本發明屬于生物醫學和藥物領域，具體涉及小檗堿在制備增強炎癥小體活化藥物中的應用。

背景技術：

小檗堿(Berberine)又稱黃連素，是一種常見的異喹啉生物堿，分子式C₂₀H₁₈NO₄。它存在于小檗科等四個科十個屬的許多植物中，可從黃連、黃柏、三顆針等植物中提取。小檗堿為黃色針狀晶體，熔點145℃，難溶于水，能溶于苯、乙醚和氯仿。常用藥物形式為鹽酸小檗堿(結構式如下所示)，在水中的溶解度都比較小。小檗堿對痢疾桿菌、結核桿菌、肺炎球菌、傷寒桿菌等多種細菌都有抑制作用，其中對痢疾桿菌作用最強。臨床主要用于治療細菌性痢疾和腸胃炎。小檗堿在治療腸胃炎方面的用途，可見公開專利文件(申請號CN201210474880.7)。

鹽酸小檗堿(分子量371.81g/mol)

激活炎癥小體是機體最重要的固有免疫防御機制之一，包括：激活caspase-1/caspase-11，促進白細胞介素-1β(IL-1β)等炎癥介質成熟、釋放，誘導細胞焦亡。正常情況下，上述機制有利于增強感染部位的局部炎癥反應，募集更多的中性粒細胞等吞噬殺傷細胞，促進病原微生物的清除，最終加速炎癥的緩解和疾病的痊愈。具體而言，細胞焦亡在機體抗感染免疫中有如下作用：首先，研究表明caspase-1/caspase-11的表達及其介導的細胞焦亡，有利于抑制感染(包括葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠急性腸炎)，加快組織修復，而焦亡缺陷(caspase-1/caspase-11雙敲除)的小鼠，易受感染而死亡。其次，細胞焦亡有利于胞內致病菌的釋放，并被其他吞噬細胞所吞噬、殺傷而清除，防止致病菌在胞內的繁殖和持續存在。結核分枝桿菌、HIV等導致人類重大疾病的病原微生物，都進化了一套完整的免疫逃逸機制；促進細胞焦亡可能是清除此類病原微生物的一個潛在策略。第三，細胞焦亡是活化巨噬細胞的重要退出機制之一：如果巨噬細胞持續激活而不發生焦亡，其免疫代謝通路已經發生改變，導致脂類沉積，成為泡沫細胞或脂肪巨噬細胞，這些細胞持續不斷地分泌炎癥因子(內源性熱原)和趨化因子，募集其他免疫細胞至病灶組織，將增加動脈粥樣硬化和肥胖癥等慢性炎癥性疾病的風險。因此，增強感染部位的炎癥小體的活化和感染細胞(或被激活細胞)的焦亡，促進成熟IL-1β分泌，可能有利于加強局部炎癥反應，加速清除病原微生物、促進損傷組織的修復和疾病的痊愈。

鑒于炎癥小體通路在固有免疫防御中的重要作用，通過增強炎癥小體的活化，將有助于增強宿主的固有免疫細胞功能，提高抗感染能力，為細菌性感染等相關疾病的治療提供新的途徑。

目前，尚未有關于小檗堿在增強炎癥小體活化的功能的報道。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供小檗堿在制備增強炎癥小體活化藥物中的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

