包括酪蛋白衍生肽的藥物組合物及其使用方法與流程
技術領域
本發明涉及源自酪蛋白的肽及其在泌乳動物管理中的用途，特別涉及用于縮短泌乳牲畜的干奶期(dry period)長度、增加其產奶量、改善分娩后乳液衛生以及改善所述牲畜福利的方法。本發明還涉及無菌溶液形式的藥物組合物，其包括源自酪蛋白的肽，該組合物澄清且基本上無膠粒。
背景技術：
酪蛋白(CN)是人及非人哺乳動物乳液中主要的蛋白質。先前酪蛋白根據每種片段的電泳遷移率可表征為主要由α、β和γ三種片段組成(Hipp等.1952.Dairy Sci.,35：272)。目前根據每種亞型αS1、αS2、β和κ的氨基酸序列對酪蛋白進行定義(Engel等.1984.J.Dairy Sci.67:1607-1608)。
酪蛋白經酶促水解產生的肽有利于年輕一代的健康和正常發育(FitzGerald等,1998.Int.Dairy J.8:451-457)，并且用作局部的乳腺功能調節劑(Silanikove等,2000.Life Sci.67:2201-2212；Shamay等,2002.Life Sci.70:2707-2719)。絲氨酸蛋白酶(即纖溶酶)是乳液中主要的蛋白酶，并且已知可從β-酪蛋白、α-S1酪蛋白和αS2-酪蛋白產生抗煮沸的肽(-蛋白胨)。
-蛋白胨(PPs)，也叫做酪蛋白磷酸肽(CPP)，其占乳清蛋白的大約三分之一(Andrews,1983.J.Dairy Res.50:45-55)。乳液中的纖溶酶主要以無活性的纖溶酶原形式存在，并且纖溶酶原激活劑可調節纖溶酶原轉化為纖溶酶(PolitisI.,1996.J.Dairy Sci.79:1097-1107)。
酪蛋白衍生肽已被證實具有多種生物活性及用途。對乳液化合物的研究證實了與酪蛋白相關的殺菌活性。美國專利第3,764,670號公開了源自酪蛋白的具有抗微生物的抗生素性能的新型多肽。
還觀察到酪蛋白肽具有免疫調節活性。例如，PCT國際專利申請WO01/13739公開了增強哺乳動物免疫力并通過直接施用或通過食物攝入包括磷酸化氨基酸(如酪蛋白磷酸肽)的蛋白質而促進哺乳動物生長的方法。由于哺乳動物免疫力增強、抗感染性疾病的耐受性提高以及抑制其生長的因素消除，因而促進了哺乳動物的生長。
美國專利申請公布文本第20020147144和20040167073號公開了來源于乳液中酪蛋白的或與乳液中酪蛋白αS1片段的N末端具有同一性的序列相似的生物活性肽，所述肽能夠刺激和增強免疫反應、抵抗病毒感染、使血清膽固醇水平正常化并促進血細胞生成。
PCT國際專利申請WO 2005/081628公開了來源于乳液酪蛋白的αS1、αS2、β-或κ-酪蛋白片段序列的或與其序列相似的生物活性肽，其具有免疫調節的能力以及具有其他的治療活性，包括但不限于刺激并增強免疫反應、抗病毒感染、使血清膽固醇水平正常化并促進血細胞生成。酪蛋白衍生肽無毒并且可用于預防和治療免疫性病理、糖尿病、高膽固醇血癥、凝血機制紊亂(hematological disorder)以及病毒相關的疾病。
歐洲專利申請第EP 1375513號公開了在源自酪蛋白的肽中，具有包括一個以上磷酸絲氨酸殘基的氨基酸序列的肽顯示出強大的免疫增強活性。具體地，本發明涉及包括由氨基酸序列Q1-SerP-X-SerP-Q2組成的肽的免疫增強劑，其中SerP表示磷酸絲氨酸殘基，X表示一至三個任意氨基酸殘基，以及Q1和Q2獨立地不存在或代表至少一個任意的氨基酸殘基。
屬于本發明發明人之一及其合作者的美國專利第6,391,849號公開了用作鈣螯合劑的酪蛋白衍生的-蛋白胨，及其在控制乳腺的生理變化以及預防、治療和逆轉感染中的用途，其中所述生理變化包括暫時性產乳停止、持續性產乳停止和退化期的誘導。
酪蛋白磷酸肽已經顯示具有獨特的能夠結合常量元素(如Ca、Mg和Fe)和微量元素(如Zn、Ba、Cr、Ni、Co和Se)的性能，這些元素可在小腸溶解因而可以被有效吸收。同樣地，將CPP用作飲料和嬰兒食品以及牙科藥劑的添加劑。例如，美國專利第5,834,427號公開了具有新型氨基酸序列的純化的酪蛋白磷酸肽(CPP)，以及具有相同氨基酸序列的純化的酪蛋白。CPP或包括相同氨基酸序列的酪蛋白在動物體內有更好的溶解和吸收礦物質的能力。CPP或包括相同氨基酸的β-酪蛋白-H可添加到食品、飲料、藥物、美容產品中，并以促進動物吸收礦物質的有效量飼喂。包括β-酪蛋白H或有創造性的CPP和藥學上可接受的載體的口服組合物可以減輕或緩解牙科的超敏反應。
美國專利第5,227,154號公開了通過使用口服組合物治療牙而控制牙石的方法，其中所述口服組合物包括特異性的酪蛋白磷酸肽和/或其鹽。美國專利第6,652,875號公開了將生物活性成分遞送至生物表面的劑型，所述生物表面包括諸如牙齒和齒齦的牙齒表面，其中所述劑型包括至少一種分離并純化的酪蛋白或其鹽以及至少一種生物活性成分在水中的懸浮液或溶液。
已經提出了多種制備酪蛋白水解產物(特別是CPP)的方法。例如，美國專利第4,740,462號公開了通過結晶胰蛋白酶水解酪蛋白，隨后分餾，再利用超濾或諸如凝膠滲透色譜或離子交換色譜的色譜技術進行分離而制備CPP。該方法有一定的研究價值，但在工業生產上不實用也不經濟。其他方法涉及利用食品和/或藥物組合物中所不能接受的毒性物質——如氯化鋇。
不管所采用的制備方法如何，含有酪蛋白水解產物的溶液都易于產生渾濁。在藥物組合物以及在某些食品(特別是飲料)中，濁度被認為是明顯的不利因素，因為在渾濁的組合物中用肉眼監測變化特別是檢測污染物是困難的或是不可能的。美國專利第5,405,756號公開了一種適合用作飲料添加劑且不影響飲料透明性的酪蛋白磷酸肽的制備方法，但是，所得的蛋白質含有鈣，此外，只有在酸性pH下才獲得澄清溶液。
泌乳牲畜動物的管理
在現代乳品加工業中，泌乳動物群經歷了可控的擠奶和妊娠周期，這種狀態有利于產奶量的顯著增加。在現在的乳畜群例如奶牛和山羊的管理中，泌乳期和妊娠期間有一明顯重疊，其中“干奶期”是在分娩之前50天至70天期間通過停止擠奶而施加的。設置這種狀態以在對隨后健康泌乳期所需的誘導退化過程的需要和全年高產乳量需求之間進行平衡。
停止擠奶導致乳腺分泌的迅速變化，并引發活躍的乳房退化過程。該過程包括組織和乳液組成中的多方且高度有序的變化，這些變化發生在泌乳階段和非泌乳階段的過渡期間。在乳房退化的第一階段，由引發凋亡的局部刺激啟動該過程，但是通過恢復擠奶可逆轉該退化(Capuco和Akers,1999.J.Mammary Gland Biol.Neoplasia 4:137-144；Wilde等,1999.J.Mammary Gland Biol.Neoplasia 4:129-136)。在單側停止擠奶的泌乳山羊中(Quarrie等.,1994.Biochem.Soc.Trans.22:178S)或在密封乳頭后的泌乳小鼠中(Li等.,1997.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:3425-3430；Marti等,1997.Eur.J.Cell.Biol.73:158-165)，觀察到當在單個乳腺中誘導乳液淤積時，這種局部控制可導致退化。
退化的第二階段是持續性的，并且擠奶不能引起乳液分泌的恢復(Capuco和Akers,1999.ibid；Wilde等,1999.ibid)。第二階段退化的逆轉僅僅發生在產后緊接著的泌乳階段。此階段的特點是蛋白酶激活，所述蛋白酶通過降解細胞外基質和基底膜以及大量缺失泡狀細胞(alveolar cell)而破壞乳腺的泡狀小葉(lobular alveolar)結構。
停止擠奶誘導退化與發展為乳腺炎增加的風險有關，乳腺炎是一種由病原體的乳房內感染(IMI)所引發的疾病，所述病原體主要為細菌，也可以是酵母、真菌或甚至是藻類。乳腺炎可以是臨床型乳腺炎，其在(一些常規的病例中)具有局部臨床體征和乳液分泌異常，或者是亞臨床型乳腺炎，其伴有產乳能力喪失和乳液質量下降。
現代的奶牛雖然每天還能生產20升至40升的乳液，但其通常會變干。因此，乳液淤積可引起乳房分泌的泄漏，其實質上增加了罹患IMI的風險。導致長退化過程的常規變干，通常與IMI的較高比率相關。臨床型和亞臨床型的乳腺炎由于乳液廢棄品(較低的農場產量)、較次的乳液質量(較低的收入)、奶牛早期的剔除(遺傳潛力的喪失)、藥物花費、獸醫開支以及增加的人工費，而給農場主帶來極大的經濟損失。乳腺炎是最能使乳畜群虛弱的疾病，僅其每年就花費掉美國乳品加工業大約20億的美元。
先前已由本發明的發明人之一與其合作者證實了純化的β-酪蛋白(β-CN)片段1-28可使奶牛和山羊的泌乳量下調。這種肽的活性與其阻斷乳房上皮細胞頂膜的鉀通道的能力相關(Silanikove等,2000.supra)。
也表明給山羊或奶牛的乳房注射酪蛋白水解物(CNH)的粗品模擬了自然的退化過程，誘導了局部的炎癥性反應和緊密連接完整性的缺失，并使乳房分泌迅速變干(美國專利第6,391,849號；Shamay等,2002.ibid；Shamay等.,2003.J.Dairy Sci.86:1250-1258)。由CNH誘導的過程比自然變干所誘導的過程更為迅速和同步。這些結果表明有可能顯著縮短退化所需時間。但是，是否有可能縮短或者消除干奶期而不影響隨后的泌乳期乳液產量仍然不清楚。Annen等(2004.J Dairy Science 87:3746-3761)表明用牛生長激素(bST)治療經產奶牛可以縮短甚至消除干奶期，且不減少產奶量，但是，這種治療對初產奶牛沒有同樣效果。而且，先前已表明使用bST的治療導致產生乳腺炎、生殖障礙以及其它生產相關性疾病，并且還表明這種治療增加了步伐紊亂。
西方國家最近十年越來越關注農場動物的福利(Broom DM 1992In:Phillips等,Eds.Farm Animals and the Environment.CAB Wallingford UK,第245-253頁)。密集生產系統內近來動物住所和管理條件的發展反映了動物福利受到的道德關注的增加(Fregonesi等,2001.Livestock Production Sci.68:205-216；Fregonesi等,2002.Livestock Production Sci.78:245-257)。定義為預防遭受并增加存在的積極感受或舒適度的動物福利的改善，是牲畜管理中重要的因素(Broom,1992.ibid)。農場動物的福利狀態可用與受損生物功能尤其是與健康狀況下降和生理應激反應增加有關的測定法來評價。
存在對縮短乳畜群干奶期而對產奶量無負面影響的、增加產奶量和改善衛生并保持和/或改善牲畜動物福利的安全有效治療方法的未滿足的需求。此外，包括酪蛋白衍生肽的、隨時可使用的澄清溶液形式的藥物組合物將會是非常有利的。
技術實現要素：
本發明通常涉及泌乳牲畜動物的管理，以及包括酪蛋白衍生肽的藥物組合物。特別地，本發明涉及用于縮短對泌乳動物有影響的干奶期的長度，提高其產奶量和改善乳液衛生，并預防遭受與乳腺相關的感染，防止擠奶突然停止的方法。本發明還涉及藥物組合物，其包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，其中所述組合物為無菌澄清溶液形式，其基本上無酪蛋白膠粒，并包括基本上均一的約1,000道爾頓至約5,000道爾頓低分子量的肽。
在泌乳動物預期的分娩前強制其停止產奶以保持產奶量是畜群中常見的做法。非泌乳期(即“干奶期”)，對于動物身體健康以及維持其產奶能力是非常重要的。迄今，50天至70天的干奶期已成為行業標準。目前，本發明出乎意料地顯示了有可能縮短干奶期的長度而不對分娩后的產奶量產生負面影響。目前本發明意想不到地公開了一種使分娩后的產奶量比分娩前泌乳期的產奶量增加的方法。
因此，根據一方面，本發明提供了一種對產奶量無負面影響的縮短泌乳動物泌乳周期期間干奶期長度的方法，其包括對泌乳動物施用治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽。
根據某些實施方案，所述干奶期被縮短至少于50天，優選的是少于約40天，更優選的是在約20天至約30天之間。
根據另一方面，本發明提供了一種使泌乳動物分娩后的產奶量比分娩前泌乳期所達到的產奶量增加的方法，其包括對所述泌乳動物施用有效量的源自酪蛋白的至少一種肽。
在乳畜群中，如所生產的乳品通過用每ml乳液所含的體細胞計數(SCC)進行評價的衛生，對畜群的收益率具有極大的影響，原因是每ml乳液含有高水平細胞的乳品必須廢棄。
