本發(fā)明涉及一種含肽類生理活性物質(zhì)的微囊制劑及其制造方法。

背景技術(shù)：

關(guān)于激素、細(xì)胞因子、增血因子、生長因子、酶、可溶性或可溶化受體、抗體、肽類抗原、凝血因子或粘附因子等肽類生理活性物質(zhì)，考慮到生物體內(nèi)消化酶作用下的易消化度、親水性及不穩(wěn)定性等，其給藥形態(tài)主要采用利用注射等方式的非口服的給藥方法。在注射給藥的情況下，當(dāng)給藥時伴有疼痛感，所以從改善患者的QOL(Quality of Life，生活質(zhì)量)及提升順從性的觀點出發(fā)，為了擴(kuò)大給藥間隔避免頻繁給藥，希望對上文所述的生理活性物質(zhì)等進(jìn)行緩釋性制劑化處理(非專利文獻(xiàn)1及2)。

作為于技術(shù)上解決所述問題的手段，報告了多種關(guān)于含有具有生理活性作用及/或藥理活性作用的蛋白質(zhì)的微囊型緩釋性制劑的研究，例如，專利文獻(xiàn)1中記載了一種含有非晶形水溶性生理活性物質(zhì)與高分子聚合物的微囊，公開了如下實施例：使非晶形抗血小板藥(S)-4-[(4-脒基苯甲酰基)甘氨酰]-3-甲氧基羰基甲基-2-氧雜哌嗪-1-乙酸分散于預(yù)先溶解有L-精氨酸的乳酸·乙醇酸共聚物的二氯甲烷溶液中，利用Polytron進(jìn)行微粒化之后，在氯化鈉水溶液中形成S/O/W型乳化液。

并且，在專利文獻(xiàn)2中記載了一種抑制由含有生理活性物質(zhì)的基質(zhì)與陽離子性物質(zhì)及/或多元醇類組合而成的生理活性物質(zhì)的初期釋放的緩釋性制劑，且公開了如下內(nèi)容：使生理活性物質(zhì)溶液冷凍干燥后所得的粉體(固相，S相)分散于溶解有可進(jìn)行生物降解的聚合物的有機溶劑液(油相，O相)中，進(jìn)一步將S/O型分散液添加至水性溶劑(水相，W相)從而形成S/O/W型乳化液。

另外，還報告了多種含有具有生理活性作用及/或藥理活性作用的蛋白質(zhì)的微囊型緩釋性制劑等(專利文獻(xiàn)3及4和非專利文獻(xiàn)3及4)。

[現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)]

[專利文獻(xiàn)]

[專利文獻(xiàn)1]日本專利特開平8-151321號公報

[專利文獻(xiàn)2]日本專利特開2002-255857號公報

[專利文獻(xiàn)3]US 6083534號專利公報

[專利文獻(xiàn)4]日本專利特開平8-217691號公報

[非專利文獻(xiàn)]

[非專利文獻(xiàn)1]Drug Discovery Today.7；1184-1189(2002)

[非專利文獻(xiàn)2]J.Control.Rel.87；187-198(2003)

[非專利文獻(xiàn)3]European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,86393-403(2014)

[非專利文獻(xiàn)4]Pharmaceutical Research,14,730-735(1997)

[非專利文獻(xiàn)5]Journal of Pharmaceutical Science,881320-1325(1999)

[非專利文獻(xiàn)6]Journal of the Chinese Medical Association,74(2011),544-551

技術(shù)實現(xiàn)要素：

[發(fā)明所要解決的問題]

所述技術(shù)中，通過使含有PLA或PLGA的油相分散于水相的步驟而形成有油水界面，所以不能否定可能會在蛋白質(zhì)的周邊部與內(nèi)部產(chǎn)生扭轉(zhuǎn)，三級結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)生改性，從而無法發(fā)揮生理活性作用(非專利文獻(xiàn)5)。因此，希望有方法能避免肽類生理活性物質(zhì)改性。并且，可以認(rèn)為使用可進(jìn)行生物降解聚合物的，肽類生理活性物質(zhì)的封入效率高的制造方法的技術(shù)有用性高。另外，更希望是一種能以大致固定的比例釋放肽類生理活性物質(zhì)的微囊制劑的制造方法。

[解決問題的技術(shù)手段]

本發(fā)明者鑒于所述問題進(jìn)行悉心研究后發(fā)現(xiàn)，可提供一種使用可進(jìn)行生物降解的聚合物的微囊制劑的制造方法，其包含如下步驟，即，將堿性氨基酸添加至含有肽類生理活性物質(zhì)的重金屬鹽的水系溶劑中而獲得含氨基酸的S/W型懸濁液，使該含氨基酸的S/W型懸濁液分散于含有堿性氨基酸及可進(jìn)行生物降解的聚合物的含氨基酸的聚合物溶液中，形成S/W/O型乳化液，使該S/W/O型乳化液分散于水相中而獲得S/W/O/W型乳化液，從該S/W/O/W型乳化液中去除有機溶劑。所述方法即使是生理活性物質(zhì)直接暴露于油水界面，也能避免其改性，并且生理活性物質(zhì)等的封入效率高。

另外，本說明書中，只要未特別說明，則“肽類生理活性物質(zhì)的重金屬鹽”是指肽類生理活性物質(zhì)與重金屬鹽混合生成的、不溶于水及有機溶劑的沉淀物或凝聚體。

本發(fā)明是基于所述見解進(jìn)一步進(jìn)行研究而完成。即，本發(fā)明涉及以下的含肽類生理活性物質(zhì)的微囊制劑的制造方法。

第1項.一種制造微囊制劑的方法，包括：步驟A，將堿性氨基酸添加至含有肽類生理活性物質(zhì)的重金屬鹽的水系溶劑中，獲得含氨基酸的S/W型懸濁液；

步驟B，將堿性氨基酸添加至含有可進(jìn)行生物降解的聚合物的有機溶劑中，獲得含氨基酸的聚合物溶液；

步驟C，使所述含氨基酸的S/W型懸濁液分散于作為油相的所述含氨基酸的聚合物溶液中，獲得S/W/O型乳化液；

步驟D，使所述S/W/O型乳化液分散于水相，獲得S/W/O/W型乳化液；及

步驟E，去除所述S/W/O/W型乳化液中所含的有機溶劑，從而獲得微囊制劑。

第2項.根據(jù)第1項所述的方法，其中，所述含氨基酸的S/W型懸濁液中含有的堿性氨基酸與所述含氨基酸的聚合物溶液中含有的堿性氨基酸的摩爾比(含氨基酸的S/W型懸濁液中堿性氨基酸的含量：含氨基酸的聚合物溶液中堿性氨基酸的含量)為1:5～5：1。

第3項.根據(jù)第1或2項所述的方法，其中，所述肽類生理活性物質(zhì)的重金屬鹽的平均粒徑為1μm或更小，且不溶于水及有機溶劑。

第4項.根據(jù)第1～3項中任一項所述的方法，其中，還包括如下步驟：將重金屬鹽添加至含有所述肽類生理活性物質(zhì)的水系溶劑中，獲得含有肽類生理活性物質(zhì)的重金屬鹽的水系溶劑。

第5項.根據(jù)第1～4項中任一項所述的方法，其中，所述肽類生理活性物質(zhì)具有IgG結(jié)構(gòu)。

第6項.根據(jù)第1～5項中任一項所述的方法，其中，所述肽類生理活性物質(zhì)為TuNEX。

第7項.根據(jù)第1～6項中任一項所述的方法，其中，所述重金屬鹽為鋅鹽。

第8項.根據(jù)第1～7項中任一項所述的方法，其中，所述堿性氨基酸為L-精氨酸或L-組氨酸。

第9項.根據(jù)第1～8項中任一項所述的方法，其中，還包括步驟F：對所述步驟E中從S/W/O/W型乳化液中去除有機溶劑后所得的微囊，進(jìn)行冷凍干燥或噴霧干燥而獲得粉末。

