本申請要求保護美國臨時申請61/991,247(提交于2014年5月9日)的優先權的權益，其內容以引用方式整體并入本文。發明領域本發明涉及改良的環磷酰胺制劑及其制備方法。發明背景環磷酰胺是“2-[雙(2-氯乙基)氨基]四氫-2H-1,3,2-氧氮磷雜環己烷-2-氧化物一水合物”的通用名稱，該物質廣泛用作抗腫瘤藥物，化學上與氮芥相關。環磷酰胺是一類環狀磷酸酯酰胺的一個實例，其公開并請求保護于美國專利3,018,302中(1962年1月23日授權)，權利人為H.Arnold等。環磷酰胺以商品名CYTOXAN銷售。ENDOXAN和NEOSAR是環磷酰胺的類似藥物制劑的其他商品名。市售環磷酰胺產品是環磷酰胺一水合物的無菌干燥混合物。盡管這些產品中所用環磷酰胺的晶體形式為一水合物，其為最易于分離和產生作用的形式，但同樣存在無水形式。如本文所用，術語"環磷酰胺"一般指藥物物質本身，無論晶體形式如何；術語"環磷酰胺一水合物"特指一水合物且術語"無水環磷酰胺"指無水形式。一水合物形式優選用于藥學操作，因為無水形式在約25℃、暴露于約20-30％或更高的相對濕度時易于吸水，從而形成一水合物。盡管一水合物是穩定的，然而在干燥條件下(例如相對濕度為約20％或更小)，一水合物開始失去水合物中的水，其可能在生產過程中降低穩定性。無水形式和一水合物形式之間的內在轉化可能部分地導致穩定性方面的局限性，因此建議環磷酰胺產品的存儲溫度不超過30℃(86°F)，且優選儲存于約25℃(77°F)或更低的溫度。目前，環磷酰胺的腸胃外給藥制劑由無菌包裝的充滿環磷酰胺一水合物的干燥粉末組成。在給藥前將無菌粉末溶解于水或生理鹽水中，其可口服以及腸胃外施用。在制備好之后意在將溶液本身迅速給藥，但在制備好之后多至幾小時的時間里使用更令人滿意。在生產和/或儲存過程中，目前可得的干燥粉末制劑產品可得到玻璃狀或粘著的性質，使得產生溶解時間延長、效能下降的不期望的物質。隨著存儲時間延長，或者若超過了儲存溫度的上限，這一惡果將變得更顯著。無菌固體溶解的通常操作是在容器中使用經升溫的適當的水性載體，從而促進溶解過程，特別是當固體溶解緩慢時。D.Brooke等報道了一項研究，其中檢驗了簡單加熱環磷酰胺溶液的效果(AmericanJournalofHospitalPharmacy，32:44-45(1975))。該研究的結論是，在加入水性載體后為了促進溶解對環磷酰胺的小瓶進行加熱可能導致最終可注射產品的效能下降。總之，穩定性的局限性和溶解的困難性經常可能導致在臨床上使用有效性降低的環磷酰胺溶液。發明概述因此，本發明的一個目標是提供含有環磷酰胺的液體組合物，其具有改良的穩定性特征以及改善的外觀，同時保持適于用作藥物劑型的效能。本發明包括含有環磷酰胺的組合物，例如藥學上可接受的含有環磷酰胺的溶液，其具有延長的穩定性。所述組合物包括：a)環磷酰胺；b)乙醇；和c)可溶于乙醇的酸化劑。本發明的一些優選方面包括溶劑系統，其包括含有乙醇和其他賦形劑例如檸檬酸、二水氯化鈣或其組合的那些系統。發明詳述如前文所述，本發明包括藥學上可接受的含有環磷酰胺的組合物，優選為液體形式，其具有延長的穩定性。本發明一些寬泛的方面包括含有環磷酰胺的組合物，其包含環磷酰胺、乙醇和可溶于乙醇的酸化劑。優選地，含有環磷酰胺的組合物的形式為基本上無水的乙醇溶液，其易于即時稀釋和給藥至有此需要的患者。本發明的組合物中所包含的環磷酰胺是該分子的藥學上可接受的形式之一，例如環磷酰胺一水合物(美國藥典)或環磷酰胺無水物。本發明的組合物中所包含的乙醇可為任何乙醇，優選滿足美國或歐洲藥典要求的乙醇。在本發明的特定方面中，乙醇是無水的。在一些實施方式中，本文所述組合物中包含的可溶于乙醇的酸化劑的pKa值小于5.0。在諸多方面中，所述可溶于乙醇的酸化劑為有機或無機酸，其適于被加入腸胃外組合物中。例如，適當的酸包括但不限于有機酸(例如琥珀酸、乙酸、乳酸和酒石酸)和無機酸(例如磷酸、硫酸、鹽酸和硝酸)。