根據又一方面，本發明提供一種用于改善泌乳動物乳液衛生的方法，其包括對所述泌乳動物的乳腺施用治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，使得所述乳液中的體細胞計數(SCC)與所述肽施用前的SCC相比減少。根據某些實施方案，所述肽施用后的SCC為約750,000細胞/ml乳液以及更少，優選的是600,000細胞/ml以及更少，更優選的是400,000細胞/ml以及更少，甚至更優選的是300,000細胞/ml乳液，最優選的是200,000細胞/ml乳液以及更少。根據某些實施方案，在施用治療的泌乳周期中SCC減少。根據當前某些優選的實施方案，在施用治療后所施加的干奶期之后的泌乳周期中SCC減少。
乳腺感染和/或擠奶突然停止給動物帶來疼痛并使其產生應激。這種應激不僅使患病的動物生產能力下降，而且對處于高度密集生產系統的動物的一般條件的認知增加也需要改善此類牲畜動物福利的方法。目前，本發明出乎意料地公開了其有可能減少或甚至可能預防遭受與乳腺相關的感染或擠奶突然停止。
根據進一步的方面，本發明提供了一種用于減少牲畜泌乳動物遭受與乳腺相關的感染或擠奶突然停止的方法，其包括對所述泌乳動物的乳腺施用治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，從而改善所述泌乳動物的福利。
根據某些實施方案，改善所述泌乳動物的福利是通過減少所述動物每天的步數和通過延長所述動物每天的躺臥時間來估量的。根據一個實施方案，將源自酪蛋白的至少一種肽施用于受感染的乳腺。根據另一個實施方案，將一種或多種肽施用于未感染的乳腺。
根據某些實施方案，本發明的方法采用了源自酪蛋白的肽——磷酸肽。根據一個實施方案，所述磷酸肽包括氨基酸序列Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu(SEQ ID NO:1)，及其類似物或衍生物。根據另一實施方案，所述磷酸肽選自由來源于β-酪蛋白、αS1-酪蛋白或αS2-酪蛋白的磷酸肽組成的組。根據當前某些優選的實施方案，本發明方法所采用的磷酸肽包括選自由SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:5組成的組的氨基酸序列及其類似物、衍生物或片段。根據當前另外優選的實施方案，本發明方法所采用的磷酸肽由選自SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:5的氨基酸序列及其類似物、衍生物或片段組成。可用單一類型的肽和多種類型的肽。
根據某些實施方案，本發明的方法包括溝內施用源自酪蛋白的至少一種肽。根據當前某些優選的實施方案，所述方法包括施用于泌乳動物乳腺的乳頭溝(teat canal)。施用于乳頭溝可借助于注射或輸注。可將所述至少一種肽施用于一個或多個乳腺，其包括共同施用于所述泌乳動物的所有乳腺。根據另外的實施方案，本發明的方法進一步包括與抗微生物治療共同施用，所述抗微生物治療選自抗生素療法、殺菌劑療法、甾族的和非甾族的抗炎療法、采用免疫調節劑的療法和疫苗接種療法組成的組。
根據一個實施方案，用于縮短泌乳周期的干奶期長度的方法包括在停止擠奶的同時施用源自酪蛋白的所述至少一種肽。包括單次施用和多次施用。通常，所述肽以選自由以下組成的組的間隔施用一次或多次，優選一次至三次：約6小時、約8小時、約12小時、約16小時、約20小時或約24小時。根據當前最優選的一個實施方案，所述至少一種肽僅施用一次。根據另外的實施方案，在預期的分娩前約60天停止擠奶，優選在預期的分娩前約40天，更優選的是在預期的分娩前大約20天至大約30天之間。
根據另一實施方案，用于增加分娩后產奶量和增加隨后泌乳期產奶量的方法包括在停止擠奶的同時施用源自酪蛋白的至少一種肽，其中所述停止擠奶的同時一般是在預期的分娩前約60天，優選的是在分娩前約40天，更優選的是在分娩前約30天。選擇施用所述至少一種肽的給藥步驟并重復該步驟，以便獲得分娩后的產奶量增加。根據某些實施方案，將所述肽以選自由以下組成的組的間隔在至少一個乳腺上施用一次或多次，通常施用一次至三次：約6小時、約8小時、約12小時、約16小時、約20小時或約24小時。根據當前最優選的一個實施方案，所述至少一種肽僅施用一次。根據當前其他優選的實施方案，將所述肽施用于乳房的全部四個乳腺。根據某些實施方案，平均產奶量增加至少約3％，優選增加至少約6％，更優選增加至少約9％，最優選增加約10％至約25％。
根據又一實施方案，乳液衛生的改善是通過在干奶期初期施用源自酪蛋白的至少一種肽而獲得的，所述干奶期初期一般是在預期的分娩前大約60天。選擇施用于乳腺的給藥步驟并重復該步驟，以便減少SCC并獲得所述干奶期隨后泌乳期的乳液衛生的改善。根據當前最優選的一個實施方案，所述至少一種肽僅施用一次。
根據另外的實施方案，用于預防遭受與乳腺相關的感染或擠奶突然停止的方法包括單次施用一種或多種酪蛋白衍生肽。
在本發明所公開的新方法的研究期間，發明人認識到需要包括酪蛋白衍生肽的改良的藥物組合物。
源自酪蛋白的肽通常是酪蛋白的酶促水解消化產物，其因具有營養價值而著稱，因而被用于臨床的營養品、嬰兒的配方食品，并用作食品和飲料富集的蛋白質。酪蛋白水解物也被認為有藥物用途。這樣的制劑常以使用前立即與合適的載體(如無菌水)復原的干燥粉末進行銷售。所獲得的溶液因其具有高營養價值而受到污染，而且其濁度立即妨礙了污染物的鑒定。而且，渾濁的制劑傾向于產生沉淀。
本發明的發明人意外地發現通過約0.1微米至約0.5微米的濾器，優選通過小于0.25微米的濾器來進一步過濾渾濁的酪蛋白制劑可基本上去除酪蛋白膠粒，所述酪蛋白膠粒的存在是產生濁度的主要原因。此外，過濾后的組合物所包括的肽的范圍為約1,000道爾頓至約5,000道爾頓。這種大小范圍包括優選的酪蛋白衍生肽種群——特別是磷酸肽，從而使得所述過濾過程進一步提供了包括基本上均一的、分子量范圍為1,000道爾頓至5,000道爾頓的酪蛋白衍生肽的組合物。
根據又一方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，其中所述組合物為隨時可使用的無菌澄清溶液形式，其基本上無膠粒，且pH高于6.0。根據某些實施方案，所述組合物包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種磷酸肽。根據另外的實施方案，所述一種或多種肽的分子量為約1,000道爾頓至約5,000道爾頓，優選為約2,500道爾頓。
有待理解的是雖然用上述過濾方法獲得了本發明的藥物組合物，但是也可用任何本領域已知的去除約0.25μm以上的物質和/或5,000道爾頓以上的肽的方法來獲得，其中所述方法如超濾、透析等。
根據一個實施方案，源自酪蛋白的磷酸肽包括氨基酸序列Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu(SEQ ID NO:1)及其類似物或衍生物，且分子量范圍為1,000道爾頓至5000道爾頓。根據另外的實施方案，所述藥物組合物包括治療有效量的選自由源自β-酪蛋白的磷酸肽、源自αS1-酪蛋白的磷酸肽、源自αS2-酪蛋白的磷酸肽或其組合組成的組的磷酸肽。根據當前某些優選的實施方案，所述磷酸肽來源于包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的β-酪蛋白及其類似物、衍生物或片段。根據當前其它優選的實施方案，所述磷酸肽來源于包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的αS1-酪蛋白及其類似物、衍生物或片段。仍根據當前其他優選的實施方案，所述磷酸肽來源于選自包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的肽和包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的肽的αS2-酪蛋白，及其類似物、衍生物或片段。根據另外的實施方案，所述藥物組合物包括如上所述的多種源自酪蛋白的肽。根據一個實施方案，所述藥物組合物包括治療有效量的主要由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中任一種所示氨基酸序列組成的肽，或其類似物、衍生物和片段，或其任何組合，其中所述肽的分子量范圍為約1,000道爾頓至約5,000道爾頓。
所述源自酪蛋白的肽可以由酪蛋白水解所得，或者其也可以是合成肽。合成肽的制備對于所屬領域的技術人員是已知的，并如下文所描述。
根據一個實施方案，本發明藥物組合物的蛋白質含量為約10ng/ml至約15mg/ml。此數量在治療應用中是有效的，而且溶液是澄清的。根據一個實施方案，該組合物的濁度小于6個比濁法濁度單位(Nephelometric Turbidity Units)(NTU)。根據另一實施方案，該組合物的pH為約6.0至約8.0。
本發明組合物中的磷酸肽在寬的溫度范圍內相當穩定。根據一個實施方案，所述磷酸肽耐熱，從而使得將包括該肽的組合物加熱至50℃至70℃10-15min時，未觀察到活性喪失。根據另一實施方案，所述磷酸肽抗冷凍，從而使得該組合物在－20℃可保存至少6個月，優選至少12個月。
根據另一方面，本發明提供了冷凍干燥粉末形式的藥物組合物，其包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，其中所述粉末在使用前于液體中復原形成基本上無膠粒且pH值高于6.0的澄清溶液。
應理解的是，本發明所述包括至少一種酪蛋白衍生肽尤其是酪蛋白衍生的磷酸肽的新型藥物組合物為無菌澄清溶液形式，其適用于上文描述的牲畜管理新方法。可選地，這些藥物組合物還可用于上文背景部分所述且為本領域已知的此類多肽的任何用途。
根據另外的方面，本發明提供了一種用于治療泌乳動物乳腺的藥物組合物，其包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，其中所述組合物為隨時可使用的無菌澄清溶液形式，其基本上無膠粒，且pH值高于6.0。根據某些實施方案，該組合物包括治療有效量的源自酪蛋白的磷酸肽。根據另外的實施方案，所述藥物組合物所包括的磷酸肽的平均分子量為約1,000道爾頓至約5,000道爾頓。根據當前某些優選的實施方案，平均分子量為約2,500道爾頓。
本發明的新型藥物組合物在治療任何泌乳動物的乳腺中意想不到地有效，其中所述泌乳動物包括人類；經養殖用于產奶或肉用的牲畜，包括奶牛、山羊、綿羊和水牛；其他的牲畜動物，包括駱駝、駝羊(llamas)、馬和豬；以及寵物，包括貓和狗。
根據某些實施方案，所述治療選自由誘導暫時性產乳停止、誘導持續性產乳停止或誘導退化組成的組。有利的是，本發明的藥物組合物可在大約3天內誘導退化，而對臨近下一次泌乳期的乳腺組織的復原不產生負面影響。而且，可在泌乳周期的任意階段(包括泌乳高峰)誘導退化。
根據另一方面，本發明的新型藥物組合物可用于預防、治療微生物感染和逆轉微生物感染。
該組合物對范圍廣泛的病原體所引起的感染均有療效，其中所述病原體包括，但不限于革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌、真菌、支原體以及病毒。根據一個實施方案，本發明的組合物對于引起乳腺炎的微生物感染有療效。因此，本發明所提供的藥物組合物減少了對治療感染(包括乳腺感染)的抗生素的依賴性，緩解了在乳腺炎的情況中，抗生素耐受感染的問題和抗生素在乳液內存在殘留的問題。可選地，本發明的藥物組合物可與其他的抗微生物治療結合施用。根據一個實施方案，本發明的藥物組合物與抗微生物劑結合施用，所述抗微生物劑選自由抗生素、殺菌劑、甾族的抗炎劑和非甾族的抗炎劑組成的組。聯合治療可減少上述藥劑所需的劑量，和/或增強其治療效果。根據另一實施方案，所述藥物組合物與疫苗聯合用藥。根據又一實施方案，所述藥物組合物與免疫調節劑聯合用藥。
除在泌乳期有效治療乳腺炎外，本發明的新型藥物組合物在誘導干奶期的同時進行給藥，成功地克服了乳腺炎感染從一個泌乳周期延續到下一泌乳周期的問題。
本發明的新型藥物組合物通常配制成腸胃外給藥。根據一個實施方案，所述藥物組合物配制成溝內給藥，如通過輸注或通過注射。根據當前一個優選的實施方案，所述藥物組合物被配制成經泌乳動物乳腺的乳頭溝(teat canal)注射進入乳腺池(gland cistern)。該藥物組合物還可配制成凝膠、軟膏劑、乳膏、乳劑或持續釋放劑型(如透皮貼劑)而局部施用于胸部或乳房。可選地，本發明的藥物組合物被配制為全身口服施用。
根據另外的方面，本發明提供了一種用于選自由牙科用途和治療用途組成的組但不限于其的用途的藥物組合物，其包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，其中所述組合物為隨時可使用的無菌澄清溶液形式，其基本上無膠粒，且pH值高于6.0。例如，除了別的以外，美國專利第5,227,154、5,834,427和6,652,875號；歐洲專利申請第EP 1375513號；國際PCT申請WO 01/13739和WO 2005/081628以及美國專利申請公布文本20020147144和20040167073公開了這些已知的用途。