第10項.根據(jù)第1～9項中任一項所述的方法，其中，所述可進(jìn)行生物降解的聚合物是聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或它們的混合物。

第11項.根據(jù)第10項所述的制造方法，其中，所述可進(jìn)行生物降解的聚合物中的乳酸及乙醇酸的摩爾比(乳酸：乙醇酸)為99：1～50：50。

第12項.根據(jù)第11項所述的方法，其中，所述可進(jìn)行生物降解的聚合物中的乳酸及乙醇酸的摩爾比(乳酸：乙醇酸)為75:25～50：50。

第13項.根據(jù)第1～12項中任一項所述的方法，其中，所述可進(jìn)行生物降解的聚合物的重均分子量為3000～200000。

第14項.根據(jù)第13項所述的方法，其中，所述可進(jìn)行生物降解聚合物的重均分子量為3000～50000。

第15項.根據(jù)第14項所述的方法，其中，所述可進(jìn)行生物降解聚合物的重均分子量為5000～20000。

第16項.一種由第1～15項中任一項所述的制造方法制造的微囊制劑。

[發(fā)明的有益效果]

本發(fā)明提供了一種能避免肽類生理活性物質(zhì)直接接觸有機溶劑層的制造方法。并且，本發(fā)明提供了肽類生理活性物質(zhì)的封入效率高的制造方法。

附圖說明

圖1是由實施例1及4所得的微囊的表面及截面的掃描型顯微鏡(SEM)圖像。

圖2是表示將實施例1及4對大鼠進(jìn)行皮下給藥時的血清藥物濃度分布的曲線圖。

具體實施方式

以下，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

另外，只要無特別說明，本說明書中“室溫”皆表示1～30℃范圍的溫度。

微囊制劑的制造方法

本發(fā)明的微囊制劑的制造方法包括：

步驟A，將堿性氨基酸添加至含有肽類生理活性物質(zhì)的重金屬鹽的水系溶劑中，獲得含氨基酸的S/W型懸濁液；

步驟B，將堿性氨基酸添加至含有可進(jìn)行生物降解的聚合物的有機溶劑中，獲得含氨基酸的聚合物溶液；

步驟C，使所述含氨基酸的S/W型懸濁液分散于作為油相的所述含氨基酸的聚合物溶液中，獲得S/W/O型乳化液；

步驟D，使所述S/W/O型乳化液分散于水相，獲得S/W/O/W型乳化液；及

步驟E，去除所述S/W/O/W型乳化液中的有機溶劑。

以下，說明各步驟。

步驟A

步驟A中，將堿性氨基酸添加至含有肽類生理活性物質(zhì)的重金屬鹽(以下，本說明書中有時稱為“肽鹽”)的水系溶劑中，獲得含氨基酸的S/W型懸濁液。

肽類生理活性物質(zhì)的示例包含化合物，所述化合物由多個氨基酸殘基構(gòu)成的肽，且在生物體內(nèi)可表現(xiàn)出有用的生理活性。分子量并無特別限制。分子量超過15萬的肽類生理活性物質(zhì)也適合采用。肽類生理活性物質(zhì)的特定示例包含激素、細(xì)胞因子、增血因子、生長因子、酶、可溶性或可溶化受體、抗體、構(gòu)成抗體的部分區(qū)域、肽類抗原、凝血因子、粘附因子和由它們與抗體恒定區(qū)結(jié)合而得的物質(zhì)。在一個實施方式中，肽類生理活性物質(zhì)可以是血清白蛋白(比如：人體血清白蛋白(HSA))。

激素的示例包含胰島素、生長激素、利尿鈉肽、胃泌素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、促甲狀腺激素(TSH)、黃體生成激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、胃動素、激肽釋放酶等。

細(xì)胞因子的示例包含淋巴因子、單核因子等。淋巴因子的示例包含干擾素(α、β、γ)、白細(xì)胞介素(IL-2至IL-12中的一個或多個)等。單核因子的示例包含白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子等。

造血因子的示例包含紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、血小板生成素、血小板增殖刺激因子、巨核細(xì)胞增效劑等。

生長因子的示例包含堿性或酸性的成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)或其家族(例如，F(xiàn)GF-9等)、神經(jīng)細(xì)胞生長因子(NGF)或其家族、類胰島素生長因子(例如，IGF-1、IGF-2等)、骨形態(tài)形成蛋白(BMP)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)或其家族等。

酶的示例包含超氧化物歧化酶(SOD)、組織纖溶酶原激活劑(tPA)等。

可溶性受體的示例包含可溶性白細(xì)胞介素-6(IL-6)受體、類胰島素生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)、可溶性腫瘤壞死因子受體、可溶性上皮生長因子受體、可溶性白細(xì)胞介素-1受體等。

可溶化受體(solubilized receptor)的示例包含利用基因工程技術(shù)溶解已知受體所得的那些受體，例如白細(xì)胞介素-1受體、白細(xì)胞介素-6受體、腫瘤壞死因子受體、Fas配體等。

抗體的示例包含人單克隆抗體、包含源于小鼠的可變區(qū)與源于人的恒定區(qū)的人-小鼠嵌合單克隆抗體等。抗體的類型包含IgM、IgG、IgE等。抗原的示例包含由上述抗體識別的抗原等，也包含血小板、病毒等。抗體的其他示例包含抗體與細(xì)胞結(jié)合而得的物質(zhì)、和抗體與其他化合物結(jié)合而得的物質(zhì)等。

凝血因子的示例包含因子VIII等。

粘附因子的示例包含細(xì)胞纖連蛋白、ICAM-1等。

生理活性物質(zhì)的示例包含內(nèi)皮素、Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸)、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(PACAP)等。

所述肽類生理活性物質(zhì)中，Etanercept或TuNEX可以作為使用IgG抗體時的一種實施方式，Etanercept或TuNEX是重組TNF-α受體蛋白是具有與Etanercept類似的氨基酸序列、分子量約為150,000的抗體。Etanercept及TuNEX在生物體內(nèi)的半衰期短，是尤其需要開發(fā)緩釋性制劑的肽類生理活性物質(zhì)之一(非專利文獻(xiàn)6)。

上述肽類生理活性物質(zhì)中的一種、兩種或更多種可以用作肽類生理活性物質(zhì)。

形成肽鹽的重金屬的示例包含二價、三價或四價的金屬等。特定的示例包含鈣、鎂等堿土類金屬，鐵、銅、鋅等過渡金屬，鋁和錫等。其中，優(yōu)選為堿土類金屬或過渡金屬，尤其優(yōu)選為鋅。

堿性氨基酸并無特別限制，示例包括精氨酸、賴氨酸、組氨酸等。堿性氨基酸既可為D氨基酸及L氨基酸中的任一種，也可為D氨基酸與L氨基酸混合而成。其中，優(yōu)選為L-精氨酸或L-組氨酸，尤其優(yōu)選為L-精氨酸。步驟A中所得的S/W型懸濁液既可僅含有這些堿性氨基酸中的一種，也可含有其中的兩種或更多種。堿性氨基酸并非鹽的形態(tài)，而必須為游離型氨基酸。

