溫下將絲瓜絡(luò)在避光條件下浸入高碘酸鉀水溶液，攪拌反應(yīng)結(jié)束后清洗，得到醛基化絲瓜絡(luò)；

步驟2，室溫下將醛基化絲瓜絡(luò)浸入羧甲基殼聚糖水溶液，反應(yīng)結(jié)束后，得到接枝羧甲基殼聚糖的絲瓜絡(luò)；

步驟3，室溫及避光條件下在海藻酸鈉溶液中滴加高碘酸鉀水溶液，攪拌反應(yīng)結(jié)束后，透析并凍干，得到醛基化海藻酸鈉；

步驟4，室溫下將接枝羧甲基殼聚糖的絲瓜絡(luò)浸入醛基化海藻酸鈉水溶液中，反應(yīng)結(jié)束后，凍干得到絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料。

優(yōu)選地，步驟1中，高碘酸鉀水溶液的濃度為1.5～3wt％，攪拌反應(yīng)時(shí)間為4～12小時(shí)。

優(yōu)選地，步驟2中，羧甲基殼聚糖水溶液的濃度為0.25～1.5wt％，反應(yīng)時(shí)間為5～15分鐘。

優(yōu)選地，步驟3中，海藻酸鈉溶液的濃度為1wt％，海藻酸鈉與高碘酸鈉的質(zhì)量比為1:0.5～1.5，反應(yīng)時(shí)間為1～4小時(shí)。

優(yōu)選地，步驟4中，醛基化海藻酸鈉水溶液的濃度為0.25～1.5wt％，反應(yīng)時(shí)間為5～15分鐘。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著效果如下：1)接枝改性的絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料親水性強(qiáng)，抗粘連性能好，使用中能避免發(fā)生組織粘連；2)避免使用有毒化學(xué)交聯(lián)劑，保證了敷料的安全性；3)具有反應(yīng)溫度低、接枝速度快、改性處理周期短等優(yōu)點(diǎn)，工藝和設(shè)備簡(jiǎn)單、易行，適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的一種絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料的制備方法的流程示意圖。

圖2為絲瓜絡(luò)敷料改性前(a)與改性后(b)的掃描電鏡圖。

圖3為實(shí)施例1絲瓜絡(luò)敷料的吸水率測(cè)試結(jié)果圖。

圖4為實(shí)施例1絲瓜絡(luò)敷料的蛋白粘附性測(cè)試結(jié)果圖。

圖5為實(shí)施例1絲瓜絡(luò)敷料的細(xì)胞粘附性測(cè)試結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的一種絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料的制備方法，是以絲瓜絡(luò)海綿體為基材，通過(guò)席夫堿反應(yīng)接枝改性而成，流程示意圖如圖1所示，首先在絲瓜絡(luò)表面接枝醛基，然后再接枝羧甲基殼聚糖，最后接枝醛基化海藻酸鈉，具體包括以下步驟：

步驟1，室溫下將絲瓜絡(luò)在避光條件下浸入濃度為1.5～3wt％高碘酸鉀水溶液，攪拌反應(yīng)4～12小時(shí)，然后清洗得到醛基化絲瓜絡(luò)；

步驟2，室溫下將醛基化絲瓜絡(luò)浸入濃度為0.25～1.5wt％的羧甲基殼聚糖水溶液中，反應(yīng)5～15分鐘，得到接枝羧甲基殼聚糖的絲瓜絡(luò)；

步驟3，室溫下將1.0克海藻酸鈉溶解于100毫升水中，然后加入0.5～1.5克高碘酸鈉，避光條件下攪拌1～4小時(shí)，透析后凍干得到醛基化海藻酸鈉；

步驟4，室溫下將接枝羧甲基殼聚糖的絲瓜絡(luò)浸入濃度為0.25～1.5wt％的醛基化海藻酸鈉水溶液中，反應(yīng)5～15分鐘，凍干得到絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料。

實(shí)施例中使用的原料和試劑如下：絲瓜絡(luò)海綿材料，購(gòu)于南京雙威生物醫(yī)學(xué)科技有限公司；羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、高碘酸鉀、牛血清白蛋白(bsa)、3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(mtt)，購(gòu)于阿拉丁公司；二甲基亞砜、十二烷基磺酸鈉，分析純，上海化學(xué)試劑廠。蛋白測(cè)定試劑盒，購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。dmem培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖溶液(pbs)，美國(guó)giboco公司；小牛血清，上海賽齊生物工程有限公司。