根據又一方面，本發明提供了一種用于治療泌乳動物乳腺的方法，其包括對所述泌乳動物施用藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，其中所述組合物為隨時可使用的無菌澄清溶液形式，其基本上無膠粒，且pH值高于6.0。
根據一個實施方案，所述治療選自由誘導暫時性產乳停止、誘導持續性產乳停止和誘導退化組成的組。
根據另一方面，本發明提供了用于治療和抑制微生物感染的方法。
根據某些實施方案，所述感染為乳腺炎，其包括臨床型乳腺炎和亞臨床型乳腺炎，并且所述組合物施用于泌乳動物受感染的乳腺。根據一個實施方案，在泌乳期施用所述藥物組合物來治療擠奶期間的乳腺炎。根據另一實施方案，所述藥物組合物在泌乳周期末或干奶期期間施用。在干奶期開始或在干奶期過程中的施用包括施用于受感染的乳腺以治療現有的乳腺炎，以及作為預防治療用于治療未感染的乳腺。
泌乳動物的所有乳腺同時停止擠奶通常導致不期望的炎癥反應。目前，本發明意想不到地顯示了同時對泌乳動物的所有乳腺施用本發明的藥物組合物并未伴有任何不良反應。因此，有可能在個體動物的任何期望數目的乳腺中誘導產奶停止和誘導退化并治療乳腺炎。根據本發明的施用包括僅施用于一個乳腺至施用于所有乳腺，如奶牛乳房的全部四個乳腺。
本發明的藥物組合物的施用方案視預期效果和所治療的動物而定。包括單次施用和多次施用。根據某些實施方案，對于治療乳腺炎而言，所述肽可以選自由以下組成的組的間隔施用一次或多次，優選1次至3次：約6小時、約8小時、約12小時、約16小時、約20小時或約24小時。根據其他實施方案，對于誘導產奶停止和誘導退化而言，所述肽作為單次治療施用。單次用藥的治療方案因為增加了治療的依從性而倍受歡迎。
根據另外的方面，本發明提供了一種調節受治療者免疫反應的方法，其包括對泌乳動物施用藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，其中所述組合物為隨時可使用的無菌澄清溶液形式，其基本上無膠粒，且pH值高于6.0。
根據一個實施方案，調節免疫反應包括刺激和增強天然的免疫反應。
本申請提供了以下內容：
項目1.一種對產奶量無負面影響的縮短泌乳動物泌乳周期期間干奶期長度的方法，其包括對泌乳動物施用治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽。
項目2.如項目1所述的方法，其中所述干奶期的長度被縮短至少于50天。
項目3.如項目2所述的方法，其中所述干奶期的長度被縮短至約20天至約30天之間。
項目4.如項目1所述的方法，其中所述至少一種肽為磷酸肽。
項目5.如項目4所述的藥物組合物，其中所述磷酸肽包括氨基酸序列Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu(SEQ.ID NO:1)。
項目6.如項目4所述的方法，其中所述磷酸肽來源于酪蛋白亞型，所述酪蛋白亞型選自由β-酪蛋白、αS1-酪蛋白和αS2-酪蛋白組成的組。
項目7.如項目6所述的方法，其中所述磷酸肽來源于包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的β-酪蛋白及其類似物、衍生物或片段。
項目8.如項目6所述的方法，其中所述磷酸肽來源于包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的αS1-酪蛋白及其片段、類似物或衍生物。
項目9.如項目6所述的方法，其中所述磷酸肽來源于選自由包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的肽和包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的肽組成的組的αS2-酪蛋白，及其類似物、衍生物以及片段。
項目10.如項目1所述的方法，其中源自酪蛋白的所述至少一種肽是由酪蛋白水解所得。
項目11.如項目1所述的方法，其中源自酪蛋白的所述至少一種肽是合成肽。
項目12.如項目1所述的方法，其中將所述至少一種肽施用在所述泌乳動物的至少一個乳腺上。
項目13.如項目12所述的方法，其中將所述至少一種肽施用于乳腺的乳頭溝。
項目14.如項目1所述的方法，其中所述肽在停止擠奶的同時施用。
項目15.如項目1所述的方法，其中所述肽以約6小時至約24小時的間隔施用一次至五次。
項目16.如項目1所述的方法，其中所述肽僅施用一次。
項目17.一種使牲畜泌乳動物分娩后的產奶量比所述泌乳動物分娩前的產奶量增加的方法，其包括對所述泌乳動物施用治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽。
項目18.如項目17所述的方法，其中在分娩后最初100天平均產奶量增加至少約3％。
項目19.如項目17所述的方法，其中所述分娩是在干奶期后。
項目20.如項目17所述的方法，其中所述至少一種肽為磷酸肽。
項目21.如項目20所述的藥物組合物，其中所述磷酸肽包括氨基酸序列Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu(SEQ ID NO:1)。
項目22.如項目20所述的方法，其中所述磷酸肽來源于酪蛋白亞型，所述酪蛋白亞型選自由β-酪蛋白、αS1-酪蛋白和αS2-酪蛋白組成的組。
項目23.如項目22所述的方法，其中所述磷酸肽來源于包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的β-酪蛋白及其類似物、衍生物或片段。
項目24.如項目22所述的方法，其中所述磷酸肽來源于包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的αS1-酪蛋白及其類似物、衍生物或片段。
項目25.如項目22所述的方法，其中所述磷酸肽來源于選自由包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的肽和包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的肽組成的組的αS2-酪蛋白，及其類似物、衍生物或片段。
項目26.如項目17所述的方法，其中源自酪蛋白的所述至少一種肽是由酪蛋白水解所得。
項目27.如項目17所述的方法，其中源自酪蛋白的所述至少一種肽是合成肽。
項目28.如項目17所述的方法，其中將所述肽施用在所述泌乳動物的至少一個乳腺上。
項目29.如項目28所述的方法，其中將所述至少一種肽施用于乳腺的乳頭溝。
項目30.如項目17所述的方法，其中所述肽在停止擠奶的同時施用。
項目31.如項目17所述的方法，其中所述肽以約6小時至約24小時的間隔施用一次至五次。
項目32.如項目17所述的方法，其中所述肽僅施用一次。
項目33.一種用于改善泌乳動物乳液衛生的方法，其包括對所述泌乳動物的乳腺施用治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，使得所述乳液中的體細胞計數與所述肽施用前的SCC相比減少。
項目34.如項目33所述的方法，其中所述乳液中的所述體細胞計數少于400,000細胞/ml。
項目35.如項目33所述的方法，其中所述至少一種肽為磷酸肽。
項目36.如項目35所述的方法，其中所述磷酸肽包括氨基酸序列Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu(SEQ ID NO:1)。
項目37.如項目33所述的方法，其中所述磷酸肽來源于酪蛋白亞型，所述酪蛋白亞型選自由β-酪蛋白、αS1-酪蛋白和αS2-酪蛋白組成的組。
項目38.如項目37所述的方法，其中所述磷酸肽來源于包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的β-酪蛋白及其類似物、衍生物或片段。
項目39.如項目37所述的方法，其中所述磷酸肽來源于包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的αS1-酪蛋白及其類似物、衍生物或片段。
項目40.如項目37所述的方法，其中所述磷酸肽來源于選自由包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的肽和包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的肽組成的組的αS2-酪蛋白，及其類似物、衍生物或片段。
項目41.如項目33所述的方法，其中源自酪蛋白的所述至少一種肽是由酪蛋白水解所得。
項目42.如項目33所述的方法，其中源自酪蛋白的所述至少一種肽是合成肽。
項目43.如項目33所述的方法，其中將所述肽施用在所述泌乳動物的至少一個乳腺上。
項目44.如項目33所述的方法，其中將所述至少一種肽施用于乳腺的乳頭溝。
項目45.如項目33所述的方法，其中所述肽在停止擠奶的同時施用。
項目46.如項目33所述的方法，其中所述肽以約6小時至約24小時的間隔施用一次至五次。
項目47.如項目33所述的方法，其中所述肽僅施用一次。
項目48.一種用于預防牲畜泌乳動物遭受與乳腺相關的感染或擠奶突然停止的方法，其包括對所述泌乳動物的乳腺施用治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，從而改善所述泌乳動物的福利。
項目49.如項目48所述的方法，其中改善所述泌乳動物的福利是通過減少所述動物每天的步數和通過延長所述動物每天的躺臥時間來估量的。
項目50.如項目48所述的方法，其中所述至少一種肽為磷酸肽。
項目51.如項目50所述的方法，其中所述磷酸肽包括氨基酸序列Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu(SEQ ID NO:1)。
項目52.如項目50所述的方法，其中所述磷酸肽來源于酪蛋白亞型，所述酪蛋白亞型選自由β-酪蛋白、αS1-酪蛋白和αS2-酪蛋白組成的組。
項目53.如項目52所述的方法，其中所述磷酸肽來源于包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的β-酪蛋白及其類似物、衍生物或片段。
項目54.如項目52所述的方法，其中所述磷酸肽來源于包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的αS1-酪蛋白及其類似物、衍生物或片段。
項目55.如項目52所述的方法，其中所述磷酸肽來源于選自由包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的肽和包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的肽組成的組的αS2-酪蛋白，及其類似物、衍生物或片段。
項目56.如項目48所述的方法，其中源自酪蛋白的所述至少一種肽是由酪蛋白水解所得。
項目57.如項目48所述的方法，其中源自酪蛋白的所述至少一種肽是合成肽。
項目58.如項目48所述的方法，其中將所述肽施用在所述泌乳動物的至少一個乳腺上。
項目59.如項目58所述的方法，其中將所述肽施用于選自由感染的乳腺和未感染的乳腺組成的組的乳腺。
項目60.如項目58所述的方法，其中將所述至少一種肽施用于乳腺的乳頭溝。
項目61.如項目48所述的方法，其中所述肽在停止擠奶的同時施用。
項目62.如項目48所述的方法，其中所述肽以約6小時至約24小時的間隔施用一次至五次。
項目63.如項目48所述的方法，其中所述肽僅施用一次。
項目64.一種藥物組合物，其包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，其中所述組合物為隨時可使用的無菌澄清溶液形式，其基本上無膠粒，且pH高于6.0。
項目65.如項目64所述的藥物組合物，其中所述至少一種肽的分子量為約1,000道爾頓至約5,000道爾頓。
項目66.如項目65所述的藥物組合物，其中所述至少一種肽為磷酸肽。
項目67.如項目66所述的藥物組合物，其中所述磷酸肽包括氨基酸序列Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu(SEQ ID NO:1)。
項目68.如項目66所述的藥物組合物，其中所述磷酸肽來源于酪蛋白亞型，所述酪蛋白亞型選自由β-酪蛋白、αS1-酪蛋白和αS2-酪蛋白組成的組。