含有肽鹽的水系溶劑是通過將重金屬鹽(以下本說明書中有時稱為“添加用重金屬鹽”)添加至含有肽類生理活性物質(zhì)的水溶液中加以混合而得。

制備肽鹽的方法的示例包括以下所示的方法。然而，并不限于以下的方法。

首先，對含有肽類生理活性物質(zhì)的水溶液與添加用重金屬鹽加以攪拌使其混合，使肽類生理活性物質(zhì)的重金屬鹽沉淀。可利用離心法對沉淀物進(jìn)行分離。離心的條件并無特別限制，可設(shè)為例如以7400rpm及4℃進(jìn)行10分鐘。

含有肽類生理活性物質(zhì)的水溶液中的肽類生理活性物質(zhì)的濃度通常優(yōu)選為5w/v％或更低。

添加用重金屬鹽相對于肽類生理活性物質(zhì)的摩爾比(添加用重金屬鹽/肽類生理活性物質(zhì))并無特別限制，可以是1000或更低的范圍內(nèi)的任何比例。下限值優(yōu)選為10，更優(yōu)選為30。上限值，優(yōu)選為650，更優(yōu)選為400，尤其優(yōu)選為100。當(dāng)下限值為10時，上限值優(yōu)選為650，更優(yōu)選為400，尤其優(yōu)選為100。當(dāng)下限值為30時，上限值優(yōu)選為650，更優(yōu)選為400，尤其優(yōu)選為100。

優(yōu)選為對所得的肽鹽進(jìn)行冷凍干燥使其成為粉末。這樣可以提升長時間內(nèi)的化學(xué)穩(wěn)定性。

接著，將所得的肽鹽分散于水系溶劑中。向分散有該肽鹽的水系溶劑中添加堿性氨基酸，進(jìn)行混合，由此獲得用于下述步驟B的含氨基酸的S/W型懸濁液。

添加用重金屬鹽可以含有該添加用重金屬鹽的水溶液的形態(tài)而添加。此時，含有該添加用重金屬鹽的水溶液中重金屬鹽的濃度會根據(jù)肽類生理活性物質(zhì)的種類而有所不同。下限值可設(shè)為0.01w/v％，上限值可設(shè)為1w/v％，且優(yōu)選為0.5w/v％。即，重金屬鹽的濃度可設(shè)為0.01～1w/v％范圍內(nèi)，且優(yōu)選為0.01～0.5w/v％。

添加用重金屬鹽并無特別限制，示例包括重金屬與有機酸的鹽或重金屬與無機酸的鹽，優(yōu)選為與無機酸的鹽。

所述與無機酸的鹽的示例包括鹵化鹽(例如，氯化鋅、氯化鈣等)、硫酸鹽、硝酸鹽、硫氰酸鹽等，尤其優(yōu)選為氯化鋅。

所述與有機酸的鹽中有機酸的示例包括脂肪族羧酸、芳香族酸。脂肪族羧酸優(yōu)選為碳數(shù)2～9的脂肪族羧酸。脂肪族羧酸的示例包括脂肪族一元羧酸、脂肪族二羧酸、脂肪族三羧酸等。這些脂肪族羧酸也可為飽和或不飽和中的任一種。

當(dāng)將肽鹽的量設(shè)為100w/w％時，肽鹽中肽類生理活性物質(zhì)的含量優(yōu)選為1～30w/w％的范圍。

作為肽鹽的粒徑，優(yōu)選為1μm或更小。優(yōu)選為更微細(xì)的顆粒。肽鹽的粒徑并無特別限制。下限值可為100nm，上限值優(yōu)選為600nm。

含有所述肽類生理活性物質(zhì)的水溶液及含有所述添加用重金屬鹽的水溶液中的任一者或兩者也可包含其他添加物。該類添加物的示例包括聚乙烯醇(PVA)、聚山梨酸酯80等，其中優(yōu)選為PVA。含有該類添加物，能減小含有所述肽鹽的水系溶劑中肽鹽的粒徑。通過進(jìn)一步減小肽鹽的粒徑，能使根據(jù)本發(fā)明所得的微囊制劑中的肽類生理活性物質(zhì)更均勻地分散。

當(dāng)將PVA添加至含有肽類生理活性物質(zhì)的水溶液及含有添加用重金屬鹽的水溶液中的任一種中時，PVA的濃度并無特別限制，可設(shè)為0.05～2w/v％。

添加用重金屬鹽相對于肽類生理活性物質(zhì)的摩爾比(添加用重金屬鹽/肽類生理活性物質(zhì))并無特別限制，優(yōu)選為10～1250。

使所述肽鹽分散于水系溶劑中的方法的示例包括間歇振蕩法、螺旋槳式攪拌機或渦輪式攪拌機等利用混合器的方法、膠體磨法、均化器法、超聲波照射法等。

水系溶劑可以是可溶解所述肽鹽的水系溶劑(例如，生理鹽水等)除外的水系溶劑即可。示例包括水、pH緩沖液等。

當(dāng)使所述肽鹽分散于水系溶劑中時，優(yōu)選為對含有所述肽鹽的水系溶劑進(jìn)行超聲波照射。超聲波照射能減小所得肽鹽的粒徑。超聲波照射的照射條件并無特別限制。例如以每次進(jìn)行20秒照射、5秒間隔進(jìn)行重復(fù)，合計為20分鐘。特定地，可以頻率20kHz進(jìn)行照射，照射時間合計16分鐘。

并且，當(dāng)向分散有所述肽鹽的水系溶劑中添加堿性氨基酸并進(jìn)行混合時，可在不損害肽類生理活性物質(zhì)所具有的活性及本發(fā)明的效果的程度內(nèi)，對所述水系溶劑進(jìn)行加熱。加熱能降低所述水系溶劑的粘度、提升所述堿性氨基酸的溶解度，因此，能獲得肽類生理活性物質(zhì)等更均勻地分散的含氨基酸的S/W型懸濁液。

代替加熱或在加熱的基礎(chǔ)上，在不損害肽類生理活性物質(zhì)所具有的活性及本發(fā)明的效果的范圍內(nèi)，進(jìn)行超聲波照射，對于使肽類生理活性物質(zhì)等更均勻地分散也是有效的。

肽類生理活性物質(zhì)在微囊制劑中更均勻地分散有助于使肽類生理活性物質(zhì)以固定的速度釋放，因此可以認(rèn)為在所述加熱條件下及/或超聲波照射條件下添加及混合堿性氨基酸具有較高的有用性。

加熱時溫度范圍的下限值可設(shè)為25℃，優(yōu)選為30℃，更優(yōu)選為35℃。并且，加熱溫度的上限值可設(shè)為45℃，更優(yōu)選為40℃。當(dāng)下限值為25℃時，上限值可設(shè)為45℃，優(yōu)選為40℃。當(dāng)下限值為30℃時，上限值可設(shè)為45℃，優(yōu)選為40℃。當(dāng)下限值為35℃時，上限值可設(shè)為45℃，優(yōu)選為40℃。當(dāng)加熱溫度在上述范圍內(nèi)時，在維持肽類生理活性物質(zhì)的活性的同時，可以制備均一性更高的含氨基酸的S/W型懸濁液。

所述肽鹽不溶于水及有機溶劑，但可溶于生理鹽水。通過溶解所述肽鹽而洗脫的肽類生理活性物質(zhì)可表現(xiàn)出與成為肽鹽之前的肽類生理活性物質(zhì)同等的生理活性。特定地，當(dāng)將肽鹽體內(nèi)給予生物時，肽鹽會在體內(nèi)溶解，洗脫的肽類生理活性物質(zhì)可表現(xiàn)出預(yù)期的生理活性。