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

(1)室溫下將絲瓜絡(luò)在避光條件下浸入濃度為2wt％高碘酸鉀水溶液，攪拌反應(yīng)8小時(shí)，然后清洗得到醛基化絲瓜絡(luò)；

(2)室溫下將醛基化絲瓜絡(luò)浸入濃度為1.5wt％的羧甲基殼聚糖水溶液中，反應(yīng)15分鐘，得到接枝羧甲基殼聚糖的絲瓜絡(luò)；

(3)室溫下將1.0克海藻酸鈉溶解于100毫升水中，然后加入1克高碘酸鈉，避光條件下攪拌4小時(shí)，透析后凍干得到醛基化海藻酸鈉；

(4)室溫下將接枝羧甲基殼聚糖的絲瓜絡(luò)浸入濃度為1.5wt％的醛基化海藻酸鈉水 溶液中，反應(yīng)15分鐘，凍干得到絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料。

掃描電鏡觀察改性前后的敷料的微結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖2，其中a為絲瓜絡(luò)改性前，b為改性后得到的絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料。從圖2(b)可知，絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料為纖維海綿體多孔結(jié)構(gòu)，平均纖維直徑為200微米左右，多孔結(jié)構(gòu)相互貫穿，有利于透氣及水分的吸收。改性后，支架保持多孔結(jié)構(gòu)，凍干的殼聚糖/海藻酸鈉附著于支架中。

實(shí)施例2

具體操作步驟為：

(1)室溫下將絲瓜絡(luò)在避光條件下浸入濃度為1.5wt％高碘酸鉀水溶液，攪拌反應(yīng)4小時(shí)，然后清洗得到醛基化絲瓜絡(luò)；

(2)室溫下將醛基化絲瓜絡(luò)浸入濃度為0.25wt％的羧甲基殼聚糖水溶液中，反應(yīng)5分鐘，得到接枝羧甲基殼聚糖的絲瓜絡(luò)；

(3)室溫下將1.0克海藻酸鈉溶解于100毫升水中，然后加入0.5克高碘酸鈉，避光條件下攪拌1小時(shí)，透析后凍干得到醛基化海藻酸鈉；

(4)室溫下將接枝羧甲基殼聚糖的絲瓜絡(luò)浸入濃度為0.25wt％的醛基化海藻酸鈉水溶液中，反應(yīng)5分鐘，凍干得到絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料。

實(shí)施例3

具體操作步驟為：

(1)室溫下將絲瓜絡(luò)在避光條件下浸入濃度為2wt％高碘酸鉀水溶液，攪拌反應(yīng)12小時(shí)，然后清洗得到醛基化絲瓜絡(luò)；

(2)室溫下將醛基化絲瓜絡(luò)浸入濃度為0.5wt％的羧甲基殼聚糖水溶液中，反應(yīng)10分鐘，得到接枝羧甲基殼聚糖的絲瓜絡(luò)；

(3)室溫下將1.0克海藻酸鈉溶解于100毫升水中，然后加入1克高碘酸鈉，避光條件下攪拌2小時(shí)，透析后凍干得到醛基化海藻酸鈉；

(4)室溫下將接枝羧甲基殼聚糖的絲瓜絡(luò)浸入濃度為0.5wt％的醛基化海藻酸鈉水溶液中，反應(yīng)10分鐘，凍干得到絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料。

實(shí)施例4

具體操作步驟為：

(1)室溫下將絲瓜絡(luò)在避光條件下浸入濃度為3wt％高碘酸鉀水溶液，攪拌反應(yīng)12小時(shí)，然后清洗得到醛基化絲瓜絡(luò)；

(2)室溫下將醛基化絲瓜絡(luò)浸入濃度為1wt％的羧甲基殼聚糖水溶液中，反應(yīng)15分鐘，得到接枝羧甲基殼聚糖的絲瓜絡(luò)；

(3)室溫下將1.0克海藻酸鈉溶解于100毫升水中，然后加入1.5克高碘酸鈉，避光條件下攪拌3小時(shí)，透析后凍干得到醛基化海藻酸鈉；

(4)室溫下將接枝羧甲基殼聚糖的絲瓜絡(luò)浸入濃度為1wt％的醛基化海藻酸鈉水溶液中，反應(yīng)15分鐘，凍干得到絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料。

實(shí)施例5

具體操作步驟為：

(1)室溫下將絲瓜絡(luò)在避光條件下浸入濃度為1.5wt％高碘酸鉀水溶液，攪拌反應(yīng)4小時(shí)，然后清洗得到醛基化絲瓜絡(luò)；

(2)室溫下將醛基化絲瓜絡(luò)浸入濃度為1.5wt％的羧甲基殼聚糖水溶液中，反應(yīng)15分鐘，得到接枝羧甲基殼聚糖的絲瓜絡(luò)；

(3)室溫下將1.0克海藻酸鈉溶解于100毫升水中，然后加入0.5克高碘酸鈉，避光條件下攪拌4小時(shí)，透析后凍干得到醛基化海藻酸鈉；

(4)室溫下將接枝羧甲基殼聚糖的絲瓜絡(luò)浸入濃度為0.25wt％的醛基化海藻酸鈉水溶液中，反應(yīng)15分鐘，凍干得到絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料。