項目69.如項目68所述的藥物組合物，其中所述磷酸肽來源于包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的β-酪蛋白及其片段、類似物或衍生物。
項目70.如項目68所述的藥物組合物，其中所述磷酸肽來源于包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的αS1-酪蛋白及其片段、類似物或衍生物。
項目71.如項目68所述的藥物組合物，其中所述磷酸肽來源于選自由包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的肽和包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的肽組成的組的αS2-酪蛋白，及其片段、類似物或衍生物。
項目72.如項目64所述的藥物組合物，其中源自酪蛋白的所述至少一種肽是由酪蛋白水解所得。
項目73.如項目64所述的藥物組合物，其中源自酪蛋白的所述至少一種肽是合成肽。
項目74.如項目64所述的藥物組合物，其包括治療有效量的平均分子量為約1,000道爾頓至約5,000道爾頓的多種肽。
項目75.如項目64所述的藥物組合物，其包括治療有效量的主要由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中任一種所示氨基酸序列組成的肽，及其衍生物、片段或類似物，或其任一組合，其中所述肽的分子量為約1,000道爾頓至5,000道爾頓。
項目76.如項目64所述的藥物組合物，其濁值小于6個比濁法濁度單位(NTU)。
項目77.如項目64所述的藥物組合物，其包括約10ng/ml至約15mg/ml的所述至少一種肽。
項目78.如項目64所述的藥物組合物，其中所述組合物的pH值范圍為約6.0至約8.0。
項目79.如項目64所述的藥物組合物，其中當所述組合物加熱至50℃至70℃時，所述至少一種肽是穩定的。
項目80.如項目64所述的藥物組合物，其中當所述組合物冷凍時，所述至少一種肽是穩定的。
項目81.一種冷凍干燥粉末形式的藥物組合物，其包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，其中所述粉末在使用前于液體中復原形成基本上無膠粒且pH值高于6.0的澄清溶液。
項目82.一種用于治療乳腺的方法，其包括對泌乳動物施用藥物組合物，所述藥物組合物包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，其中所述組合物為隨時可使用的無菌澄清溶液形式，其基本上無膠粒，且pH高于6.0。
項目83.如項目82所述的方法，其中治療所述乳腺選自由誘導暫時性產乳停止、誘導持續性產乳停止和誘導退化組成的組。
項目84.一種用于預防、治療和逆轉微生物感染的方法，其包括對泌乳動物施用藥物組合物，所述藥物組合物包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，其中所述組合物為隨時可使用的無菌澄清溶液，其基本上無膠粒，且pH高于6.0。
項目85.如項目84所述的方法，其中所述感染為乳腺炎，并且其中所述組合物施用于所述泌乳動物的受感染的乳腺。
項目86.如項目85所述的方法，其中所述藥物組合物在選自由以下組成的組的時期施用：泌乳期、擠奶停止后的干奶期初期，以及干奶期。
項目87.如項目85所述的方法，其中所述藥物組合物與其他的抗微生物治療結合施用，所述抗微生物治療選自抗生素療法、殺菌劑療法、甾族的和非甾族的抗炎療法、采用免疫調節劑的療法和疫苗接種療法組成的組。
項目88.如項目85所述的方法，其中將所述藥物組合物施用在所述泌乳動物的至少一個乳腺上。
項目89.如項目88所述的方法，其中將所述藥物組合物施用在所述泌乳動物的所有乳腺上。
項目90.如項目88所述的方法，其中所述泌乳動物選自奶牛、山羊、綿羊、水牛、駱駝、驢、駝羊、馬、豬、貓和狗組成的組。
項目91.如項目88所述的方法，其中所述泌乳動物為人類。
根據以下的說明和附圖，本發明的其它目的、特征及優點將變得清楚。
附圖說明
圖1顯示施用酪蛋白水解物后編號2425的奶牛產奶量與先前泌乳期相比的增加。
圖2顯示施用酪蛋白水解物后編號2331的奶牛產奶量與先前泌乳期相比的增加。
圖3顯示干奶后的前七天與泌乳(泌乳)的最后三天期間10只接受治療的奶牛(突然停止擠奶+抗生素干奶治療+酪蛋白水解產物治療)與10只以常規方式干奶的對照奶牛(突然停止擠奶+抗生素干奶治療)的乳房壓力指數。干奶期后治療組間差異在P<0.01時達統計學意義。
圖4顯示產奶量大于30L的2只奶牛治療后第4天的乳房。圖4A——使用C治療的奶牛(突然停止擠奶+抗生素干奶治療)，圖4B——使用C+N治療的奶牛(突然停止擠奶+酪蛋白水解產物+抗生素干奶治療)。
圖5顯示干奶后的前七天與泌乳(泌乳)的最后三天期間接受治療的10只奶牛(C+N——突然停止擠奶+抗生素干奶治療+酪蛋白水解產物治療)與以常規方式干奶的10只對照奶牛(C——突然停止擠奶+抗生素干奶治療)的步數與躺臥持續時間的平均累積比例。干奶期后治療組間差異在P<0.005時達統計學意義。
發明詳述
在更詳細地解釋本發明的至少一個實施方案之前，應理解的是本發明并不限于其在以下說明書中提出的詳細應用或者限于其經由實施例舉例說明的應用。本發明可以具有其他的實施方案或者能夠用不同方式實施或進行。此外，應理解的是本發明所采用的短語和術語用于說明的目的，而不應認為進行限制。
定義
如本發明所使用的術語“酪蛋白”是指人類和非人類哺乳動物乳液中的主要蛋白質，其包括αS1、αS2、β以及κ亞型。
如本發明所使用的術語αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白和β-酪蛋白是指哺乳動物的蛋白質αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白和β-酪蛋白，所述哺乳動物包括，但不限于牲畜哺乳動物(如奶牛、綿羊、山羊、母馬、駱駝、鹿和水牛)、人類及海洋哺乳動物。
說明書通篇所使用的術語“肽”是指氨基酸殘基通過肽鍵彼此連接的線性排列。根據本發明原理的肽不是完整的蛋白質。
如本發明所使用的術語“磷酸肽”是指接合的肽形式的磷酸化肽，其中非肽部分是磷酸殘基。特別的是，所表達的“酪蛋白磷酸肽”或“CPP”是指包括酪蛋白片段的磷酸肽。
如本發明所使用的術語“產乳停止”是指暫時性產乳停止和持續性產乳停止。暫時性產乳停止指可逆性的停止。持續性停止是指只能通過妊娠后分娩和通過性激素治療逆轉的泌乳中斷。根據本發明的教導，機械刺激(即擠奶)也可逆轉由本發明的組合物和方法誘導的持續性產乳停止。
如本發明所使用的術語“干奶期”是指分娩前停止擠奶的時期。根據本實踐，施用干奶期對于完成退化過程是必須的，在此之后臨近分娩時恢復泌乳能力。當前，干奶期的長度在50天至70天之間。目前，本發明意想不到地顯示了可將干奶期縮短至少于約50天，優選少于約40天，更優選在約20天至約30天之間，而對產奶量無負面影響。本發明意想不到地顯示了應用酪蛋白衍生肽以施加干奶期使得干奶期后的泌乳期產奶量顯著增加。
如本發明所使用的術語“乳腺炎”是指乳腺或乳房的炎癥，其由物理損傷、化學制品的引入、病毒、真菌、寄生蟲引起，或者最常見的是由細菌侵入及其毒素引起。“乳腺炎”用來描述所有類型的這樣的炎癥，其包括臨床型乳腺炎和亞臨床型乳腺炎，其中臨床型乳腺炎包括輕度、重度及慢性乳腺炎。
在亞臨床型乳腺炎中，既未檢測到乳腺或乳房腫脹也未觀察到乳液異常。但是，諸如基于評價體細胞計數的加州乳腺炎試驗(CMT)和威斯康新州乳腺炎試驗(WMT)的特異性的篩選試驗和過氧化氫酶試驗顯示了乳液成分的變化。這種類型的乳腺炎通常稱為“隱性”。
臨床型乳腺炎可以是輕度或急性的，其特點是乳液中存在白細胞。輕度臨床型乳腺炎涉及到乳液外觀的變化，包括存在絮狀物或凝塊、水樣奶或其他不尋常的乳液形式。輕度的臨床型乳腺炎可能伴有其他的癥狀，包括乳房或乳腺發熱、敏感或腫脹。
重度臨床型乳腺炎包括對泌乳動物而言相當痛苦的乳房或乳腺發熱、敏感、堅硬。重度臨床型乳腺炎發病迅速，從而使得泌乳動物患病，并表現出發熱、脈搏加快、抑郁、虛弱和食欲缺乏的體征。當動物的整個泌乳系統受到影響時，該情況稱為急性全身性乳腺炎。該嚴重的癥狀還可能伴隨有產乳停止。
慢性乳腺炎是指持續性乳房感染，其通常為亞臨床型乳腺炎形式，所述慢性乳腺炎偶爾可以發展為臨床型乳腺炎而后再演變為亞臨床型。慢性乳腺炎以因細菌定居和結締組織形成而產生的乳腺內硬塊為特征。
如本發明所使用的術語“奶牛的干奶治療”或“干奶治療”是指為了消除、治療和急性診斷在泌乳期結束時的乳腺炎炎癥，在泌乳期的最后一次擠奶后立即在乳房內實施的治療。
如本發明所使用的術語“奶牛的干奶防止/預防治療”是指為了預防干奶期期間的乳腺炎炎癥，在泌乳期最后一次擠奶后立即實施的乳房內治療，以及為了預防下一次泌乳期期間的乳腺炎，在分娩后立即實施的乳房內治療。
如本發明所使用的術語“牲畜福利”或“農場動物福利”是指預防遭受并增加存在的積極感受(一般稱為舒適度或愉悅)，其中所述積極感受除了別的以外，是由增加躺臥期、增加反芻時間、減少代謝需要、減少乳房壓力和/或乳頭滲奶、減少乳腺炎和其他疾病的發生率和減少因產奶過多帶來的跛行效應所引起的。
如本發明所使用的術語“澄清藥物組合物”和/或“澄清溶液”是指濁值小于6個NTU的液體溶液。如本發明所使用的濁度是指光線通過水柱時因懸浮的有機顆粒和無機顆粒發生散射，測量散射程度的量化單位。光線散射隨懸浮物增多而增強。濁度常用比濁法濁度單位來代替杰克森濁度單位(jackson turbidity unit)(JTU)進行測量。濁度測定法將參考溶液散射的光線和樣品散射的光線進行比較。
如本發明所使用的術語“膠粒(micelle)”或“膠粒(micelles)”是指組成膠質顆粒的分子聚集物，尤其指主要包括蛋白質、鈣和磷酸鹽的酪蛋白膠粒。這些膠粒還包括檸檬酸鹽、少量離子、脂酶、纖溶酶以及包埋的乳清。酪蛋白膠粒具有相當多孔的結構，其占乳液總體積份數的大約6％至12％。酪蛋白膠粒直徑范圍為90nm至150nm。來自電子顯微鏡及其他方法的證據表明膠粒由直徑為10nm至20nm的更小的單元(稱為亞膠粒)組成。
如本發明所使用的術語“無菌”是指溶液不含病原體，如同所屬領域的技術人員已知的常規無菌技術所測定的，也不含內毒素，其中根據鱟阿米巴樣細胞溶解物(LAL)試驗，終產物中內毒素水平少于0.5EU/ml。
如本發明所使用的術語“平均分子量”是指通過本領域技術人員已知的方法測定的蛋白質或肽的分子量平均值加或減標準差。這些方法包括，例如SDS凝膠電泳和在諸如HPLC的儀器上進行的分子排阻色譜，其中將樣品與已知分子量的標準品一起進行比較跑柱(run)。
本發明藥物組合物中的肽優選的平均分子量為約1,000道爾頓至約5,000道爾頓。因此，本發明特別考慮了總共具有10個至50個氨基酸殘基的肽。本發明還考慮了其中將核基序序列(如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列)人工嵌入多肽序列(如通過DNA重組技術或通過化學合成制備的肽)內的肽。所述肽可通過酪蛋白水解產生肽的混合物而獲得。根據本發明的教導，可以使用肽的混合物，或者可利用任何本領域已知的蛋白質純化方法來進一步純化該混合物而得到分離的肽。
本發明藥物組合物中的肽還可利用本領域公知的方法進行合成，所述方法包括DNA重組技術和化學合成。所述合成可以在溶液中進行或如Merrifield所述通過固相肽合成進行(參見J.Am.Chem.Soc.,85:2149,1964)。絲氨酸殘基的磷酸化可以通過如本領域已知的任何方法進行，除了別的以外，如在例如Meggio等,1991.FEBS Lett.283(2):303-306和Perich JW 1997.Method Enzymol.289:245-246中所描述的。
一般而言，肽合成方法包括在生長的肽鏈上依序加上一個或多個氨基酸，或加上受適當保護的或衍生的氨基酸。通常第一個氨基酸的氨基或羧基被合適的保護基團保護。受保護或衍生的氨基酸隨后可以連接在惰性的固體載體上，或者在適合形成酰胺鍵的條件下，通過在具有受適當保護的互補(氨基或羧基)基團的序列中添加下一個氨基酸而在溶液里應用。然后將保護基團從這種新加上的氨基酸殘基上移除，隨后添加下一個氨基酸(受適當保護的)，如此類推。按慣例此過程也包括洗滌步驟。當所有期望的氨基酸以合適的次序連接后，將保護基團(以及任何固體載體)依次或同時移除得到最終的肽。通過這種常規步驟的簡單修飾，有可能同時將超過一個的氨基酸添加到生長鏈上，如，在脫保護后通過將受保護的三肽與受適當保護的二肽進行偶聯(在不形成外消旋手性中心的條件下)形成五肽，如此類推。