步驟B

步驟B中，向含有可進(jìn)行生物降解的聚合物的有機溶劑中添加堿性氨基酸，獲得含氨基酸的聚合物溶液。

可以使用任何在體內(nèi)逐漸分解而獲得預(yù)期的緩釋性能的可進(jìn)行生物降解的聚合物。例如可使用脂肪族聚酯、聚-α-氰基丙烯酸酯、聚氨酸等。優(yōu)選為脂肪族聚酯。此類聚合物可以在適當(dāng)?shù)谋壤旌稀＞酆闲问娇蔀殡S機、嵌段(block)、接枝中的任一種，但最優(yōu)選為無規(guī)聚合。

可進(jìn)行生物降解的聚合物的特定示例包含，聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚檸檬酸、聚蘋果酸、乳酸-天冬氨酸共聚物、乳酸-羥基己酸共聚物、乙醇酸-羥基己酸共聚物、聚丙內(nèi)酯、聚丁內(nèi)酯、聚戊內(nèi)酯、聚己內(nèi)酯、聚三亞甲基碳酸酯、聚對二氧環(huán)己酮、聚(a-氰基丙烯酸酯)、聚(β-羥基丁酸)、聚三亞甲基草酸酯、聚原酸酯、聚原碳酸酯、聚碳酸亞乙基酯、聚γ-芐基-L-谷氨酸、聚L-丙氨酸及聚海藻酸、聚碳酸酯、聚酯酰胺、聚氨酸、聚亞烷基烷基化物、聚乙二醇、聚氨基甲酸酯等均聚物及它們的共聚物。其中，優(yōu)選為聚乳酸及乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)。此類可進(jìn)行生物降解的聚合物既可單獨一種使用，也可將兩種或更多種混合而使用。

當(dāng)使用聚乳酸或乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)時，其分子量可從廣泛的范圍中適當(dāng)選擇。例如聚乳酸或乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)的分子量可以約為3000～200000，優(yōu)選約3000～50000，更優(yōu)選約5000～20000。

并且，所述乳酸-乙醇酸共聚物中的乳酸與乙醇酸的比(乳酸：乙醇酸)并無特別限定，可從廣泛的范圍中適當(dāng)選擇。一般而言，乳酸：乙醇酸的摩爾比的范圍約為99：1～50：50，優(yōu)選約75：25～50：50。

聚乳酸可為聚-D-乳酸、聚-L-乳酸、聚-DL-乳酸中的任一個。優(yōu)選為聚-DL-乳酸。并且，乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)可為D-乳酸-乙醇酸共聚物、L-乳酸-乙醇酸共聚物、DL-乳酸-乙醇酸共聚物中的任一個，優(yōu)選為DL-乳酸-乙醇酸共聚物。

可進(jìn)行生物降解聚合物優(yōu)選為在末端具有游離的羧基。游離的羧基很可能使得后述的步驟C中，可進(jìn)行生物降解聚合物在含氨基酸的S/W型懸濁液與含氨基酸的聚合物溶液的界面發(fā)揮表面活性作用，從而能形成更穩(wěn)定的S/W/O型乳化液。

可進(jìn)行生物降解聚合物的濃度并無特別限制。下限值可設(shè)為5w/v％，優(yōu)選為20w/v％，更優(yōu)選為40w/v％。上限值可設(shè)為30w/v％，優(yōu)選為40w/v％，更優(yōu)選為60w/v％。當(dāng)下限值為5w/v％時，上限值可為30w/v％，優(yōu)選為40w/v％，更優(yōu)選為60w/v％。當(dāng)下限值為20w/v％時，上限值可為30w/v％，優(yōu)選為40w/v％，更優(yōu)選為60w/v％。當(dāng)下限值為40w/v％時，上限值優(yōu)選為60w/v％。

只要有機溶劑可溶解可進(jìn)行生物降解的聚合物，有機溶劑并無特別限制。此類有機溶劑的示例包含鹵代烴，例如氯仿、二氯乙烷、三氯乙烷、二氯甲烷、四氯化碳等；醚，例如乙醚、異丙醚等；脂肪酸酯，例如乙酸乙酯、乙酸丁酯等；芳香族烴，例如苯、甲苯、二甲苯等；醇，例如乙醇、甲醇、異丙醇等；腈，例如乙腈等；酰胺，例如二甲基甲酰胺等；丙酮，例如二甲基酮、甲基乙基酮等。其中，優(yōu)選為非水混和性的有機溶劑，尤其優(yōu)選為二氯甲烷。此類有機溶劑既可僅使用一種，也可將兩種或更多種混合而使用。并且，醚及醇優(yōu)選為兩種或更多種以上的混合溶劑。

作為堿性氨基酸，既可僅使用上文所述堿性氨基酸中的一種，也可使用兩種或更多種。并且，步驟B中使用的堿性氨基酸與步驟A中的堿性氨基酸的種類可不同，但優(yōu)選為相同的堿性氨基酸。

含有可進(jìn)行生物降解的聚合物的有機溶劑可通過例如向有機溶劑中添加可進(jìn)行生物降解的聚合物并進(jìn)行攪拌而得。通過在不損害本申請發(fā)明的效果的范圍內(nèi)進(jìn)行超聲波照射，可以幫助可進(jìn)行生物降解的聚合物溶解。

含氨基酸的聚合物溶液可通過例如向所述含有可進(jìn)行生物降解的聚合物的有機溶劑中添加堿性氨基酸并使其溶解而制備。

當(dāng)使堿性氨基酸溶解時，例如通過向含有可進(jìn)行生物降解的聚合物的有機溶劑中添加堿性氨基酸、且在室溫條件下放置過夜，也可以幫助可進(jìn)行生物降解的聚合物及堿性氨基酸溶解。如此經(jīng)過長時間溶解堿性氨基酸，對于獲得可進(jìn)行生物降解的聚合物與堿性氨基酸兩者均勻地溶解的含氨基酸的聚合物溶液而言是有效的。并且，將混合液放置過夜后再進(jìn)行超聲波照射，對于獲得上述均勻的溶液而言也是有效的。超聲波照射的照射條件并無特別限制。例如每次進(jìn)行20秒照射、5秒間隔重復(fù)，合計為20分鐘。特定地，可以頻率20kHz進(jìn)行超聲波照射，照射時間合計16分鐘。

步驟C

步驟C中，使所述含氨基酸的S/W型懸濁液分散于作為油相的所述含氨基酸的聚合物溶液中，獲得S/W/O型乳化液。

當(dāng)含氨基酸的聚合物溶液中的有機溶劑為非水混和性的溶劑時，所述含氨基酸的S/W型懸濁液在含氨基酸的聚合物溶液中以微細(xì)液滴的形式分散。

分散方法包括例如間歇振蕩法、螺旋槳式攪拌機或渦輪式攪拌機等利用混合器的方法、膠體磨法、均化器法、超聲波照射法等。

制備S/W/O型乳化液的方法并無特別限制。可使用方法的示例包括利用均化器等以適當(dāng)?shù)男D(zhuǎn)速度對含氨基酸的S/W型懸濁液與所述含氨基酸的聚合物溶液的混合液進(jìn)行攪拌，在水系溶劑中使S/W型懸濁液成為細(xì)微分散的顆粒，而形成S/W/O型乳化液；使含氨基酸的S/W型懸濁液與含氨基酸的聚合物溶液的混合液以固定速度通過陶瓷過濾器等具有微細(xì)的貫通孔的過濾器，從而形成包含細(xì)微分散的顆粒的S/W/O型乳化液；及，使含氨基酸的S/W型懸濁液以固定速度通過陶瓷過濾器等具有微細(xì)的貫通孔的過濾器，從而使所述懸濁液成為細(xì)微分散的顆粒，之后使其與含氨基酸的聚合物溶液混合。