實(shí)施例6

具體操作步驟為：

(1)室溫下將絲瓜絡(luò)在避光條件下浸入濃度為2.5wt％高碘酸鉀水溶液，攪拌反應(yīng)10小時(shí)，然后清洗得到醛基化絲瓜絡(luò)；

(2)室溫下將醛基化絲瓜絡(luò)浸入濃度為1.25wt％的羧甲基殼聚糖水溶液中，反應(yīng)10分鐘，得到接枝羧甲基殼聚糖的絲瓜絡(luò)；

(3)室溫下將1.0克海藻酸鈉溶解于100毫升水中，然后加入1.25克高碘酸鈉，避光條件下攪拌4小時(shí)，透析后凍干得到醛基化海藻酸鈉；

(4)室溫下將接枝羧甲基殼聚糖的絲瓜絡(luò)浸入濃度為1wt％的醛基化海藻酸鈉水溶液中，反應(yīng)12分鐘，凍干得到絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料。

實(shí)施例7

吸水性檢測(cè)

先將敷料稱(chēng)重(wd)，25℃下在磷酸鹽緩沖溶液中浸泡6小時(shí)以保證充分溶脹。測(cè) 試時(shí)，從溶液中取出敷料，用濾紙吸去敷料表面的水，立刻稱(chēng)重(ww)，每個(gè)樣品平行測(cè)試5次。計(jì)算敷料吸水性能pa的公式為pa＝(ww–wd)/wd。

改性前后敷料的吸水率見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，改性前吸水率為4.6，接枝殼聚糖后其吸水能力增強(qiáng)，達(dá)到8.3；進(jìn)一步結(jié)合海藻酸鈉后，敷料可吸收相當(dāng)于自身重量17.2倍的液體，表明絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料的親水性顯著提高。

實(shí)施例8

蛋白吸附性檢測(cè)

配制0.2wt％的牛血清白蛋白溶液，25℃下將敷料浸于該溶液中，24小時(shí)后取出敷料，用大量蒸餾水沖洗，再將敷料置于0.1wt％的十二烷基磺酸鈉溶液中，37℃下?lián)u床24小時(shí)，以將吸附于敷料的蛋白溶出。蛋白吸附量測(cè)定方法按照蛋白測(cè)定試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程執(zhí)行。

改性前后敷料的蛋白吸附量見(jiàn)圖4。醫(yī)用紗布的蛋白吸附量為25.1，而未改性絲瓜絡(luò)為21.3，分別接枝殼聚糖和海藻酸鈉后，敷料蛋白吸附能力顯著降低，分別為14.2和8.5，均顯著低于醫(yī)用紗布，進(jìn)一步說(shuō)明改性后的絲瓜絡(luò)抗粘連創(chuàng)面敷料親水性提高。

實(shí)施例9

細(xì)胞粘附性檢測(cè)

將敷料剪成圓形，尺寸與24孔培養(yǎng)板(nunc^tm，denmark)孔徑一致，將敷料鋪滿培養(yǎng)板底部。使用前先將敷料用75％乙醇浸泡2小時(shí)消毒，然后用磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)漂洗除去乙醇。在敷料表面接種數(shù)量為4×10⁴的人體成纖維細(xì)胞，并加入2毫升培養(yǎng)液(dmem培養(yǎng)基+10％小牛血清)，將其放于37℃下孵育4小時(shí)后取出，用磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)沖洗以除去未粘附的細(xì)胞，然后加入20微升0.5wt％mtt的磷酸鹽緩沖溶液，置于37℃下孵育4小時(shí)后加入200微升二甲基亞砜，振蕩均勻后采用酶標(biāo)儀(bio-rad，imark)于570納米處測(cè)定紫色物質(zhì)的吸光度。

改性前后敷料的細(xì)胞粘附率見(jiàn)圖5。改性前敷料的細(xì)胞粘附率為0.16，接枝殼聚糖和海藻酸鈉后，分別降低至0.11和0.05，顯著低于組織培養(yǎng)板(0.45)和醫(yī)用紗布(0.20)，這與敷料的蛋白吸附結(jié)果一致，說(shuō)明改性敷料的親水性增強(qiáng)，阻礙細(xì)胞的粘附，從而能有效抗組織粘連。