本發明公開了用于綜合管理牲畜泌乳動物畜群的方法，該方法利用了酪蛋白衍生肽。
根據一方面，本發明提供了一種通過對泌乳牲畜動物施用有效量的源自酪蛋白的至少一種肽來縮短泌乳周期間的干奶期長度而對產奶量無負面影響的方法。
在現代的乳品加工行業，泌乳動物一年分娩一次，因而使得動物懷孕時可繼續進行擠奶。為了在臨近下一泌乳期時使乳房組織恢復，常在分娩前采取對泌乳動物施加干奶期的措施來誘導乳腺的退化過程。除了別的以外，誘導干奶期是保持分娩前后產乳量相近所必需的。奶牛在其通過停止擠奶而進行誘導后的第21天至30天完成了天然的退化過程。由于干奶期少于40天導致隨后的泌乳期產奶量下降10％至30％，因此，50天至70天的干奶期成為了行業標準。最近發現干奶期為30天的奶牛的產奶量也并未減少，但是其僅僅是對于施用可能帶來不希望的副作用的牛生長激素的經產奶牛而言(Annen等,ibid)。本發明的發明人之一與其合作者以前曾發現泌乳山羊和泌乳奶牛的退化過程的長度可縮短至約3天。本發明目前出乎意料地顯示了有可能在3天內誘導泌乳奶牛乳房全部四個乳腺的退化。
本發明目前公開了施用酪蛋白衍生肽不僅有效誘導迅速退化，而且在對產奶量無負面影響下將干奶期有效縮短至少于50天，優選少于約40天，更優選在約20天至約30天之間。現代奶牛雖然每天仍能產奶20升至40升，但其通常也會變干。因此，縮短干奶期具有重要的經濟價值。而且，本發明目前證實了通過本發明的方法——即通過對泌乳動物施用源自酪蛋白的至少一種肽而不是通過停止擠奶啟動泌乳動物的干奶期，可使干奶期后的泌乳期期間產奶量增加。盡管不希望受到具體的機制束縛，但是這種產奶量的增加可能與以下因素有關：(a)SCC的減少及其對產奶量的負面效應；和/或(b)由施用源自酪蛋白的至少一種肽所誘導的更大范圍的細胞凋亡，造成了更廣泛的乳房上皮細胞群置換為新的細胞。
根據另一方面，本發明提供了一種用于改善泌乳牲畜動物乳液衛生的方法，其包括對所述泌乳動物的乳腺施用治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽。
如本發明所使用的術語“乳液衛生”是指每ml乳液中的體細胞計數(SCC)。“改善乳液衛生”是指將SCC減少至等于或小于750,000細胞/ml乳液，優選等于或小于600,000細胞/ml乳液，更優選等于或小于400,000細胞/ml乳液，甚至更優選等于或小于300,000細胞/ml乳液，最優選等于或小于200,000細胞/ml乳液。現代乳業的一個典型現象是從泌乳動物特別是奶牛獲得高的產奶量，即使是患有亞臨床型乳房感染的奶牛亦如此。這樣的奶牛通常產奶量高，然而，一個或多個乳腺的感染使乳液中SCC升高到可以導致整個集液罐內總計數都升高的水平，從而降低關于農場水平的乳品等級。泌乳期內進行乳房內抗生素治療可治療細菌感染，但是，其與治療前的水平相比不能夠降低四分之一或者使奶牛SCC減少(Cattell等,2001.J.Dairy Sci.84:2036-2043)。本發明目前表明施用酪蛋白衍生肽導致SCC顯著降低。更意外的是，本發明目前公開了一次性施用至少一種酪蛋白衍生肽足夠達到這種降低SCC的效果。依據本發明的教導，為了使治療僅僅局限于感染乳腺，將酪蛋白衍生肽局部施用于受感染乳腺的乳頭溝。肽在受感染乳腺的局部活性允許從其他未感染乳腺繼續擠奶。因為乳腺感染通常是唯一可能提高SCC的因素，故治療后乳液衛生立即得以迅速改善。本發明目前顯示施用源自酪蛋白的至少一種肽有效減少了亞臨床型感染奶牛的SCC，并且對臨床型感染奶牛也有一定程度的改善。因為治療作用可以局限于感染乳腺，所以無需廢棄未感染乳腺的牛奶，即可立即改善乳液質量。這是重要的，因為廢棄患有臨床型乳腺炎的奶牛的乳液是造成經濟損失的主要原因之一(DeGraves和Fetrow,1993.Vet.Clin.Noth Am.Food Animal Pract.9:421-434)。可以施用于泌乳奶牛的一個乳腺和所有乳腺，例如，施用于泌乳奶牛的全部四個乳腺。意外的是，在下一泌乳周期中由受治療乳腺獲得的乳液包括較低的體細胞計數。根據某些實施方案，在干奶期對泌乳動物的一個或多個乳腺施用酪蛋白衍生肽可以改善下一泌乳期的乳液衛生。
可用源自酪蛋白的一種類型的肽或源自酪蛋白的多種類型的肽來實施本發明的方法。根據某些實施方案，用下文描述的本發明隨時可使用的澄清藥物組合物來實施本發明的方法。
根據某些另外的實施方案，所述源自酪蛋白的肽包括磷酸肽。根據另外的實施方案，所述磷酸肽包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。根據另一實施方案，所述磷酸肽選自由源自β-酪蛋白的磷酸肽、源自αS1-酪蛋白的磷酸肽和源自αS2-酪蛋白的磷酸肽組成的組。根據當前某些優選的實施方案，本發明方法所采用的磷酸肽包括選自由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5組成的組的氨基酸序列，及其類似物、衍生物以及片段；其中這些術語如本發明所定義。可用來源于酪蛋白水解的肽來實施本發明的方法，其中所述肽如未純化的酪蛋白水解產物、純化的酪蛋白水解產物和從酪蛋白水解產物純化得到的肽。此外，可用源自酪蛋白的合成肽來實施本發明的方法。所述酪蛋白衍生肽可以摻入藥物組合物中。
根據又一方面，本發明提供了一種預防牲畜泌乳動物遭受與乳腺相關的感染和擠奶突然停止的方法，其包括對所述泌乳動物乳腺施用治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，從而改善所述泌乳動物的福利。
根據某些實施方案，改善所述泌乳動物的福利是通過減少所述動物每天的步數和通過延長所述動物每天的躺臥時間來估量的。根據一個實施方案，將源自酪蛋白的所述至少一種肽施用于受感染的乳腺。根據另一個實施方案，將所述至少一種肽施用于未感染的乳腺。
本發明進一步意想不到地公開了通過0.1μm至約0.5μm的濾器，優選通過小于0.25μm的濾器來過濾渾濁的包括酪蛋白衍生肽的組合物得到了高度符合藥物用途的澄清溶液。
根據另外的方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，其中所述組合物為隨時可使用的無菌澄清溶液形式，其基本上無膠粒，且pH值高于6.0。根據一個實施方案，所述藥物組合物進一步包括藥學上可接受的稀釋劑、賦形劑或載體。根據某些實施方案，所述組合物包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種磷酸肽。根據另外的實施方案，所述藥物組合物包括平均分子量為約1,000道爾頓至約5,000道爾頓的磷酸肽。根據當前某些優選的實施方案，本發明新型藥物組合物中肽的平均分子量為約2,500道爾頓。
如本發明所使用的短語“源自酪蛋白的肽”是指為酪蛋白切割產物的肽(此處指源自天然酪蛋白的肽)；對應于酪蛋白單元的氨基酸序列進行化學合成的合成肽(此處指源自酪蛋白的合成肽)；以及與酪蛋白相似的肽(同源的)，例如，特征為具有一個或多個氨基酸置換、插入或缺失(如，但不限于可允許的置換)的肽，前提是其保留至少70％，優選保留至少80％，更優選保留至少90％的相似性，及其功能性同源物。如本發明所使用的術語“同源物”和“功能性同源物”是指具有不影響此處所描述的肽生物活性的任何插入、缺失和置換的肽。
如本發明所使用的短語“其組合”定義為上述源自α-酪蛋白或β-酪蛋白的肽中任意一種與源自α-酪蛋白或β-酪蛋白的肽中一種或多種其他不同的肽組合成的混合物。如本發明所使用的術語“混合物”定義為彼此以可變比例存在的肽的非共價組合。
根據某些實施方案，所述源自酪蛋白的肽是指包括活性基序Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu(SEQ.ID NO:1)的磷酸肽。應理解的是，包括這種基序的任何的肽均包括在本發明的范圍內，其中無論這種基序是來源于酪蛋白或來源于除了酪蛋白之外的通過重組技術合成或生產的蛋白，均保留了如此處所描述的肽的生物活性。本發明的磷酸肽通過具有SEQ ID Nos.2至5任一所示的氨基酸序列的肽舉例說明(見下表)：
本發明還包括藥物組合物，所述藥物組合物包括以上列出的肽的類似物、衍生物或片段，只要所述類似物、衍生物和片段保留它們如此處所述的生物活性即可，所述藥物組合物為此處所定義的澄清溶液形式，并且所述肽的類似物、衍生物和片段的分子量為約1,000道爾頓至約5,000道爾頓。
術語“類似物”包括任何的肽，所述肽包括通過對本發明的肽進行氨基酸置換、添加、缺失或化學修飾而改變的序列，并且所述肽保留了肽的生物活性。“氨基酸置換”是指將序列內的氨基酸殘基置換為功能相同的殘基而不造成變化。例如，可以將序列內的一種或多種氨基酸殘基置換為另一種極性相似的起相同功能的氨基酸，而不產生變化。序列內氨基酸的置換物可以選自該氨基酸所屬類別的其他成員。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性為中性的氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。這類置換稱為保守置換。另外，可以在氨基酸中進行不影響肽生物活性的非保守置換。應理解的是本發明包括肽類似物，在該肽類似物中至少一個氨基酸被置換為另一個氨基酸從而生成了本發明具有活性的肽類似物，所述肽類似物與此處所列的肽相比具有增加的穩定性或更長的半衰期。
雖然SEQ ID NO:1至5所示的肽序列的氨基酸殘基均為“L”異構形式，但是“D”異構形式的殘基也可以置換任何的L-氨基酸殘基，只要該肽的類似物保留其活性即可。制備逆反(retro-inverso)D-氨基酸肽類似物的方法為本領域所公知，其中所述肽使用所公開的相同氨基酸制備，但至少一個或多個氨基酸(包括全部氨基酸)是D-氨基酸。當肽類似物中所有的氨基酸都是D-氨基酸并且所述肽類似物的N末端和C末端被反轉時，就形成了具有與肽的L-氨基酸形式處于相同位置的相同結構基團的類似物。但是，所述肽類似物對于蛋白水解降解更為穩定，因而可用于此處所敘述的多種用途。
術語“衍生物”是指具有氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包括本發明肽的氨基酸序列，其中通過支鏈或官能團的反應使一個或多個氨基酸殘基經受化學衍生作用，其中這樣的衍生作用不破壞所述肽衍生物的活性。氨基酸殘基的化學衍生作用包括，但不限于糖基化、氧化、還原、十四烷基化、硫酸鹽化作用、酰化、乙酰化、ADP核糖基化、酰胺化、環化、形成二硫鍵、羥化、碘化和甲基化。
根據本發明原理的肽衍生物還包括鍵修飾，所述鍵修飾包括，但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH、CF＝CH以及主鏈修飾。所述肽內的肽鍵(-CO-NH-)可被替換為，如N-甲基化鍵(-N(CH3)-CO-)、酯鍵(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N)、酮亞甲基鍵(-CO-CH2-)、α-氮雜鍵(-NH-N(R)-CO-)，其中R為任意烷基基團(如甲基)、胺甲酰鍵(carba bonds)(-CH2-NH-)、羥乙烯鍵(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺鍵(-C＝S-NH-)、烯屬的雙鍵(-CH＝CH-)和肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是碳原子上天然存在的“標準”支鏈。這些修飾可沿著肽鏈的任意鍵進行，甚至可以在幾個鍵(2-3)上同時進行。
本發明還包括游離氨基被衍生形成胺鹽的那些肽，所述胺鹽包括，但不限于氫氯化物、p-甲苯硫酰基團、芐酯基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基。游離的羧基可衍生形成例如鹽、甲基酯和乙基酯或其他類型的酯類或酰肼。游離的羥基可衍生形成如o-酰基或o-烷基衍生物。組氨酸咪唑上的氮可衍生形成N-咪唑-苯甲基組氨酸(N-im-benzylhistidine)。
還作為化學衍生物包括在內的是那些包括二十個標準氨基酸殘基的一種或多種天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如：4－羥基脯氨酸可取代為脯氨酸；5-羥基賴氨酸可取代為賴氨酸；3-甲基組氨酸可取代為組氨酸；同型絲氨酸可取代為絲氨酸以及鳥氨酸可取代為賴氨酸。這些肽還可以包括非天然氨基酸。非天然氨基酸的非限制性實例為正亮氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸、二氨基丁酸、同型絲氨酸、同型半胱氨酸、異丙基Lys、3-(2’-萘基)-Ala、煙酰基Lys、氨基異丁酸和3-(3’-吡啶基-Ala)。所述肽還可包括非蛋白質的支鏈。除此之外，本發明的肽還可包括一種或多種非氨基酸的單體或低聚物(如脂肪酸、碳水化合物復合物等)。還包括相對于上文所列的肽序列添加一個或多個氨基酸殘基的任意的肽，只要其保持必要的活性和優選的分子量即可。所述氨基酸殘基可加在所述肽序列的氨基末端和/或羧基末端和/或沿著所述肽序列添加。