制備S/W/O型乳化液的特定方法包括以下所示的方法。然而，并不限于以下的方法。

首先，將所述含氨基酸的S/W型懸濁液緩慢地滴入至所述含氨基酸的聚合物溶液中。

對于添加有含氨基酸的S/W型懸濁液的含氨基酸的聚合物溶液，使用均化器以9600rpm進(jìn)行攪拌，獲得S/W/O型乳化液。

作為含氨基酸的S/W型懸濁液與含氨基酸的聚合物溶液的混合比，只要為可獲得S/W/O型乳化液的范圍，則并無特別限制。容積的混合比的范圍優(yōu)選為1：3～1：30，更優(yōu)選為1：5～1：20。

并且，作為S/W/O型乳化液中的堿性氨基酸的含量，優(yōu)選相對于所述可進(jìn)行生物降解的聚合物為1～10w/w％，更優(yōu)選為1～8w/w％，進(jìn)而更優(yōu)選為2～6w/w％。

步驟C中，在不損害肽類生理活性物質(zhì)所具有的活性及本發(fā)明的效果的范圍內(nèi)對添加有含氨基酸的S/W型懸濁液和含氨基酸的聚合物溶液進(jìn)行超聲波照射，對于使肽類生理活性物質(zhì)更均勻地分散而言也有效。通過進(jìn)行超聲波照射，使步驟C中所得的S/W/O型乳化液中的液滴的粒徑變小，因此，含氨基酸的S/W型懸濁液在含氨基酸的聚合物溶液中更均勻地、更容易地分散。

肽類生理活性物質(zhì)在微囊制劑中更均勻地分散也有助于使肽類生理活性物質(zhì)以固定的速度釋放，因此可以認(rèn)為在所述加熱條件下和/或超聲波照射條件下進(jìn)行步驟C非常有用。

本發(fā)明的制造方法中，含氨基酸的S/W型懸濁液及含氨基酸的聚合物溶液兩者都含有堿性氨基酸。

作為含氨基酸的S/W型懸濁液及含氨基酸的聚合物溶液中所含的堿性氨基酸的分配比，以摩爾比(含氨基酸的S/W型懸濁液中所含的堿性氨基酸：含氨基酸的聚合物溶液中所含的堿性氨基酸)計，范圍為1：5～5：1，優(yōu)選為1：3～3：1，更優(yōu)選為1：1。

當(dāng)使用精氨酸作為堿性氨基酸時，含氨基酸的S/W型懸濁液中堿性氨基酸的濃度例如可為，0.05～0.075w/v％，在含氨基酸的聚合物溶液中堿性氨基酸的濃度例如為0.01～0.03w/v％。步驟C中所得的S/W/O型乳化液中堿性氨基酸的濃度的下限值可為0.01w/v％，優(yōu)選為0.03w/v％，更優(yōu)選為0.05w/v％。并且，其上限值可為0.1w/v％，優(yōu)選為0.5w/v％，更優(yōu)選為1w/v％。當(dāng)下限值為0.01w/v％時，上限值可為0.1w/v％，優(yōu)選為0.5w/v％，更優(yōu)選為1w/v％。當(dāng)下限值為0.03w/v％時，上限值可為0.1w/v％，優(yōu)選為0.5w/v％，更優(yōu)選為1w/v％。當(dāng)下限值為0.05w/v％時，上限值可為0.1w/v％，優(yōu)選為0.5w/v％，更優(yōu)選為1w/v％。

當(dāng)使用PLGA作為可進(jìn)行生物降解的聚合物時，S/W/O型乳化液中所含的堿性氨基酸與使用數(shù)均分子量算出的PLGA的摩爾比(堿性氨基酸：PLGA)的范圍優(yōu)選為2:1～1:5，更優(yōu)選為2:1～1:2。

通過使所述堿性氨基酸的分配比處于上述的范圍，可獲得能顯著提升S/W/O/W型乳化液中肽類生理活性物質(zhì)的封入效率這一驚人的效果。

步驟D

步驟D中，使所述S/W/O型乳化液分散于水相，獲得S/W/O/W型乳化液。

所述水相并無特別限制，可使用任意的水系溶劑，優(yōu)選為使用水。

所述水相也可包含乳化劑。乳化劑優(yōu)選為能形成穩(wěn)定的S/W/O/W型乳化液的任一類型。此類乳化劑的示例包含油酸鈉、硬脂酸鈉、十二烷基硫酸鈉等陰離子性表面活性劑；聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物等非離子性表面活性劑；聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇(PVA)、羧甲基纖維素、卵磷脂、明膠、透明質(zhì)酸等。關(guān)于此類乳化劑，既可單獨使用，也可結(jié)合使用兩種或更多種。

當(dāng)所述水相含有乳化劑時，乳化劑濃度并無特別限制，并且會根據(jù)乳化劑的種類而有所不同。優(yōu)選為臨界膠束濃度或更高的濃度。當(dāng)非離子性表面活性劑用作乳化劑時，濃度可以是例如相對于水相的量的約0.005～0.5w/v％，優(yōu)選約0.01～0.1w/v％，更優(yōu)選約0.01～0.05w/v％。當(dāng)PVA用作乳化劑時，濃度可以是例如相對于水相的量的約0.01～0.5w/v％，優(yōu)選約0.01～0.1w/v％，更優(yōu)選約0.05～0.1w/v％。

制備S/W/O/W型乳化液的方法并無特別限制。可用方法的示例包括：利用均化器等以適當(dāng)?shù)男D(zhuǎn)速度對S/W/O型乳化液與作為水相的水系溶劑的混合液進(jìn)行攪拌，在水系溶劑中使S/W/O型乳化液形成細(xì)微分散的顆粒，而形成S/W/O/W型乳化液的方法；使S/W/O型乳化液與作為水相的水系溶劑的混合液以固定速度通過陶瓷過濾器等具有微細(xì)的貫通孔的過濾器，形成包含細(xì)微分散的顆粒的乳化液，從而形成S/W/O/W型乳化液的方法；及，使S/W/O型乳化液以固定速度通過陶瓷過濾器等具有微細(xì)的貫通孔的過濾器，使乳化液形成細(xì)微分散的顆粒，之后使乳化液與作為水相的水系溶劑混合的方法。在形成乳化液的過程中，水相的溫度優(yōu)選為20℃或更低，更優(yōu)選為15℃或更低。

制備S/W/O/W型乳化液的特定方法包括以下所示的方法。然而，并不限于以下的方法。

首先，使水相調(diào)節(jié)成為15℃或更低溫度。一面利用均化器對水相進(jìn)行攪拌一面使S/W/O型乳化液在轉(zhuǎn)子的上方緩慢地滴至所述水系溶劑中。進(jìn)一步對含有S/W/O型乳化液的水相進(jìn)行緩慢攪拌，可獲得S/W/O/W型乳化液。

只要可獲得S/W/O/W型乳化液，用于使S/W/O型乳化液分散的水相的量無特別限制。可以使用相對于S/W/O型乳化液的量為過剩的任意的量。例如，優(yōu)選為5倍當(dāng)量以上，更優(yōu)選為10倍當(dāng)量以上。

步驟E

步驟E中，去除步驟D中所得的S/W/O/W型乳化液中的有機溶劑，而獲得微囊制劑。

作為步驟E中去除有機溶劑的方法，可采用通常使用的水中干燥法等。可用方法的示例包括利用槳式混合器或磁力攪拌器等進(jìn)行攪拌的方法、一面利用槳式混合器或磁力攪拌器等攪拌一面逐漸減壓的方法、或者使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器等調(diào)節(jié)真空度的方法等。在此步驟中，S/W/O/W型乳化液可為室溫，優(yōu)選為20℃或更低，更優(yōu)選為15℃或更低。