小檗堿在制備增強炎癥小體活化藥物中的應用。

所述增強炎癥小體活化的表現包括如下方面：激活caspase-1，促進炎癥細胞因子分泌、成熟、釋放，誘導細胞焦亡。

所述的炎癥細胞因子為白細胞介素-1β(IL-1β)。

所述的增強炎癥小體活化藥物具有增強固有免疫細胞功能。

所述的增強炎癥小體活化藥物在制備治療系統性細菌感染藥物中的應用。

所述的增強炎癥小體活化藥物在制備治療慢性炎癥性疾病藥物中的應用。

所述的增強炎癥小體活化藥物包含可接受的輔料。

所述的輔料優選為緩釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、吸附載體、表面活性劑或潤滑劑。

所述的增強炎癥小體活化藥物還包含其他起配伍協同作用的有效成分。

所述的增強炎癥小體活化藥物可為片劑、顆粒劑、膠囊、滴丸、緩釋劑、口服液、注射劑。

本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：本發明是基于本發明的發明人首先發現小檗堿具有促進IL-1β分泌和增強固有免疫細胞功能的作用所提出的發明創造。本發明的發明人發現：小檗堿可顯著促進ATP誘導LPS激活的巨噬細胞釋放促炎癥因子IL-1β和危險信號分子HMGB1，增強其殺傷胞內細菌的能力，有效降低腹腔細菌感染引起的死亡。小檗堿的上述新的活性與用途，尚未見公開文獻報道。小檗堿通過增強炎癥小體活化，提高IL-1β分泌，從而增強固有免疫細胞的功能，對臨床治療系統性細菌感染和慢性炎癥性疾病等具有重要意義，可用于相關藥物開發。

附圖說明

圖1是小檗堿(BBR)對LPS+ATP誘導的小鼠巨噬細胞J774A.1炎癥小體激活情況的免疫印跡分析圖。

圖2是小檗堿(BBR)對LPS+ATP誘導的小鼠巰基乙酸鹽(TG)誘導的腹腔巨噬細胞炎癥小體激活情況的免疫印跡分析圖。

圖3是小檗堿(BBR)對LPS+ATP誘導的小鼠骨髓來源巨噬細胞(BMDM)炎癥小體激活情況的免疫印跡分析圖。

圖4是小檗堿(BBR)促進小鼠巨噬細胞J774A.1細胞對吞噬細菌的殺傷作用的統計結果圖；*表示P<0.05。

圖5為小檗堿(BBR)降低腹腔細菌感染小鼠的死亡率的統計結果圖；***表示P<0.001。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。

鹽酸小檗堿(純度>98％)(產品編號B3251)、脂多糖(LPS)(產品名稱Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111:B4，目錄號:L4391)、ATP(目錄號：A6419)、二甲基亞砜(DMSO)(目錄號：D8418)、Tween-80(目錄號：P8074)均購自Sigma-Aldrich公司；體外細胞實驗小檗堿溶于DMSO，體內實驗小檗堿(5mg/mL)溶于含2％(v/v)Tween-80的PBS溶液(pH＝7.4)。細胞培養基DMEM、胎牛血清(FBS)等細胞培養用物質均為Thermo/Gibco公司產品。所用IL-1β抗體(目錄號：#12242)、HMGB1抗體(目錄號：#3935)、β-微管蛋白(tubulin)抗體(目錄號：#2128)均為Cell Signaling Technologies公司產品。抗caspase-1p10抗體(目錄號：sc-514)為Santa Cruz Biotechnology公司產品

實施例1

(1)細胞培養和處理

小鼠巨噬細胞J774A.1購自中國科學院上海細胞庫，培養于含10％(v/v)胎牛血清和含100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM(完全培養基)中。待細胞長至對數生長期，接種于6孔板中，細胞密度為2.5×10⁵/孔(2mL培養基)，培養24小時。然后換液，加入含500ng/mL LPS的完全培養基(2mL)，預處理4小時，激活J774A.1細胞，再經含不同濃度的小檗堿(1.5、3、6μmol/L)和0.1％(v/v)FBS的DMEM培養基(1.2mL)處理1小時，最后補加含ATP的DMEM培養基(ATP終濃度為3mmol/L)0.8mL處理1小時。

(2)上清中caspase-1和HMGB1的檢測方法

細胞經上述處理后，吸取培養上清，經200×g離心5分鐘，上清轉移至另一離心管中，先后分別加入脫氧膽酸鈉(使其終濃度為0.15％(w/v))和三氯乙酸(TCA)(使其終濃度為7.2％(v/v))混合均勻后，在4℃沉淀蛋白過夜。然后經14000×g離心30分鐘，棄上清。沉淀加入700μL冷丙酮(-20℃)，充分懸浮、清洗沉淀中的TCA。離心后，棄上清；使沉淀中殘余的丙酮在常溫下揮發，最后用蛋白電泳樣品液溶解。煮沸5分鐘，經上述處理后的蛋白，用免疫印跡方法檢測。