本發明的肽衍生物還可以是環肽。例如，可以通過形成酰胺鍵(-CO-NH或-NH-CO鍵)實現環化，如通過在鏈上的不同位置引入Glu、Asp、Lys、Orn、二氨基丁(Dab)酸、二氨基丙(Dap)酸。主鏈與主鏈的環化還可通過引入式H-N((CH2)n-COOH)-C(R)H-COOH或H-N((CH2)n-COOH)-C(R)H-NH2的修飾的氨基酸而實現，其中n＝1-4，且進一步的其中R為任何天然或非天然的氨基酸支鏈。還包括主鏈與支鏈以及支鏈與支鏈的環化。
也可能通過引入兩個Cys殘基形成S-S鍵進行環化。其他支鏈與支鏈的環化可通過與式-(-CH2-)n-S-CH2-C-形成相互作用的鍵而實現，其中n＝1或2，例如，通過引入Cys或同型Cys并使其游離的SH基團與諸如溴代乙酰化的Lys、Orn、Dab或Dap反應是可能的。
如本發明所使用的術語“片段”是指相對于此處所列的肽序列具有一個或多個氨基酸殘基缺失的肽，只要所述肽保持必要的活性即可。所述氨基酸殘基可以從所述肽序列的氨基末端和/或羧基末端缺失和/或沿著所述肽序列缺失。
肽片段可由化學合成、重組DNA技術或通過至少一種切割劑作用于此處所列的所述肽制備。切割劑可以是化學切割劑，如溴化氰；或者酶，如外蛋白酶或內蛋白酶。可以用來切割本發明的肽的內蛋白酶包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶或任何其它本領域已知的產生蛋白水解片段的酶。
如上所述，本發明的肽可由酪蛋白水解獲得，或者所述肽可通過合成獲得。
酪蛋白的水解通常由胰蛋白酶或胰腺提取物消化來進行。然后從含所述肽的溶液中分離出未消化的酪蛋白，再通過合適的如本領域已知的方法和如以下所舉例的方法來進一步脫掉其它雜質而純化。根據本發明的某些實施方案，制備和純化隨時可使用的澄清藥物組合物包括過濾溶液。根據當前某些優選的實施方案，過濾采用了包括如氮氣或氬氣的惰性氣體在低壓下通過0.2μm至0.5μm的濾器進行。優選地，過濾通過0.22μm的濾器進行。意外的是，本發明證實了將酪蛋白水解產物制品經過孔徑小于0.5μm，優選為約0.2μm的膜過濾，得到了澄清溶液。溶液澄清的外觀主要是因為除去了剩余的未消化的酪蛋白膠粒。酪蛋白膠粒形成的膠體顆粒提供了牛奶的不透明的白色外觀。應理解的是通過如本領域已知的其它方法獲得的具有與本發明的藥物組合物相同特性的藥物組合物也包括在本發明的范圍之內，即，包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，為基本上無膠粒的澄清溶液形式，其中所述至少一種肽的分子量范圍為1,000道爾頓至5,000道爾頓。
本發明的藥物組合物相當穩定。如本發明所使用的術語“穩定”是指源自酪蛋白的肽在一定溫度下孵育后，其活性保留原始肽活性的至少85％，優選90％，更優選95％或更多。
本發明藥物組合物內的磷酸肽在高溫和低溫下均穩定。所述藥物組合物內的磷酸肽可以保持冷凍而基本上無活性喪失。另外，將所述藥物組合物加熱達70℃約15min也無活性喪失。
本發明提供了包括源自酪蛋白的肽的藥物組合物，所述藥物組合物為隨時可使用的無菌澄清溶液形式。這種組合物對當前可獲得的酪蛋白衍生產品是有利的，因為該溶液的澄清度使得任何污染特別是微生物污染的檢測簡便迅速。與許多迄今為止已知的以粉末形式提供的組合物相比，這種隨時可使用的溶液在施用前無需復原步驟。根據某些實施方案，本發明的藥物組合物預期用于獸醫用途，因而使得所述藥物組合物可施用于大量的受治療者。本發明的藥物組合物滿足了這種情況的需要，提供了一種易檢測污染且隨時可使用的制劑。
溶液的澄清度可用本領域技術人員已知的任何方法測量。根據某些實施方案，根據其濁值來確定溶液的澄清度。本發明所使用的“澄清”溶液是指濁值小于6個NTU的溶液。
術語“藥物組合物”在此處預期更廣泛地理解為包括含有依據本發明的蛋白質組合物的配制品，所述配制品不僅如本領域已知的用于治療目的，而且用作試劑或診斷目的。預期用于治療用途的藥物組合物應包括治療量的源自酪蛋白的肽，即，該量是預防和治療衛生措施所需要的。如果采用該藥物組合物作為試劑或進行診斷，那么該藥物組合物就應包括試劑量或診斷量的源自酪蛋白的肽。
根據某些實施方案，本發明藥物組合物的蛋白質濃度為約10ng/ml至約15mg/ml。
術語“藥物組合物”進一步指此處所描述的一種或多種肽和其它化學成分的配制品，所述其它化學成分如藥學上合適的稀釋劑、載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進化合物施用于生物體。
如本發明所使用的術語“藥學上可接受的載體”是指對生物體不造成明顯刺激且不消除所施用化合物的生物活性和特性的稀釋劑或載體。載體的非限制性實例為：水、丙二醇、鹽水、乳劑和有機溶劑與水的混合物。如本發明所使用的術語“賦形劑”是指為了進一步促進化合物施用而添加的惰性物質。賦形劑的非限制性實例包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖類以及各種類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。
藥物的配制和施用技術可參見最新版本的“Remington’sPharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,PA，其內容在此通過引用并入。根據當前某些優選的實施方案，本發明的藥物組合物被配制成腸胃外施用，如溝內施用，特別是注射或輸注入乳腺的乳頭溝。對于注射而言，本發明的肽可在水溶液中進行配制，優選在生理相容的緩沖液(如Hank’s溶液、林格氏溶液)中進行配制，或者在具有或不具有有機溶劑(如丙二醇和聚乙二醇)的生理鹽水緩沖液中進行配制。鑒于局部施用或全身施用，未對溝內施用于乳腺的乳頭溝進行定義。如本發明所公開的，溝內施用本發明的藥物組合物可以通過例如只誘導受治療乳腺的退化來產生局部效應，并由此被稱為局部施用。所述藥物組合物還可作為凝膠、軟膏劑、乳膏、乳劑或持續釋放劑型(包括透皮貼劑)進行局部施用。本發明還包括腸胃外(perenterally)或口服的全身施用。
根據另一方面，本發明提供了一種冷凍干燥粉末形式的藥物組合物，其包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，其中所述粉末在使用前于液體中復原形成基本上無膠粒的且pH值高于6.0的澄清溶液。
根據另一方面，本發明提供了一種用于治療泌乳動物乳腺的藥物組合物，其包括治療有效量的源自酪蛋白的至少一種肽，其中所述組合物為隨時可使用的無菌澄清溶液形式，其基本上無膠粒，且pH值高于6.0；所述治療包括誘導暫時性產乳停止和誘導持續性產乳停止。
根據又一方面，本發明的新型藥物組合物用于預防和治療感染或逆轉感染。根據其他實施方案，所述藥物組合物包括平均分子量為約1,000道爾頓至5,000道爾頓的磷酸肽。根據當前某些優選的實施方案，所述肽的平均分子量為約2,500道爾頓。
根據某些實施方案，所述泌乳動物選自由人、奶牛、山羊、綿羊、水牛、駱駝、驢、駝羊、馬、豬、貓和狗組成的動物組。
根據當前某些優選的實施方案，所述泌乳動物是人。在最近幾十年，全世界技術發達國家的母乳喂養減少，而且在發展中國家甚至也減少到更少的程度。很多女性選擇根本不哺育自己的孩子或在短期時間后停止哺育。其他的是因為各種醫學原因而不能哺育，包括患某些遺傳或非遺傳疾病的女性，具體的例子是攜帶HIV的女性。目前衛生當局推薦HIV攜帶者在分娩后僅保持母乳喂養大約10周，此后只應提供代乳品。產下早產兒，或未存活的足月兒(term babies)的婦女也不能哺育。在這些情況中，乳腺產奶但未擠奶。這樣的乳液淤積在一定程度上與顯著引起身體和心理上的痛苦的乳房腫脹有關。另外，乳液淤積經常與泌乳泄漏有關，這隨后增加了患乳房內感染的風險。本發明的藥物組合物和方法滿足了快速并且有效誘導退化和停止產奶以預防以上所述不希望的情況的需要。
根據當前另外優選的實施方案，動物是選自由奶牛、水牛、山羊和綿羊組成的組的牲畜動物。
本發明新型的藥物組合物有效誘導了暫時性產乳停止或持續性產乳停止。通常，通過將本發明的藥物組合物經乳頭溝直接注射或輸注來進行單次應用，而響應于所述單次應用可獲得對泌乳動物乳腺的產奶量的暫時性效果。通常，單次注射或輸注8小時后可引起產奶量急劇下降。本發明現在公開了單次使用本發明的藥物組合物還能夠引起持續性產乳停止或退化。僅在治療的乳腺中發生產乳停止；這種現象很重要，因為未接受治療的乳腺仍可擠奶從而減少了產奶量的損失。可選地，如果需要，對泌乳動物的所有乳腺進行治療以誘導產奶停止。
由本發明藥物組合物誘導的退化比停止擠奶誘導的退化更為迅速和同步，機械刺激如擠奶可以恢復產奶。在自然退化過程中，在隨后的妊娠和分娩后，產奶也可恢復。由本發明組合物誘導的快速退化不干擾乳腺組織的重建和臨近分娩時泌乳能力的恢復。
本發明新型的藥物組合物可進一步用于治療乳腺感染。如本發明所使用的術語“治療”是指預防人類和非人類乳腺感染以及治療感染的乳腺以逆轉感染和治愈乳腺。
本發明藥物組合物可用于治療范圍廣泛的微生物感染，包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、支原體和病毒引起的感染。
根據某些實施方案，所述藥物組合物可用于治療乳腺炎，特別是包括奶牛、綿羊、水牛和山羊的牲畜的乳腺炎。
臨床型和亞臨床型乳腺炎是主要由細菌感染引起的炎癥狀態。乳腺炎具有多種細菌病因學，其給年產奶量帶來了巨大損失。最經常引起乳腺炎的致病微生物按來源分為兩類：環境病原體和傳染性病原體。主要的傳染性病原體是無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase-negative staphylococcus)(CNS)以及大腸埃希桿菌(E.Coli)。除了一些在其它身體部分出現并全身傳播的支原體感染外，這五種主要類型的微生物通過乳頭溝進入乳腺。傳染性病原體在乳腺內很適合存活并生長，經常導致持續數周、數月或數年的感染。在乳畜群中，這些感染的乳腺是這些生物體向未感染區域傳播傳染性病原體的主要來源，而奶牛主要是在擠奶過程中發生傳染。
臨床型乳腺炎由于有明顯的乳液組成改變和外觀改變、產奶量下降、體溫升高和受感染乳腺腫脹、潮紅、發熱，而使其易于診斷。亞臨床型乳腺炎是該疾病的最普遍的形式，經常由于癥狀不明顯而難以察覺。許多亞床型IMI往往持續，并且由于乳液SCC升高而導致牛奶質量下降，也導致產奶量下降。局限于單個乳腺的IMI可能發展為臨床型乳腺炎，并由感染乳房區域向未感染區域傳播某些乳腺炎病原體。與臨床型乳腺炎不同，亞臨床型乳腺炎因治愈率低，治療費用以及4至5天的棄奶期而使其不經濟(Yamagata等，1987.J.Am.Vet.Med.Assoc.191：1556-1561)，因此不建議在泌乳期施用抗生素治療患有亞臨床型乳腺炎的牲畜(Gruet等.,2001.Adv.Drug Delivery Rev.50:245-259)。本發明的藥物組合物可在泌乳期施用。如上所述，本發明的組合物有局部治療效果，因此可僅給感染的乳腺施用治療，而未感染的乳腺繼續擠奶，從而將乳液損失降至最低。
對于治療乳腺炎，需要給感染的乳腺施用重復劑量的本發明的藥物組合物。通常，在1至10天期間，優選1至3天期間，以選自由以下組成的組的間隔重復施用至少1次，優選1至10次，更優選1至3次：約6小時、約8小時、約12小時、約16小時、約20小時和約24小時。
根據某些實施方案，可在干奶期施用本發明的新型藥物組合物來治療乳房感染。這種治療可直接治療感染的乳腺(奶牛干奶治療)或作為預防治療(奶牛干奶預防治療)。在干奶期開始和干奶期期間治療感染比在泌乳期治療更為有利，因為其不僅可將藥物組合物施用于具有可見感染體征的感染乳腺，也可施用于乳房的全部乳腺。這種治療可消除已有感染，并且預防在干奶期獲得新感染。而且，本發明證明了在干奶期施用本發明的藥物組合物可降低在隨后泌乳期中的感染發生率。藥物組合物可施用于鑒定為患有臨床和亞臨床乳腺炎的乳腺，也可施用于未感染乳腺作為預防治療，或施用于上述二者。