在一些優選的方面中，組合物中包括的酸化劑為無水形式。一個特別優選的酸化劑為無水檸檬酸。在替代性方面中，酸化劑可包括緩沖劑例如藥學上可接受的緩沖劑，其包括但不限于以下緩沖劑：例如檸檬酸鹽緩沖劑、磷酸鹽緩沖劑、乙酸鹽緩沖劑、硫酸緩沖劑和基于HCl的緩沖劑。通常，組合物中所包含的可溶于乙醇的酸化劑的量足以在稀釋于靜脈注射液中(環磷酰胺濃度為20mg/ml)時使溶液pH保持在約3至約4之間。在本發明的一些方面中，在稀釋至給藥患者的體積之前，可溶于乙醇的酸化劑的充足的量范圍將為所述組合物的約0.2至約2％W/V。在一些方面中，酸化劑的量為1.0至1.8％W/V，優選約1.6％。替代性的方面包括量為約0.4至約0.8％W/V、和量為約0.4至約0.6％W/V。在此說明，這可相當于可溶于乙醇的酸化劑在所述組合物的濃度為約1至約8mg/ml、約2至約6或約2至約4mg/ml(稀釋至給藥患者的體積之前)。出于例示的目的，含有200mg/ml環磷酰胺的組合物可含有約4mg/ml檸檬酸，而含有400mg/ml環磷酰胺的組合物可含有約8mg/ml檸檬酸。因此，該乙醇組合物中藥物與酸化劑的適當的比可為50mg藥物:1mg酸化劑。本領域普通技術人員理解，可溶于乙醇的酸化劑的充足的量可在一定程度上取決于所選酸化劑而變化。盡管所需要的量通常在上述范圍之內，但本領域普通技術人員也能夠確定任何酸化劑的具體量。在本發明的溶液中，在稀釋和給藥于患者之前，環磷酰胺的濃度在諸多方面中為約100至約600mg/ml，或為約250至約550mg/ml。在其他優選實施方式中，環磷酰胺濃度為約200、400或500mg/ml。本發明的這些方面通常用于儲存的目的。如本領域普通技術人員所能夠理解，在靜脈注射或腸胃外給藥至有此需要的患者之前，所述高濃度的基于醇的組合物通常將經歷顯著的稀釋。在進一步實施方式中，本發明的含有環磷酰胺的溶液除了可溶于乙醇的穩定劑還包括氯離子源，或者所述離子源本身即作為可溶于乙醇的穩定劑。所包含的含量足以達到環磷酰胺的期望的長期儲存穩定效果。在諸多實施方式中，穩定劑的量在即時稀釋組合物中為約1至約5mg/ml。適當的氯離子源為包含含氯鹽的氯離子源，例如二水氯化鈣。替代選項包括但不限于：氯化膽堿和六水氯化鎂。本領域普通技術人員顯然了解替代選項。藥學上可接受的含有環磷酰胺的溶液還可包括抗氧化劑，例如硫代甘油，沒食子酸丙酯，甲硫氨酸，半胱氨酸及其組合。硫代甘油是優選的抗氧化劑。本發明的組合物中抗氧化劑的可用濃度的范圍為約1至約8mg/ml。本文所述的含有環磷酰胺的組合物即溶液的保存期顯著延長。在本發明的特定方面，在約5℃的溫度約18個月后，含有環磷酰胺的溶液保持至少約90％或約95％的環磷酰胺含量，且替代性地至少保持約97％的環磷酰胺含量。伴隨這些優勢，本文請求保護的組合物能夠與目前在售的產品相區別，因為本發明的液體制劑不需要30分鐘的溶解時間，且能夠直接溶解于含環磷酰胺的小瓶中達到20mg/ml的濃度，或溶解于輸注袋中。在本發明一些替代性的方面中，本發明的組合物包括補充的增溶劑，例如丙二醇，含量為約5至約30％v/v。在這些替代性的方面中，即時稀釋組合物中乙醇的量將為至少約70％v/v或約80％v/v。根據本發明這一方面的一個適當的溶劑系統提供了環磷酰胺組合物，其含有約70％乙醇，約30％丙二醇，和約0.5％硫代甘油。本發明進一步包括藥學上可接受的容器，其含有本文所述的藥學上可接受的含有環磷酰胺的溶液。該容器可為單次使用或多次使用的小瓶，含有一或多個通常劑量的藥物。一般來說，容器將包括含有約0.1g至約4g藥物的環磷酰胺溶液。本發明的一些其他方面包括容器，其中在乙醇中含有約500mg，約1克或約2克的環磷酰胺，且即時稀釋于含此藥物的靜脈注射液小瓶中。例如，含有500mg環磷酰胺的容器或小瓶可包括約2.5ml所述組合物，環磷酰胺濃度為200mg/ml，且包括用于稀釋劑的空間。