(3)實驗結果

炎癥小體激活程度以pro-caspase-1(45kDa)和HMGB1釋放反映。結果如圖1所示，細胞培養上清中pro-caspase-1和HMGB1的表達水平隨BBR的劑量增加而升高，小檗堿(BBR)劑量依賴性地促進LPS+ATP誘導的小鼠巨噬細胞J774A.1細胞炎癥小體活化。

實施例2

(1)細胞培養和處理

C57BL/6小鼠，雌性，6-8周齡，購自南方醫科大學實驗動物中心。適應性養殖一周后，經1mL含3％(w/v)巰基乙酸鹽(Thioglycollate，TG)的PBS溶液腹腔注射刺激4天后，頸椎脫臼處死，用PBS溶液洗出其腹腔游離細胞。培養于含10％FBS和含100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養基的6孔板中，細胞密度為2.5×10⁶/孔(2mL培養基)，培養24小時。然后換液，加入含500ng/mL LPS的完全培養基(2mL)預處理4小時，激活腹腔巨噬細胞，再經含不同濃度的小檗堿(0.75、1.5、3.0μmol/L)的培養基(1.2mL)處理1小時，最后補加ATP(使其終濃度為2mmol/L)處理30分鐘。

(2)上清中caspase-1和IL-1β的檢測方法

細胞經上述處理后，吸取培養上清1.2mL，經200×g離心5分鐘，上清轉移至另一離心管中，先加入21μL的10％(w/v)脫氧膽酸鈉溶液(終濃度為0.15％(w/v))，搖勻后，再加入94μL的100％三氯乙酸(終濃度為7.2％(v/v))混合均勻后，在4℃沉淀蛋白過夜。然后經14000×g離心30分鐘，棄上清。沉淀加入700μL冷丙酮(-20℃)，洗去沉淀中的三氯乙酸；14000×g離心5分鐘。棄上清，用上述冷丙酮(-20℃)重復洗兩次。最后一次洗滌離心后，棄上清；使沉淀中殘余的丙酮在常溫下揮發，最后用蛋白電泳樣品液溶解。煮沸5分鐘，經上述處理后的蛋白，用免疫印跡方法檢測。

(3)實驗結果

炎癥小體激活程度以caspase-1(p10片段)活化水平和IL-1β釋放反映。結果如圖2所示，細胞培養上清中活化caspase-1(p10)和IL-1β的表達水平隨BBR的劑量增加而升高，小檗堿(BBR)劑量依賴性地促進LPS+ATP誘導的小鼠腹腔巨噬細胞炎癥小體活化。

實施例3

(1)細胞培養和處理

小鼠成纖維細胞L929細胞購自中國科學院昆明動物研究所細胞庫。細胞培養方法參照Monack實驗室的操作程序(Stanford)，將1×10⁸個細胞培養于底面積為500cm²的三層培養瓶中，培養基為DMEM完全培養基(200mL)。

小鼠骨髓來源的巨噬細胞(BMDM)的培養方法：C57BL/6小鼠，6-8周，雌性，購自南方醫科大學實驗動物中心。經頸椎脫臼處死后，取其大腿骨，用注射器將骨髓細胞用DMEM培養基沖出。得到的細胞用BM-Mac培養基(80％(v/v)DMEM完全培養基+20％(v/v)L929細胞培養上清)，培養于細菌培養皿(密度為5×10⁶個細胞/皿，培養基體積為8-10mL)。培養3天，添加10mL新的培養基；培養第5天，替換為上述新鮮培養基。培養第7天，收集細胞，培養于含10％(v/v)FBS和含100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM(完全培養基)的6孔板中，細胞密度為2.3×10⁶個/孔(2mL培養基)，培養24小時。然后換液，加入含500ng/mL LPS的完全培養基(2mL)預處理4小時，激活BMDM細胞，再經含不同濃度的小檗堿(0.75、1.5、3.0μmol/L)的培養基(1.2mL)處理1小時，最后補加ATP，使ATP在培養基的終濃度為2mmol/L，處理30分鐘。