根據另外的實施方案，可將本發明新型的藥物組合物與其他抗微生物治療一起施用，所述其他抗微生物治療選自由以下組成的組，其不限于抗生素、殺菌劑、甾族的和非甾族的抗炎治療、采用免疫調節劑的治療和疫苗接種治療。根據一個實施方案，將本發明的藥物組合物與其它抗微生物治療同時施用，以聯合的，單個的藥物組合物或以分離的藥物組合物的形式施用。可選地，可先施用本發明的藥物組合物作為預治療，隨后施用另外的抗微生物治療，反之亦可。
提供以下實施例以更充分地闡述本發明的優選實施方案。但是，它們不應以任何方式解釋為限制本發明的寬泛的范圍。
實施例
實施例1：藥物組合物的制備
將商用牛酪蛋白(例如，Sigma)溶于25mM Tris緩沖液(100g/升)，pH為8，在37℃用胰蛋白酶消化4小時(500U/升)。然后用鹽酸將溶液酸化至pH值4.7，通過離心使未消化的酪蛋白成團粒。將上清液沸騰15分鐘，冷卻至室溫，用氫氧化鈉溶液調節pH至7。通過離心去除在這些條件下不溶的物質并拋棄。選擇性地，將食品級商用酪蛋白水解產物用作起始物，以1-40g/l溶于生理鹽水或水中，所得pH為大約7.2。在整個過程中所用的水或生理鹽水符合USP“注射用水”各論(monograph)。然后加熱溶液至40-60℃，冷卻后，使用低壓(1-6psi)惰性氣體，例如氮氣或氬氣通過5微米濾器進行過濾。幾個批次需要通過3微米濾器另外進行過濾。然后將濾液加熱至50℃至70℃以增加多肽的溶解。
然后使用低壓(1-6psi)惰性氣體，例如氮氣或氬氣將所得混濁溶液通過0.2微米的濾器進行過濾。過濾步驟除去所有剩余的酪蛋白膠粒，使得過濾后所得溶液是澄清的。濾液取樣并采用Bradford方法分析總的蛋白含量，將蛋白濃度調至5-15mg/ml。然后用濃縮的HCl(試劑級ACS)或1.0當量的NaOH調節溶液的pH值至大約7.3-7.6。使用低壓惰性氣體用0.2微米濾器再次過濾溶液。然后將終濾液(約10ml)過濾并在惰性氣體氣氛中密封于20ml無菌玻璃安瓿。
為了防止在過程最后堵塞0.2微米濾器，對于某些商用酪蛋白水解產物源，可能需要使用低壓(1-6psi)惰性氣體，例如氮氣或氬氣通過5微米濾器進行預過濾的步驟。
溶液的澄清度通過比濁計(Micro 100General Purpose Turbidometer，Metex Cooperation，Toronto，Canada)測定。所得溶液澄清，NTU為4.0。本文將所得組合物命名為MLTS-2。
實施例2：乳腺炎的治療
實施例2.1：應用于患有乳腺炎奶牛的干奶治療
奶牛群體
32只奶牛參與研究(8只病例，即接受治療的奶牛，24只作為對照，根據研究設計進行選擇，參見下文)。根據細菌學診斷被診斷患有臨床型和/或亞臨床型乳腺炎的8只病例奶牛進入接受使用按上文實施例1所述制備的本發明組合物(MLTS-2)進行的治療。24只奶牛作為對照，其中6只經診斷患有如上的乳腺炎，18只未被感染。臨床型乳腺炎以以下可見的體征為特征，包括乳液出現絮狀物或凝塊、SCC急劇增高、發熱、脈搏加快、食欲不振、脫水和抑郁。感染的區域(quarter)或乳房也可能腫脹。亞臨床型乳腺炎以產奶量減少，乳液質量下降和通過集液罐中體細胞計數的增加檢測到的SCC升高為特征。對照和試驗奶牛為來自同畜群的樣本并且同種。
全部奶牛的納入標準：處于泌乳期的后期，預期的干奶期第一天以前的1至2周；有四個功能區域(four quarters)；懷孕；無明顯外部奶頭損傷；進入前4周未接受全身的抗乳腺炎治療；進入前4周未進食含抗生素的食物；根據研究者判斷沒有對實驗結果有潛在影響的發病跡象。診斷患有乳腺炎的奶牛是確認的IMI和SCC至少為大于400,000細胞/ml的奶牛。
根據以下排除標準將奶牛從研究中排除：進入前4周接受過免疫治療的奶牛；進入前4周全身或通過進食接受抗生素、激素、抗炎和/或合成代謝治療的奶牛；進入前12個月接受疫苗治療的奶牛；全身或通過進食同時使用免疫和疫苗治療的奶牛；同時有其它選擇性的治療的奶牛；根據研究者的判斷患有活動性結核或其它傳染性疾病的奶牛；全身或通過進食同時使用合成代謝類固醇的奶牛；全身或通過進食同時使用激素的奶牛。
研究設計
為了盡可能減少外部差異，通過根據以下變量定義的匹配分數對治療(病例)和對照奶牛進行選擇：畜群、種產仔次數，產仔日期、干奶期次數、干奶日期以及奶牛出生日期。全部匹配評分為5，沒有匹配評分為0。對于畜群和種需要全部匹配。其它因素(最重要的因素至不太重要的因素)包括：分娩次數(容許匹配±1)、分娩日期的差異(容許匹配±1月)、干奶期次數(容許匹配±1)、干奶期開始日期的差異(容許匹配±2月)、出生日期(容許匹配±3月)。
奶牛在預定進入干奶期之前的1至2周，即分娩前大約75天時進入研究。在此期間，測量以下參數設定基線數據：乳房的大體外觀；SCC；根據細菌學測試和可見體征的IMI的存在。分娩前60天，停止擠奶，開始實施治療。試驗奶牛在3天內一天兩次接受含8mg/ml多肽的MLTS-210ml。診斷患有乳腺炎的對照組奶牛接受廣譜抗生素(頭孢喹晤，每次應用75mg)的奶牛干奶治療。通過乳腺的乳頭溝注射入腺乳池來進行施用以對各區域進行單次給藥。對乳房的全部四個區域進行治療。每次注射給藥使用新的藥水瓶。用過的藥瓶保留作為研究篩選的依從性和衡算計量的證明。在最后的治療，奶牛不再擠奶直到分娩后下一個哺乳期。在3天治療完成后，在干奶期期間對奶牛的乳腺炎可見體征觀察大約9個星期。在分娩后下一個泌乳期的第1個月、第2個月、第3個月期間通過細菌學測試檢查乳房各區域的微生物存在情況、乳房的大體外觀和SCC。
結果
以下的表1顯示了治療前檢測到的細菌在治療后不存在(即感染的治愈率為100％)。
表1：與匹配對照奶牛(24只奶牛，96個區域)相比，干奶期治療對使用酪蛋白水解產物治療的奶牛(8只奶牛，32個區域)細菌治愈和新感染的影響
注：S表示葡萄球菌；CNS表示凝固酶陰性鏈球菌
在研究開始時診斷為未患乳腺炎，并且未接受任何治療的對照奶牛在此期間發展為乳腺炎(n＝12，18個區域)；另外6個區域復發感染，1個由同樣的微生物引發，剩余5個區域由不同類型的微生物引起。
實施例2.2：以畜群水平應用于包括患有或不患有乳腺炎奶牛的一次劑量干奶治療
實驗設計
本實驗目的是研究MLTS-2干奶治療在畜群水平的效果。。在第二泌乳期來自一個乳畜群的至少55只Holstein奶牛自2005年7月25日至2005年11月11日參與實驗。
根據獸醫國際協調合作指導原則(Guidelines of the international Coodination of Harmonization in Veterinary)進行本研究，納入和排除標準如實施例2.1所述。
奶牛在預定進入干奶期之前的1至2周，即分娩前大約75天時進入研究。在預定干奶治療之前遵照已確立的指導原則由各區域無菌收集并培養牛奶樣品至少兩次。通過至少兩次陽性培養來確定干奶期前的乳房內感染。在治療前的期間內，測量下列參數設定基線數據：乳房大體外觀；SCC；根據細菌學測試存在的IMI和可見體征。分娩前60天停止擠奶并開始實施治療。通過對44只實驗奶牛的四個區域進行無菌乳房內輸注來實施治療。每個區域每次輸入每ml含有8mg肽的MLTS-2 10ml。每次注射換用新的藥水瓶。用過的藥瓶保留作為研究篩選的依從性和衡算計量的證明。在最后的治療后，奶牛不再擠奶直到分娩后的下一個泌乳期。在治療完成后，在干奶期期間對奶牛的乳腺炎可見體征觀察大約9個星期。為了評估區域水平的治愈率和新的感染率，在隨后泌乳期的前兩個月收集所有區域的初乳樣品并在合適的培養基上培養。連續兩次牛奶培養為陰性的區域被認為是微生物上的治愈或是未感染的區域。分娩后1個月和2個月時，檢查乳房的大體外觀和SCC。對每個區域的所有參數進行編輯并通過SAS/STAT軟件包使用卡方檢驗對治療前后的效果進行分析。
結果
在最初的樣本中，發現14只奶牛(25.5％)感染，其中19個區域(8.6％)發生感染。檢測到的主要的生物體是葡萄球菌變異株(14/19)。
表2：治療前后檢測的IMI(奶牛n＝55,區域n＝220)
注：S表示葡萄球菌；CNS表示凝固酶陰性葡萄球菌；NOS未另外說明。Strep，鏈球菌。Prev.表示發病率，治療前后IMI差異有統計學顯著性，p＜0.005。
數據表明產仔后直到89天僅有一個區域被同一類型生物體感染。
實施例2.3泌乳期乳腺炎的治療
37只奶牛進入本研究。全部奶牛經診斷均有一個乳房患有臨床性乳腺炎。通過乳腺的乳頭溝注射入感染的腺乳池來施用酪蛋白水解產物，一天兩次，，上午下午各一次。
就分娩次數和相應的泌乳次數而言，參與本研究的奶牛處于不同的階段。通過標準實驗室技術鑒定生物體并定量(Leitner等，2004DairySci.87:46-52)。陽性結果基于連續兩次鑒定出已知的乳腺炎病原體。如以下表3所示，本發明藥物組合物治療泌乳期的乳腺炎療效顯著。
表3：MLTS-2對泌乳期患有IMI的奶牛細菌治愈的影響
實施例3：縮短干奶期
奶牛群體
根據以上實施例2.1所述納入/排除的實驗奶牛進入本研究。治療組(n＝5)和對照組(n＝15)之間的匹配評分也如前述實施例。在對照組中，至少五分之一奶牛被診斷患有乳腺炎并且使用抗生素對其進行奶牛干奶治療。
實驗設計
在預定進入研究前的兩周將奶牛納入本研究。在分娩前大約60天、40天、30天、20天、10天進入研究。進入研究前，測量下列參數來設定基線數據：SCC；根據細菌測試存在的IMI、可見體征和產奶量。每天僅施用一次按下文實施例4所述制備的酪蛋白水解產物。減少治療次數至單次應用是迫切需要的，因為單次治療可大大簡化程序和特定農場的工作量，因此，可能被農戶所采用。
通過乳腺的乳頭溝注射入腺乳池來進行施用。每次注射換用新的藥水瓶。用過的藥瓶保留作為研究篩選的依從性和衡算計量的證明。治療后，奶牛不再擠奶直到下一個泌乳期。治療完成后，在干奶期期間觀察奶牛(包括乳房檢查)。另外，在分娩后，檢查以下參數：SCC；通過細菌測試的IMI、可見體征以及評估乳頭溝，包括評估敞開或閉合的乳頭溝和乳頭塞(plug)的一致性。還測量產奶量。當其引起產奶完全停止，并且對分娩后所測量的參數沒有任何負面影響時認為治療是成功的。將干奶期縮短至45天或更少是非常成功的。如上文實施例2.2所述進行統計分析。正如已知的，自第一次泌乳期(第一次分娩之后)至至少第四次泌乳期產奶量增加。因此，為了使治療奶牛和未治療奶牛的產奶量標準化，根據如下的泌乳量對產奶量數據進行校正：對于第一次泌乳，每天每升奶量除以0.795；對于第二次泌乳，每天每升奶量除以0.965；對于第三次泌乳，每天每升奶量除以1.001。而對于第四次或更多次泌乳未進行標準化。目前在以色列奶牛養殖協會(ICBA)采用這些校正因子進行奶牛的遺傳選擇。
結果
根據研究設計，所有病例和對照奶牛順利分娩，無流產或任何其它產后疾病的記錄。病例和對照奶牛在先前的泌乳期中干奶期長度(天數)相同。另一方面，在當前的泌乳期，與對照相比，酪蛋白水解產物治療后，病例奶牛的干奶期的長度明顯縮短(表4)。
表4：酪蛋白水解產物治療對干奶期長度的影響
產仔后，至少在下文表5所述時間期間內干奶期縮短的奶牛之間產仔后產奶量沒有差異。
表5：應用酪蛋白水解產物治療縮短干奶期后的產奶量
實施例4：減少牛奶的體細胞計數
實施例4.1：酪蛋白水解產物治療3天的泌乳奶牛的體細胞計數
奶牛群體
在最初募集42只奶牛后，有37只奶牛完成了實驗。如果奶牛具有四個功能區域，其中至少有一個區域被感染，但沒有明顯的乳頭損傷，身體狀態良好并且在治療前30天內未接受抗生素和/或抗炎治療，則符合本研究的募集條件。另外，從中選擇奶牛的任何畜群至少在以前一年內未使用乳腺炎疫苗。給這些農場的奶牛飼喂典型的總混合比為包括65％濃縮物和含有17％蛋白質的35％飼料的Israeli。
酪蛋白磷酸肽的制備
如前所述(Shamay等，2003，supra)制備包括酪蛋白磷酸肽的酪蛋白水解產物。在Hy實驗室(Rehovot,Israel)進行該過程以確保終產物無菌并將產品裝入無菌試劑瓶中。根據鱟變形細胞溶解物(LAL)試驗，終產品內毒素水平為0.48EU/ml。按0.0001EU/kg體重(假定平均奶牛體重為500kg)注射10ml該溶液，其所含有的內毒素的量比鞘內施用人藥物的內毒素耐受限量低2000倍(K＝耐受限量(EU/Kg)，腸胃外藥物為5EU/kg，鞘內藥物為0.2EU/kg)。單次注射入單個區域的終產物含10ml CNH和濃度為10mg/ml的肽。
實驗設計和結果
在三天(3)期間通過乳頭溝一天兩次將酪蛋白水解產物僅施用于乳房受感染的乳腺。根據畜群的正常時間表繼續擠奶并誘導干奶期。
牛奶樣品在以色列奶牛養殖協會(ICBA)的中心實驗室，Caesarea，Israel或在國家乳腺炎參考中心(National Mastitis Reference Center，Kimron Veterinary Institue)進行檢查。用標準實驗室技術(Leitner等，2004.Dairy Sci.87：46-52)鑒定生物體并進行定量。陽性結果基于連續兩次鑒定出已知的乳腺炎病原體。