類似地，設計為裝載1或2克環磷酰胺的容器將含有約5ml或10ml的本文所述的200mg/ml環磷酰胺組合物，且當濃度為400或500mg/ml時其體積按比例縮小，即裝載2克環磷酰胺的容器還可用以下制備：5ml本文所述的400mg/ml環磷酰胺組合物。或者，也涵蓋裝有1、2或4ml的500mg/ml組合物的容器，任選在其中具有用于稀釋的空間。使用中，該容器或者允許向其中加入稀釋劑，或者被設計為允許達到劑量被抽取出來(drawnup)并置于適當的更大體積的袋或其他容器中的需求。在上述任一種情況下，容器將允許稀釋本文所述的高濃度溶液。適當的稀釋劑包括普通技術人員公知的稀釋劑，例如生理鹽水(0.9％NaCl水溶液)，注射用水(WFI)，二分之一生理鹽水(0.45％NaCl水溶液)，D5W和D5W/生理鹽水，等等。環磷酰胺濃縮液可以500mg的規格(strength)充入25或30cc小瓶中，以1g的規格充入50cc小瓶中，和以1g的規格充入100cc小瓶中。可向其中加入合適量的稀釋劑或輸注液，以得到最終為20mg/ml的環磷酰胺濃度，用于直接輸注。下表總結了自不同濃縮液來制備20mg/ml環磷酰胺所需的填充體積和稀釋劑。表A：對于不同濃度的環磷酰胺濃縮液，制備20mg/ml環磷酰胺濃度所需要的填充體積和稀釋劑該溶液可進一步稀釋于靜脈注射袋中以得到2mg/ml溶液，用于緩慢靜脈輸注。當給藥至患者時，液體中的環磷酰胺的濃度將根據患者的需要而變化。一些適于給藥患者的濃度包括20mg/ml或2mg/ml。藥物與液體稀釋劑之比可為約1:1至約1:100。本發明還包括治療哺乳動物環磷酰胺反應性癥狀的方法。所述方法包括向有此需要的哺乳動物給藥有效量的藥學上可接受的組合物，其含有藥學上可接受的含有環磷酰胺的溶液。藥物的量和給藥頻率對于普通技術人員是明顯的。申請人以引用方式向本文中并入FDA批準的環磷酰胺產品包裝說明書文件。出于本發明的目的，在溶液中“維持環磷酰胺含量”應理解為環磷酰胺的量含量(例如在約5℃的溫度經約18個月)與初始含量的比較，所述含量通過高效液相色譜(“HPLC”)確定。因此，損失的藥物量是基于所述組合物或制劑中存在環磷酰胺的原始量來計算的。實施例實施例1-比較實施例Alam等在美國專利4,879,286公開了環磷酰胺溶液，用于腸胃外或口服給藥。該制劑包括環磷酰胺，溶解于含有有機溶劑(例如多元醇，優選丙二醇、聚乙二醇或甘油，或其組合)的溶液中。其穩定性數據表明基于多元醇的非水制劑不具有足以達到FDA批準要求的穩定性。為了與Alam等的工作進行比較，使用丙二醇、聚乙二醇和注射用水的不同組合制備了11種制劑，用作包括本申請所作工作在內的比較實施例。這些制劑中的環磷酰胺濃度自5mg/ml至100mg/ml變化。所測試的制劑及其穩定性數據列于下面的表1、表2和表3中。表1:環磷酰胺制劑表2：制劑1-11在室溫的穩定性表3：制劑8-11在4℃的穩定性制劑1至8含有變化量的水。數據表明，在水的存在時降解水平增加。類似于前述美國專利4,879,286中的制劑，制劑9-11完全是基于有機溶劑的制劑，且在室溫儲存時也顯示顯著的降解。甚至在冷藏條件下也觀察到降解。例如制劑11在4℃儲存9周時顯示約2.7％的效力損失，這表明在4℃儲存一年后將觀察到大于10％的效力損失。這樣的降解水平是市售產品所不能接受的。此外，環磷酰胺以20mg/mL的濃度給藥(例如在制劑9-11中)是十分高滲性的，將導致患者溶血或其他血液不相容性，例如靜脈炎。因此，這些制劑不適于用作腸胃外產品。同樣研究了乙醇/PEG400，乙醇/丙二醇和PEG400/丙二醇混合物(含和不含檸檬酸)中500mg/ml環磷酰胺的溶液穩定性。對于很多組合而言，溶液穩定性不能滿意，因為即使在5℃儲存時溶液顏色也常常變黃并出現效力損失。一些溶液在5℃儲存一個月后變得混濁。各種混合溶劑的組合中的環磷酰胺溶液的長期穩定性數據(18個月)總結于表4中。