去除S/W/O/W型乳化液中的有機溶劑的特定方法包括以下所示的方法。然而，并不限于以下的方法。

S/W/O/W型乳化液，在室溫下使用槳式混合器以650rpm攪拌3小時。

在步驟E中，從S/W/O/W型乳化液中去除有機溶劑，可形成內(nèi)部分散有肽類生理活性物質(zhì)的微囊。

步驟F

本發(fā)明的制造方法還可包括步驟F。

步驟F中，洗凈該微囊，對其進(jìn)行冷凍干燥或噴霧干燥而獲得粉末。

所述步驟E中形成的微囊可利用離心分離等方法收集。所收集的微囊可利用水進(jìn)行洗浄。

微囊的冷凍干燥條件及噴霧干燥條件可適當(dāng)設(shè)定。關(guān)于對微囊進(jìn)行冷凍干燥或噴霧干燥而得的粉末，可以制備成注射形式的微囊制劑，在使用時為了更適于給藥，可以添加注射用蒸餾水、注射用生理鹽水、其他適當(dāng)?shù)姆稚?/p>

微囊制劑

根據(jù)本發(fā)明的制造方法，本發(fā)明提供的制造方法穩(wěn)定保留肽類生理活性物質(zhì)、且肽類生理活性物質(zhì)封入效率高。并且，根據(jù)本發(fā)明的制造方法而得的微囊制劑包含其中高度均勻地分散的肽類生理活性物質(zhì)。更具體而言，可以認(rèn)為所得的微囊制劑具有如下結(jié)構(gòu)：微細(xì)的肽鹽均勻地分散于可進(jìn)行生物降解聚合物的基質(zhì)中，在肽鹽與可進(jìn)行生物降解聚合物的基質(zhì)的界面介有堿性氨基酸。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，可獲得以大致固定的比例釋放肽類生理活性物質(zhì)的微囊制劑。

測定方法

＜從微囊制劑提取肽類生理活性物質(zhì)的方法＞

取5～10mg的微囊制劑，使其分散于1mL的丙酮中。對該分散液在冰浴中進(jìn)行20分鐘超聲波照射。將所得的液體加入9mL的0.9w/v％氯化鈉水溶液中，并且混和。對所得的混合液在冰浴中進(jìn)行20分鐘超聲波照射。對所得的液體進(jìn)行離心分離，去除沉淀物。使用下述微量BCA蛋白質(zhì)定量法及ELISA法來測定所得的液體。

從肽鹽提取肽類生理活性物質(zhì)時，將該肽鹽加入0.9w/v％氯化鈉水溶液中，并且混和。對所得的液體在冰浴中進(jìn)行20分鐘超聲波照射。對所得的液體進(jìn)行離心分離，去除沉淀物。使用下述微量BCA蛋白質(zhì)定量法及ELISA法來測定所得的液體。

＜生理活性物質(zhì)含量＞

測定方法：微量BCA(二辛可寧酸(Bicinchoninic Acid))蛋白質(zhì)定量法

測定條件：將微量BCA蛋白質(zhì)定量法試劑A、試劑B及試劑C以A：B：C＝25：24：1的比例混合。制備TuNEX標(biāo)準(zhǔn)溶液在2～50μg/mL范圍內(nèi)的5個稀釋。標(biāo)準(zhǔn)溶液或?qū)ο蠓謩e以150μL滴至96孔內(nèi)板的各個孔中，進(jìn)而向其中添加150μL的染色液，并且混和。以37℃進(jìn)行2小時培養(yǎng)之后，使用平板讀出儀測定570nm的吸光度。根據(jù)按標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度所得的校準(zhǔn)曲線，算出蛋白質(zhì)量。

＜結(jié)合活性＞

測定方法：ELISA檢測

測定儀器：Thermo Scientific Multiskan Ascent(雷勃公司(Thermo Labsystems)制造的平板讀出儀)

測定條件：將小鼠抗人TNF RII/TNFRSF1B單克隆抗體涂布于96孔板的各孔。另外將TuNEX(100μg/mL)加入到1％牛血清白蛋白磷酸緩沖生理鹽水(BSA-PBS)中制備標(biāo)準(zhǔn)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品以100μL分別滴至各孔。另外將抗人IgG Fc-HRP加入1％BSA-PBS，將該液體以100μL分別滴至各孔，以37℃進(jìn)行1小時撫育。洗凈各孔后，將鄰苯二胺(OPD)溶液以100μL分別滴至各孔，37℃緩慢攪拌撫育10分鐘。將H₂SO₄溶液以50μL分別滴至各孔后停止酶反應(yīng)。使用微平板讀出儀測定波長490nm的吸光度。根據(jù)所得的S型曲線算出結(jié)合活性。

＜平均粒徑的測定＞

測定儀器：Beckmann Coulter Multisizer III(Beckmann儀器公司制造)

測定條件：使適量的樣品分散于生理鹽水中，以電阻脈沖方法(電敏感區(qū)法)進(jìn)行測定平均粒徑。

＜封入效率(EE)＞

計算方法：TuNEX的封入效率是按照以下式子算出。

特定地，使用以下式(1)來計算藥物負(fù)載量：

[式1]

[式中，

DL：起始藥物負(fù)載量(mg)

Mmc：含TuNEX的鋅鹽及PLGA的微囊的重量(mg)

Mt：TuNEX的重量(mg)

Mp：PLGA的重量(mg)

Mtz：TuNEX的鋅鹽的重量(mg)

Mar：堿性氨基酸的重量(mg)]

使用以下式(2)和這個數(shù)值來計算藥物負(fù)載量：

[式2]

[式中，

EE：封入效率(％)

Md：由微量BCA蛋白質(zhì)定量法測定出的藥物量(mg)

DL：起始藥物負(fù)載量(mg)]。

[實施例]

以下，列舉實施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。然而，本發(fā)明并不限于這些實施例。

實施例中使用的各種評估參數(shù)是根據(jù)上述的測定方法測定的。

實施例1(TPM048)

將TuNEX(3.5mg/mL)20mL與氯化鋅水溶液(1.0mg/mL)4mL混合，獲得TuNEX的鋅鹽。對該液體進(jìn)行離心分離而分離出該鋅鹽。鋅鹽用水洗浄后進(jìn)行冷凍干燥。使經(jīng)冷凍干燥的鋅鹽550mg分散于水1.1mL中，獲得含有該鋅鹽的水系溶劑。該鋅鹽的平均粒徑約為170nm。

向含有所述鋅鹽的水系溶劑中，添加L-精氨酸(Sigma-Ardrich公司制造)71.8mg。將所得的混合液加熱至40℃，超聲波處理而使L-精氨酸溶解，獲得含氨基酸的S/W型懸濁液。另外，使乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)(和光純藥(Wako Pure)公司制造，重均分子量約10000，乳酸：乙醇酸為50：50，含有游離羧基)2750mg溶解于二氯甲烷(DCM)5.5mL中，進(jìn)而添加L-精氨酸(Sigma-Ardrich公司制造)71.8mg。將所得的混合液放置過夜而使L-精氨酸溶解，獲得含氨基酸的聚合物溶液。接著，將所述S/W型懸濁液添加至所述聚合物溶液中，使用均化器(Homogenizer T10)在6檔(scale 6)進(jìn)行攪拌1分鐘，獲得S/W/O型乳化液。接著，將所述S/W/O型乳化液添加至作為水相的含有0.1w/v％的聚乙烯醇(PVA)的水溶液330mL中，且混合液使用均化器(Homogenizer T10)以18000rpm進(jìn)行3分鐘攪拌，獲得S/W/O/W型乳化液。對于所述S/W/O/W型乳化液，在室溫下使用槳式混合器以650rpm緩慢攪拌3小時，以蒸餾去除二氯甲烷，且以6000rpm進(jìn)行2分鐘離心分離，以收集微囊。該微囊利用水洗凈后進(jìn)行冷凍干燥，形成粉末狀的微囊制劑。