將施用治療前的牛奶中的體細胞計數(SCC-PRE)與產仔后觀察的SCC(SCC-POST)相比。在下文表6所列的SCC-PRE是直到應用酪蛋白水解產物治療前15天兩次測量的平均值。所列SCC-POST是產仔后15至60天至少兩次測量的平均值。對于27只奶牛，直到分娩后10個月每個月測定SCC一次。
統計分析
用SAS/STAT軟件包通過使用適于SCC的卡方檢驗和連續變量的單因素方差分析(one way ANOVA)對SCC-PRE和SCC-POST進行比較。所有牛奶樣品在ICBA實驗室用Fossomatic 360和適于統計分析的對數標度轉換器(converter the log scale)來分析SCC。
結果
從9個畜群的37只經診斷確定一個區域患有乳腺炎的奶牛收集數據。鑒定出的最普遍的病原體是化膿隱秘桿菌(Arcanobacterium pyogengs)、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏桿菌、乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)。由鏈球菌、P.auroginosa、Corynobacterium bovis和微球菌引起的感染全部是亞臨床型，而金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏桿菌和化膿隱秘桿菌的感染有～60％是臨床型，～40％是亞臨床型。
當測試個體或整個研究組的病原體時，SCC-PRE(平均值為2,210,200)和SCC-POST(平均值為205,000)之間的差異顯著(p<0.001)(表6)。
表6：酪蛋白水解產物對所治療的泌乳期奶牛產仔后一個感染乳腺的SCC的影響
在臨床型感染的乳腺中，治療后75％的奶牛(n＝9/12)的SCC-POST為201,000個細胞/毫升或更少，在所有治療的奶牛中，SCC-POST是401,000或更少(表7)。在亞臨床型感染的乳腺中，治療后57％的奶牛(n＝12/21)的SCC-POST為201,000個細胞/毫升或更少，81％的病例奶牛是401,000個細胞/ml或更少。當考慮所有數據時，63.6％(n＝21/33)的病例奶牛的SCC-POST值低于201,000個細胞/ml，顯著高于SCC-POST在201，000個細胞/ml以上的病例數(n＝12/33)(p<0.01)。
表7：酪蛋白水解產物對所治療的泌乳期奶牛產仔后單個感染乳腺的SCC的影響
對于27只奶牛，治療和誘導干奶期之間平均需要經過6.1個月，即在干奶期后產仔。因此，在這些奶牛中，SCC-POST代表在干奶期后的泌乳期觀察到的SCC。59.3％的奶牛(16/27)SCC-POST低于201,000個細胞/ml，與在治療期和干奶期之間SCC-POST低于201,000個細胞/ml的病例數相比，21/23無顯著差異。值得注意的是在整個跟蹤觀察過程中，差不多26％的奶牛SCC-POST低于101,000個細胞/ml，85％(23/27)的SCC-POST低于400,000個細胞/ml。
實施例4.2：給四個乳腺施用單個劑量的酪蛋白水解產物對產仔后體細胞計數的影響
從實踐的角度考慮，將施藥次數減少至一次是非常重要的，因為單次治療會大大簡化程序和特定農場的工作量，因此，可能被農戶所采用。
本實驗的目的是研究給四個乳腺應用一個劑量的酪蛋白水解產物對產仔后體細胞計數的影響。至少在第二泌乳期來自一個乳畜群的Holstein(55只)奶牛自2005年7月25日至2005年11月11日參與實驗。
研究奶牛、納入和排除標準、牛奶樣品以及研究方案基本如上文實施例2.1所述。將應用治療前牛奶中的體細胞計數(SCC-PRE)與產仔后觀察的SCC相比。SCC-PRE是直到治療前15天各單個乳腺兩次測量的平均值。SCC-POST是產仔后15至60天(間隔15-30，31-60)至少兩次測量的平均值。數據和SCC分析如實施例4.1。
結果
治療前，感染區域(13只奶牛的19個區域)測量的平均SCC-PRE為557,278個細胞/ml，而非IMI區域為183,381個細胞/ml(P<0.001)。如以下表8所示，治療有效地降低了SCC-POST值(P<0.01)。與非IMI乳腺相比(P<0.05)，乳房內感染乳腺的治療前后SCC差異更顯著(P<0.01)。然而，這些結果清楚地表明當應用于感染和非感染乳腺時，施用酪蛋白衍生的肽可降低牛奶的SCC，并因此改善牛奶衛生。
表8：酪蛋白水解產物對產仔后感染和未感染乳腺SCC的影響
*P<0.001；**P<0.01；***P<0.05
實施例5：酪蛋白水解產物對分娩后產奶量的影響
實施例5.1：多次應用酪蛋白水解產物的影響
奶牛群體
11只通過細菌學診斷為患有臨床型和/或亞臨床型乳腺炎的奶牛(病例)進入接受酪蛋白水解產物治療。33只奶牛作為對照，其中6只診斷患有如上文的乳腺炎，27只未受感染。對照和實驗奶牛為來自同一畜群的樣本并且同種。
分娩前大約60天，停止擠奶并實施治療。在3天內實驗奶牛一天兩次接受含有8mg/ml肽的MLTS-2 10ml。對照奶牛接受作為單次治療的抗生素奶牛干奶治療。乳房的全部四個區域均接受治療。治療期間奶牛停止擠奶；并將酪蛋白水解產物治療前累積的殘余牛奶由治療乳腺丟棄。
將實驗數據進行三因素方差分析，其中使用組(治療奶牛vs.對照牛)；泌乳期(測試的泌乳期：1、2、3或4-5)和分娩后月份(泌乳期第1、第2、第3或第4個月)進行重復測量(“列區”)設計。為了比較治療前后的平均產奶量，每天的產奶量如上文實施例3所述進行標準化。
結果
圖1和圖2描述了對酪蛋白水解產物的典型反應(分別為第2425號和2331號奶牛)。兩只奶牛在治療時感染了金黃色葡萄球菌(Staphilococcus aureus)。可以看出在第二次泌乳期感染可引起產奶量下降。但是治療后，產奶量從分娩直到最后測量(產后60天)顯著增加。表9顯示產奶量的增加不會對牛奶質量有不利影響，通過蛋白質和脂肪濃度進行測量。
表9：酪蛋白水解產物治療對分娩后至泌乳期的100天時獲得的牛奶蛋白質和脂肪濃度的影響
實施例5.2：單次應用酪蛋白水解產物的影響
本實驗目的是研究在分娩前干奶期將單次酪蛋白水解產物治療應用于四個乳腺對產仔后產奶量的影響。單次應用的重要性在于減少農場的工作量和對治療施用物質的依從。
至少在第二泌乳期來自一個乳畜群的Holstein(55只)奶牛自2005年7月25日至2005年11月11日參與實驗。
研究奶牛、納入和排除標準、牛奶樣品、細菌學測試以及研究方案與實施例2.2和4.2相似。每只動物的產奶量每天自動記錄三次。通過比較以下定義的時期的產奶量來對酪蛋白水解產物對產仔后(4至103天)產奶量的影響進行評價。
將第3期的產奶量與第1、第2期的產奶量進行比較(參見上文用于定義時期的流程圖)。
就分娩次數和相應的泌乳次數而言，參與本研究的奶牛處于不同階段。如上文實施例3所述，根據泌乳次數的產奶量將處于不同泌乳期的奶牛的產奶量進行校正。28只奶牛在第一次泌乳期末進行治療，17只在第二次泌乳期末和10只在第三次或更多次泌乳期末進行治療。原始結果和校正的產奶量用升計量。數據如實施例5.1所述用SAS/STAT軟件包進行分析。
結果
收集55只奶牛的數據。第3期的產奶量比第1期的產奶量增加11.6％(P<0.01)(表10)。
表10:單次給藥酪蛋白水解產物的治療對分娩后干奶期產奶量的影響
在患有乳房內感染(IMI)的奶牛中(n＝13,乳腺＝19)，酪蛋白水解產物治療的影響更為顯著(P<0.01)，因為與由非IMI奶牛獲得的牛奶量相比，第2期的每日牛奶量更低，為2.2升(表11)，而在第3期患有IMI的奶牛和沒有IMI的奶牛的產奶量相似(表12)。
表11：第2期IMI和非IMI奶牛的產奶量
表12：單次給藥酪蛋白水解產物的治療對分娩后(第3期)產奶量的影響
實施例6：酪蛋白水解產物對誘導干奶期的奶牛福利的影響
根據常規實踐，現代奶牛需要在預期分娩前干奶60天以兼顧農戶所希望的產奶量最大化和預防在下一個泌乳期產奶量下降的使“干奶期”最短的需求(Annen等，2004，ibid)。這種實踐與突然停止奶牛擠奶有關，所述奶牛每天仍產生相當數量的牛奶，每天20升至40升，有時甚至達到50升。這種實踐導致大量的牛奶在乳房內聚集，這與乳房充脹和漏奶有關，且經常給奶牛帶來極大的痛苦，使其數天高聲尖叫。因此，現代乳牛業當前使奶牛干奶的實踐大大阻礙了奶牛的福利狀態。
本實驗的目的是測試使用酪蛋白水解產物的治療對突然停止擠奶誘導進入干奶期的奶牛生產行為和福利的影響。
20只泌乳末期(～60天)并且每天產奶17升至35升的Holstein奶牛進入本研究。奶牛根據泌乳次數、擠奶天數、距分娩天數、乳頭末端完整性、產奶量、每只奶牛或每個區域每ml牛奶的SCC和在干奶日中感染的區域數(表13)進行配對。
表13：病例奶牛(CNH+頭孢喹諾)與對照(頭孢喹諾)奶牛(每組n＝10，數據用平均數±SD表示)起始點的比較
在干奶前一周分別測試區域牛奶SCC和細菌分離物三次。然后將每對中的一只奶牛隨機分入亞組(通過拋擲硬幣)。亞組1的奶牛在擠奶后用酪蛋白水解產物和廣譜抗生素頭孢喹諾進行治療，(每次給藥75mg)(N+C)，而亞組2的奶牛單用頭孢喹諾進行治療(每次給藥75mg)(C)。治療前一周將2個亞組的奶牛一起放在有限的處所中以進行調整，所述處所對每只奶牛給予10平方米陰影漏縫地板(shaded slatted floor)和10平方米的混凝土表面場地。然后從那時起在原地待2周。三周后，從治療前一周到治療后第二周，奶牛佩戴數字化的腿部固定(leg-mounted)式傳感器(Afifarm Management System，S.A.E.Afikim，Israel)，該傳感器能夠監測，記錄并傳送動物活動(腳步)和躺臥行為(LB)，而對其他自由動物行為干擾很小。如下設置乳房壓力指數(UPI)：0，1，2和3。0為無壓力，1為中等壓力，2為高壓，3為極高壓力。通過將手指按壓在組織上評估乳房壓力以及評估乳頭以上10cm的兩個區域——乳池和ubeis體(corpus ubeis)對壓力的耐受來測定任意UPI值。實驗自始自終均由受過訓練的同一人在每天的相同時間進行一次而完成所有的UPI測量。
用適合重復測量JMP(第5版，SAS Institute,Cary,NC)的擬合模型程序對數據進行統計分析；治療是實驗對象間因素，時間是實驗對象內因素。P<0.05認為差異顯著。模型是：
Yijklm＝μ+Pi+αj+C(ij)k+γ+αγil+εijklm
其中Yijklm＝自變量，μ＝總體平均數，Pi＝時期的固定影響(干奶前后；i＝1至2)，αj＝＝固定的治療影響(I＝1至2)，C(ij)k＝奶牛k(k＝1至10)在時期i和治療j的隨機影響，γi＝l天的影響(l＝1至9)；αγil＝治療j和l天相互作用的影響；εijklm＝與在時期i的奶牛K和在第l天治療有關的隨機誤差。
通過t檢驗，使用Tukey-Kramer HSD進行治療期間或治療后特定日比較。
另外，對每個治療組分別以兩種情況進行線性回歸分析：(i)作為自變量的實驗天數vs.累積步數，(ii)作為自變量的ΔUPI(Δ指的是在產仔后特定日測定的數據減去產仔前相同數據平均值的差值)vs.步數與躺臥持續時間之比的Δ。回歸的顯著性由回歸系數和n來評估，而用t檢驗分析回歸斜率(b)、斜率的標準誤差(Sb)和n來評估回歸斜率的差異。
僅用抗生素(C)治療的奶牛UPI任意值(圖3)由治療前的～1.2顯著增加至1.8至2.5，而誘導奶牛進入退化后的前4天在N+C治療的奶牛中UPI任意值急劇下降，因此，在這4天期間，組間的UPI值差異顯著(P<0.01)。僅在誘導進入干奶期的第5天后，對照奶牛的UPI值下降。圖4顯示治療后第四天兩只奶牛乳房的照片。這兩只特定奶牛的產奶量為干奶期每天30升以上。圖3的圖片說明UPI值為0的治療奶牛(B圖)與UPI值為～2的未治療奶牛(A圖)之間的差異。
步數與躺臥持續時間之比(RSL)用作評價“動物舒適性”的手段(圖5)。N+C治療奶牛的比例在治療后第二天開始變小，而C治療奶牛的比例未變。因此，治療后第3天及以后組間的差異變大并且變得有顯著性(P<0.005)。
總而言之，與傳統方法誘導進入干奶期的奶牛相比，酪蛋白水解產物治療奶牛的乳房壓力、活動度以及休憩行為清楚地表明了奶牛沒有受苦且更為平靜和更為舒適的跡象。
雖然已對本發明的某些實施方案進行了說明和描述，但是應該清楚本發明并不限于本文所述實施方案。各種修改、改變、變型、代替和等價物對于本領域技術人員而言是顯而易見的，并且未脫離如隨后權利要求書所述的本發明的實質和范圍。
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