(2)上清中caspase-1和IL-1β的檢測方法

細胞經上述處理后，吸取培養上清1.2mL，經200×g離心5分鐘，上清轉移至另一離心管中，先加入21μL的10％脫氧膽酸鈉溶液(終濃度為0.15％(w/v))，搖勻后，再加入94μL的100％三氯乙酸(終濃度為7.2％(v/v))混合均勻后，在4℃沉淀蛋白過夜。然后經14000×g離心30分鐘，棄上清。沉淀加入700μL冷丙酮，洗去沉淀中的三氯乙酸；14000×g離心5min，棄上清，用上述冷丙酮重復洗兩次。最后一次洗滌離心后，棄上清；使沉淀中殘余的丙酮在常溫下揮發，最后用蛋白電泳樣品液溶解。煮沸5分鐘，經上述處理后的蛋白，用免疫印跡方法檢測。

(3)實驗結果

炎癥小體激活程度以caspase-1(p10片段)活化水平和IL-1β釋放反映。結果如圖3所示，細胞培養上清中活化caspase-1(p10)和IL-1β的表達水平隨BBR的劑量增加而升高，小檗堿(BBR)劑量依賴性地促進LPS+ATP誘導的小鼠腹腔巨噬細胞炎癥小體活化。

實施例4

(1)細菌培養

大腸桿菌(DH5α)在Luria Broth(LB)培養基中搖菌過夜(37℃)，次日按10％菌液在新鮮培養基中繼續搖菌擴增3小時(37℃)。擴增后的菌液在1824×g離心力下離心10分鐘，PBS洗滌后，重懸于PBS溶液備用。細菌密度用微量紫外分光光度計(Nanodrop 2000；Thermo Scientific)測定；對應的菌落形成單位(colony forming units,CFU)由傳統LB瓊脂糖平板涂布培養確定。

(2)細菌殺傷

小鼠單核巨噬細胞J774A.1細胞培養于含10％FBS的DMEM完全培養基中。待細胞長至對數生長期，種于24孔板中，細胞密度為3.5×10⁴/孔(500μL培養基)，培養24小時。換液并用DMEM進行洗滌兩次后，在無抗生素的培養液中加入2.8×10⁵CFU的活大腸桿菌，使細胞吞噬細菌2小時；將不同濃度的小檗堿(BBR，1.5、3、6、12μmol/L))配制于含抗生素的培養液中繼續培養6小時后，換液并用前述不含抗生素的DMEM進行洗滌兩次；最后，以200μL濃度為0.5％(v/v)Triton X-100，常溫下裂解細胞5分鐘，由此得到的細胞裂解液以PBS稀釋10倍后，取100μL進行LB瓊脂板涂布，置于37℃培養箱，培養24小時后對長出的菌落進行計數。各組間菌落數的差異分析采用方差分析和Tukey檢驗，P<0.05視為差異有統計意義。

(3)結果

結果如圖4所示，小檗堿(BBR)可促進J774A.1細胞對吞噬細菌的殺傷作用。*表示P<0.05。

實施例5

(1)細菌培養

大腸桿菌DH5α在Luria Broth(LB)培養基中搖菌過夜(37℃)，次日按10％菌液在新鮮培養基中繼續搖菌擴增3小時(37℃)。擴增后的菌液在1824×g離心力下離心10分鐘，PBS洗滌后，重懸于PBS溶液備用。細菌密度用微量紫外分光光度計(Nanodrop 2000；Thermo Scientific)測定；對應的菌落形成單位(CFU)由傳統LB瓊脂糖平板涂布培養確定。

(2)動物實驗

C57BL/6小鼠(購自南方醫科大學實驗動物中心)，在本實驗室適應性養殖一周后，按100mg/kg體重的劑量將含小檗堿的PBS溶液預灌胃3天(每天一次)后，腹腔接種大腸桿菌(2×10⁹CFU/只)，在接下來的96小時內，每6小時觀察記錄小鼠存活情況，并繪制小鼠Kaplan-Meier生存曲線分析存活率。小鼠存活率的差異分析采用Long-rank檢驗，P<0.05視為差異有統計意義。

(3)實驗結果

結果如圖5所示，大腸桿菌感染可導致小鼠因感染而死亡；而小檗堿(BBR)可有效降低腹腔細菌感染小鼠的死亡率。***表示P<0.001。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。