實施例2(TPM051R)

向含有鋅鹽的水系溶劑中添加L-精氨酸(Sigma-Ardrich公司制造)35.9mg、以及向溶解有所述PLGA的DCM溶液中添加L-精氨酸(Sigma-Ardrich公司制造)107.7mg，除此之外以與實施例1相同的方式進(jìn)行制造微膠囊劑。

實施例3(TPM052R)

向含有鋅鹽的水系溶劑中添加L-精氨酸(Sigma-Ardrich公司制造)107.7mg、以及、向溶解有PLGA的DCM溶液中添加L-精氨酸(Sigma-Ardrich公司制造)35.9mg，除此之外以與實施例1相同的方式進(jìn)行制造微膠囊劑。

實施例4(TPM045)

將TuNEX(3.5mg/mL)20mL與氯化鋅水溶液(1.0mg/mL)4mL混合，獲得TuNEX的鋅鹽。對該液體進(jìn)行離心分離而分離出該鋅鹽。鋅鹽利用水洗凈后進(jìn)行冷凍干燥。使經(jīng)冷凍干燥的該鋅鹽302.5mg分散于水1.1mL中，獲得含有該鋅鹽的水系溶劑。該鋅鹽的平均粒徑約為170nm。向含有所述鋅鹽的水系溶劑中添加L-精氨酸(Sigma-Ardrich公司制造)47.9mg。將所得的混合液加熱至40℃，照射超聲波而使L-精氨酸溶解，獲得含氨基酸的S/W型懸濁液。另外，使乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)(和光純藥公司制造，重均分子量約10000，乳酸：乙醇酸為50：50，含有游離羧基)2750mg溶解于二氯甲烷(DCM)5.5mL中。添加L-精氨酸(Sigma-Ardrich公司制造)47.9mg。將所得的混合液加熱至40℃，超聲波處理而使L-精氨酸溶解，獲得含氨基酸的聚合物溶液。

接著，將所述S/W型懸濁液添加至所述聚合物溶液中，并使用均化器進(jìn)行攪拌，獲得S/W/O型乳化液。接著，將所述S/W/O型乳化液添加至作為水相的含有0.1w/v％的聚乙烯醇(PVA)的水溶液330mL中，所得的混合液使用均化器進(jìn)行攪拌，獲得S/W/O/W型乳化液。

所述S/W/O/W型乳化液在室溫下使用槳式混合器緩慢攪拌3小時，使二氯甲烷蒸發(fā)，利用水洗凈后進(jìn)行冷凍干燥，形成粉末狀的微囊制劑。

比較例1(TP053R)

使L-精氨酸(Sigma-Ardrich公司制造)144mg溶解于含有所述鋅鹽的水系溶劑中而獲得含氨基酸的S/W型懸濁液、以及不向溶解有所述PLGA的DCM中添加L-精氨酸(Sigma-Ardrich公司制造)而獲得含氨基酸的聚合物溶液，除此之外以與實施例1相同的方式進(jìn)行制造微膠囊劑。

比較例2(TPM026)

將TuNEX(3.5mg/mL)20mL與氯化鋅水溶液(1.0mg/mL)4mL混合，獲得TuNEX的鋅鹽。對該液體進(jìn)行離心分離而分離出該鋅鹽。鋅鹽利用水洗凈后進(jìn)行冷凍干燥。使經(jīng)冷凍干燥的該鋅鹽60mg分散于水0.6mL中，獲得含有該鋅鹽的水系溶劑。向含有所述鋅鹽的水系溶劑中添加L-精氨酸(Sigma-Ardrich公司制造)90mg。將所得的混合液加熱至40℃，超聲波處理而使L-精氨酸溶解，獲得含氨基酸的S/W型懸濁液。另外，使乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)(和光純藥公司制造，重均分子量約10000，乳酸：乙醇酸為50：50，含有游離羧基)300mg溶解于二氯甲烷(DCM)6mL，獲得含氨基酸的聚合物溶液。接著，將所述S/W型懸濁液添加至所述聚合物溶液中，并使用均化器進(jìn)行攪拌，獲得S/W/O型乳化液。接著，將所述S/W/O型乳化液添加至作為水相的含有0.1w/v％的聚乙烯醇(PVA)的水溶液660mL中，并使用均化器進(jìn)行攪拌混合液，獲得S/W/O/W型乳化液。所述S/W/O/W型乳化液在室溫下使用槳式混合器緩慢攪拌3小時，而使二氯甲烷蒸發(fā)。所得的混合液利用水洗凈后進(jìn)行冷凍干燥，形成粉末狀的微囊制劑。

試驗例1

算出所述實施例及比較例中所得的各自粉末狀的微囊制劑中的TuNEX的封入效率。各自粉末狀的微囊制劑中的TuNEX封入效率及L-精氨酸的分配比(摩爾比)示于表1。

[表1]

通過將精氨酸包含于S/W型懸濁液相與聚合物溶液相兩者中，TuNEX可獲得高封入效率。

試驗例2

使實施例1及實施例4的粉末分散于分散介質(zhì)中，將各個分散物對體重230～240g的Lewis雄性大鼠以100mg/kg的給藥量進(jìn)行皮下給藥。并且，作為參照，以相似的方式將TuNEX(水溶液)以5mg/kg的給藥量進(jìn)行皮下給藥。所述分散介質(zhì)使用的是對含有1.25w/v％羧甲基纖維素及0.05w/v％聚山梨酸酯80的磷酸緩沖生理鹽水，并且所述生理鹽水利用高壓釜進(jìn)行滅菌。給予的TuNEX的量為100mg/kg。給藥后定期進(jìn)行采血，利用ELISA法測定血清中的TuNEX。對應(yīng)于給藥后的時間對血清中的TuNEX濃度(μg/mL)進(jìn)行繪圖所得的藥物動態(tài)分布示于圖1。實施例1及實施例4中觀察到，在長時間內(nèi)血清中TuNEX濃度都大致固定。

試驗例3

針對以下的制備例1～10所示的、由各種制備方法所得的TuNEX的鋅鹽，利用上述方法測定其平均粒徑。關(guān)于制備例1、2、4及5中所得的TuNEX的鋅鹽，評估當(dāng)所述TuNEX的鋅鹽溶解于生理鹽水時TuNEX的相對結(jié)合活性。

制備例1

一面攪拌TuNEX一面向TuNEX(3.5mg/mL)1mL中緩慢添加氯化鋅水溶液(1.0mg/mL)，生成不溶性物質(zhì)。氯化鋅相對于TuNEX的摩爾比(氯化鋅/TuNEX)為31。利用離心分離(14000rpm、30min)使該不溶性物質(zhì)沉淀并分離。對其進(jìn)行洗凈，去除過剩的氯化鋅等，進(jìn)行冷凍干燥，由此獲得粉末狀的TuNEX鋅鹽。

制備例2

一面攪拌TuNEX一面向TuNEX(3.5mg/mL)1mL中緩慢添加氯化鋅水溶液(1.0mg/mL)，生成不溶性物質(zhì)。氯化鋅相對于TuNEX的摩爾比(氯化鋅/TuNEX)為62。利用離心分離(14000rpm、30min)使該不溶性物質(zhì)沉淀并分離。對其進(jìn)行洗凈，去除過剩的氯化鋅等，進(jìn)行冷凍干燥，由此獲得粉末狀的TuNEX鋅鹽。