表4：環磷酰胺(500mg/ml)在混合溶劑中18個月的穩定性(儲存于5℃)CA:檸檬酸TG:硫代甘油為了提供適當的即時稀釋型腸胃外制劑，環磷酰胺的降解必須盡可能減少。理想狀態下，對于抗癌藥物，無論是18個月還24個月的儲存期中，降解優選不超過3-5％。實施例2由于環磷酰胺基本上是高度水溶性的藥物，且Alam等在美國專利4,879,286中測試了低的藥物濃度，因此預期有機溶劑可能將會限制可接受的腸胃外溶劑可得到的溶解度。在此實施例中，進行了研究以確定環磷酰胺一水合物在藥學上可接受的溶劑例如丙二醇、聚乙二醇和乙醇中的溶解度。驚奇地發現，在上述每種溶劑中，環磷酰胺一水合物的溶解度均超過了500mg/ml。制備500mg/ml溶液的優勢在于，當稀釋以得到所需的適于靜脈給藥的20mg/ml環磷酰胺溶液時，混合物中有機溶劑濃度小于約3％，其對于靜脈注射而言是安全的水平。由于這些溶劑提供了遠遠達到充分溶解水平的溶解度，檢測了環磷酰胺濃度為500mg/ml的溶液的穩定性。然而，在純溶劑中得到的研究數據不能令人滿意。當使用PG和PEG400作為單一溶劑時觀察到顯著的降解，在所有溫度條件下，溶液均在視覺上顏色變黃。然而，環磷酰胺在乙醇中的穩定性似乎顯著地優于另兩種溶劑，且所得數據歸納于表5中。盡管顯著優于前述Alam和美國專利4,879,286中部分含水溶液的數據，單用乙醇的數據表明仍然難以獲得具有可接受的降解水平的可市售產品。表5：環磷酰胺(CPP)在乙醇中的液體濃縮液在25℃的穩定性存儲時間CPP含量(mg/mL)初始值的百分比初始454.6100.01周453.899.82周453.699.83周449.498.91個月449.298.82個月425.293.5為了進一步改善藥物在乙醇中的穩定性，需要考慮環磷酰胺降解的化學過程。已知環磷酰胺在水中水解形成四個主要降解產物，其在美國藥典專論中描述為“相關化合物A、B、C和D”。涉及相關化合物A和C(RC-A、RC-C)的直接水解以及相關化合物B和D(RC-B、RC-D)的HCl的內部置換的機理，最早由Friedman提出(J.Amer.Chem.Soc.1965，87，4978-9)，然后由Gilard等進一步發展(J.Med.Chem.1994，37，3986-93)，其概括如下：Gilard已報道，在適中的酸性pH，環磷酰胺在水中的穩定性是最好的。因此，測試了少量無水檸檬酸的效果，其可溶于乙醇中。此外，也測試了加入氯離子的效果，預期所加入的氯離子能夠延遲環磷酰胺氯離子的消除。這一點通過加入可溶于乙醇的二水氯化鈣來實現。結果示于表6中。表6：環磷酰胺(CPP)在含有檸檬酸和氯化鈣的乙醇中的穩定性檸檬酸的加入提高了藥物穩定性，在25℃儲存3個月后藥物含量最多保持97.3％；相比之下，不含檸檬酸的制劑在25℃儲存2個月后只觀察到保持93.5％的藥物含量。氯化鈣的存在也是有益的，顯示額外的氯離子具有穩定效果。二水合物的存在似乎不會引起任何由于水解導致的變化，如同環磷酰胺的水合似乎不具有降低穩定性的作用一樣。然后將樣品儲存于5℃保持30個月并進行分析。穩定性數據歸納于下表7中：表7：環磷酰胺乙醇溶液的長期穩定性(儲存于5℃)環磷酰胺/檸檬酸的濃度分析時間(月)保持環磷酰胺的百分比500/03289.0500/23189.1500/43189.4500/63188.6500/83093.3500/103092.4注：上述數據通過NMR分析生成。在5℃的更長時間的數據表明，超過18個月后，制劑的藥物含量基本沒有變化，例如參見含有4-6mg/mL檸檬酸的實施例樣品，表明此類制劑的長期穩定性滿足了市售產品的要求。實施例4-8在不同的濃度和不同尺寸的小瓶中對穩定性進行了測試，以觀察乙醇的任何蒸發損失。穩定性數據見表8。表8在所有儲存條件和時間點，在任何塞好的小瓶中都沒有觀察到由于乙醇蒸發造成的重量損失。當前第1頁1 2 3