制備例3

使聚乙烯醇(PVA)溶解于TuNEX(3.5mg/mL)1mL，以使其濃度達(dá)到0.05w/v％。一面攪拌該液體，一面向其中緩慢添加氯化鋅水溶液(10mg/mL)，生成不溶性物質(zhì)。氯化鋅相對于TuNEX的摩爾比(氯化鋅/TuNEX)為63。利用離心分離(14000rpm、30min)使該不溶性物質(zhì)沉淀并分離。對其進(jìn)行洗凈，去除過剩的氯化鋅等，進(jìn)行冷凍干燥，由此獲得粉末狀的TuNEX鋅鹽。

制備例4

一面攪拌TuNEX，一面向TuNEX(3.5mg/mL)1mL中緩慢添加氯化鋅水溶液(1.0mg/mL)，生成不溶性物質(zhì)。氯化鋅相對于TuNEX的摩爾比(氯化鋅/TuNEX)為67。利用離心分離(14000rpm、30min)使該不溶性物質(zhì)沉淀并分離。對其進(jìn)行洗凈，去除過剩的氯化鋅等，進(jìn)行冷凍干燥，由此獲得粉末狀的TuNEX鋅鹽。

制備例5

一面攪拌TuNEX，一面向TuNEX(3.5mg/mL)1mL中緩慢添加氯化鋅水溶液(1.0mg/mL)，生成不溶性物質(zhì)。氯化鋅相對于TuNEX的摩爾比(氯化鋅/TuNEX)為314。利用離心分離(14000rpm、30min)使該不溶性物質(zhì)沉淀并分離。對其進(jìn)行洗凈，去除過剩的氯化鋅等，進(jìn)行冷凍干燥，由此獲得粉末狀的TuNEX鋅鹽。

制備例6

一面攪拌TuNEX，一面向TuNEX(3.5mg/mL)1mL中緩慢添加氯化鋅水溶液(50.0mg/mL)，生成不溶性物質(zhì)。氯化鋅相對于TuNEX的摩爾比(氯化鋅/TuNEX)為377。利用離心分離(14000rpm、30min)使該不溶性物質(zhì)沉淀并分離。對其進(jìn)行洗凈，去除過剩的氯化鋅等，進(jìn)行冷凍干燥，由此獲得粉末狀的TuNEX鋅鹽。

制備例7

一面攪拌TuNEX，一面向TuNEX(3.5mg/mL)1mL中緩慢添加氯化鋅水溶液(10.0mg/mL)，生成不溶性物質(zhì)。氯化鋅相對于TuNEX的摩爾比(氯化鋅/TuNEX)為628。利用離心分離(14000rpm、30min)使該不溶性物質(zhì)沉淀并分離。對其進(jìn)行洗凈，去除過剩的氯化鋅等，進(jìn)行冷凍干燥，由此獲得粉末狀的TuNEX鋅鹽。

制備例8

一面攪拌TuNEX，一面向TuNEX(3.5mg/mL)1mL中緩慢添加氯化鋅水溶液(20.0mg/mL)，生成不溶性物質(zhì)。氯化鋅相對于TuNEX的摩爾比(氯化鋅/TuNEX)為1257。利用離心分離(14000rpm、30min)使該不溶性物質(zhì)沉淀并分離。對其進(jìn)行洗凈，去除過剩的氯化鋅等，進(jìn)行冷凍干燥，由此獲得粉末狀的TuNEX鋅鹽。

制備例9

一面攪拌TuNEX，一面向TuNEX(3.5mg/mL)1mL中緩慢添加氯化鋅水溶液(30.0mg/mL)，生成不溶性物質(zhì)。氯化鋅相對于TuNEX的摩爾比(氯化鋅/TuNEX)為1885。利用離心分離(14000rpm、30min)使該不溶性物質(zhì)沉淀并分離。對其進(jìn)行洗凈，去除過剩的氯化鋅等，進(jìn)行冷凍干燥，由此獲得粉末狀的TuNEX鋅鹽。

制備例10

一面攪拌TuNEX，一面向TuNEX(3.5mg/mL)1mL中緩慢添加氯化鋅水溶液(40.0mg/mL)，生成不溶性物質(zhì)。氯化鋅相對于TuNEX的摩爾比(氯化鋅/TuNEX)為2514。利用離心分離(14000rpm、30min)使該不溶性物質(zhì)沉淀并分離。對其進(jìn)行洗凈，去除過剩的氯化鋅等，進(jìn)行冷凍干燥，由此獲得粉末狀的TuNEX鋅鹽。

以上制備例中所制備的粉末狀的TuNEX鋅鹽的平均粒徑、及制備各個粉末時混合的氯化鋅相對于TuNEX的摩爾比示于表2。

[表2]

制備例1、2、4及5中獲得的TuNEX的鋅鹽溶解于生理鹽水時的TuNEX的相對結(jié)合活性分別為90％、100％、100％及100％。

實施例5(L-His)

將TuNEX鋅鹽550mg換成TuNEX鋅鹽412.4mg，將L-精氨酸換成L-組氨酸，除此之外以與實施例1相同的方法制造微囊制劑。與試驗例1相同的方式對這個微囊制劑進(jìn)行封入效率測試，結(jié)果為43.94％。

比較例3

在PLGA的DCM溶液中不添加L-組氨酸，除此之外以與實施例5同樣的方法制造微囊制劑。與試驗例1相同的方式對該微囊制劑進(jìn)行封入效率的測定，結(jié)果為5.52％。

實施例6(HSA)

將HSA(3.5mg/mL)10mL與氯化鋅水溶液(30mg/mL)2mL混合，可以獲得HSA的鋅鹽。將此溶液離心以分離鋅鹽，鋅鹽用水清洗，凍結(jié)干燥。凍結(jié)干燥的鋅鹽481.9mg在1.1mL的水中分散，以得到含鋅鹽的水系溶劑。

在含有鋅鹽的水系溶劑中，添加71.8mg L-精氨酸(Sigma-Ardrich公司制造)。將該混合液加熱到40度，超音波照射以溶解L-精氨酸，因而得到含有氨基酸的S/W型懸濁液。另外，將乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)2750mg(和光純藥社(Wako Pure)生產(chǎn)，重量平均分子量約1000，乳酸：乙醇酸為50:50,含有游離羧基)溶于二氯甲烷(DCM)5.5mL，添加71.8mg的L-精氨酸(Sigma-Ardrich公司生產(chǎn))。該混合液放置過夜以溶解L-精氨酸，得到含有氨基酸的聚合物溶液。

然后，在聚合物溶液里添加S/W型懸濁液，使用均化器(Homogenizer T10)在6檔攪拌1分鐘，可獲到S/W/O型的乳化液。在300mL含有0.1w/v％聚乙烯醇(PVA)的水溶液(水相)中添加S/W/O型乳化液，使用均化器(Homogenizer T10)用18000rpm攪拌該混合液3分鐘，可以獲得S/W/O/W型乳化液。S/W/O/W型乳化液于室溫條件下用槳式攪拌器650rpm攪拌3小時，通過氣化除去二氯甲烷。所得的混合液用6000rpm離心2分鐘，回收微囊。用水洗凈，然后凍結(jié)干燥以得到粉末狀微囊制劑。與試驗例1相同的方式對所得的微囊制劑進(jìn)行封入效率的確定，結(jié)果為48％。

比較例4(HSA)

不添加L-精氨酸，除此之外以與使用實施例6相同的方法，得到微囊制劑。與試驗例1相同的方式對此微囊制劑進(jìn)行封入效率的測試，結(jié)果為8％。