本發明屬于中藥制劑領域，涉及益母草堿的藥用新用途，具體涉及益母草堿在制備治療或預防抑郁癥藥物中的應用。

背景技術：

抑郁癥是一種復雜的、持久的情感障礙類疾病，又稱之抑郁障礙，其主要臨床表現以顯著而持久的心境低落、興趣缺失、情緒的消沉、甚至悲觀厭世，企圖自殺等行為。據統計，自2004年起抑郁癥已經成為人類第三大頑癥，預計至2030年抑郁癥可能成為影響人類生活的第一大疾病。

大量研究顯示，抑郁癥除社會環境諸多因素外，尚存在單胺類神經遞質缺乏，丘腦-垂體-腎上腺皮質(HPA)軸亢進，腦內神經營養因子缺乏，神經炎癥等病理假說。臨床應用的抗抑郁藥主要針對單胺類神經遞質缺乏這一病理機制，包括單胺氧化酶抑制劑，選擇性5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)再攝取抑制劑、選擇性去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)再攝取抑制劑和三環類抗抑郁藥等，上述藥物雖然具有較好的治療作用，已在臨床上得到廣泛的應用，但大多存在藥效弱、起效慢、不良反應大、作用時間短等缺陷，如目前臨床常用的是三環類抗抑郁藥丙米嗪、選擇性5-HT再攝取抑制劑氟西汀(Fluoxetine,FLX)。迄今，大約三分之一的抑郁癥患者對傳統的抗抑郁治療無效。闡明抗抑郁作用新機制、尋找抗抑郁治療新靶點、研發新的有效的治療藥物依然是神經科學研究的難點與重任。近年來，從中藥/天然藥物中開發抗抑郁制劑有望成為突破方向之一。

益母草屬中藥唇形科益母草(Leonurus japonicas houtts)屬植物，始載于《神農本草經》，中醫藥文獻中記載其功能主治為活血、調經、祛瘀、消水，素有“血脈圣藥”、“經產良方”之稱。自1990年以來，益母草已被列入中華人民共和國藥典，超過300種含有益母草的處方被用于治療各種疾病，其藥理作用主要是對婦產科和心血管方面的保護。有研究報道指出益母草對孕期婦女的焦慮具有保護作用；益母草混合提取物對缺血性中風模型大鼠具有保護作用(中國專利申請號：20101087017.4)。益母草堿(Leonurine)作為益母草中主要的有效生物堿，現代藥理研究界已證明益母草堿具有興奮子宮、溶栓、抗凝、降血黏度、降脂、降低紅細胞聚集、抑制血小板聚集、改善微循環、抗氧自由基、抗炎、減少細胞內鈣超載等諸多藥理作用，為其臨床應用提供了可靠的理論基礎。近年來研究報道指出益母草堿有許多非同于傳統適應癥的藥物作用如抗糖尿病，心血管保護，腦卒中治療，以及在腎臟損傷中發揮著重要作用。

然而，至今益母草堿對抑郁癥的效應尚未見報道，本發明通過相關實驗研究，從多方面確證益母草堿作為防治抑郁癥藥物應用的可能。

技術實現要素：

發明目的：為了解決上述技術問題，本發明的目的在于提供了益母草堿在制藥中的新用途，具體涉及益母草堿在制備預防或治療抑郁癥藥物中的應用。

本發明的益母草堿是基于中草藥益母草的活性單體益母草堿的結構經化學合成得到，其分子式為C₁₄H₂₁N₃O₅,分子量為311.33，熔點為238℃，具體結構式如下：

本發明應用慢性溫和性應激(Chronic mild stress，CMS)模型誘導小鼠抑郁樣行為，觀察益母草堿對CMS小鼠抑郁樣行為影響，實驗結果顯示，益母草堿顯著改善CMS小鼠的抑郁樣行為，表現為糖水偏愛率(SPT)顯著升高，強迫游泳(FST)和懸尾實驗(TST)小鼠的不動時間顯著縮短。

本發明應用高效液相色譜技術觀察益母草堿對CMS小鼠腦內單胺類神經遞質的影響。實驗結果顯示，益母草堿顯著增加CMS小鼠腦內單胺類神經遞質5-HT、NE、多巴胺(Dopamine，DA)的含量。

本發明應用尼氏染色、透射電鏡技術觀察益母草堿對CMS小鼠海馬神經元的影響。尼氏染色結果顯示，益母草堿顯著改善CMS抑郁小鼠海馬區神經元形態和結構；透射電鏡結果顯示，益母草堿顯著改善CMS小鼠海馬神經元損傷及神經元髓鞘結構異常。

本發明應用免疫熒光法觀察益母草堿對CMS小鼠海馬星形膠質細胞的影響，實驗結果顯示，益母草堿顯著增加CMS小鼠海馬星形膠質細胞的數量，具有改善腦內微環境的可能。

本發明應用Western Blot方法檢測益母草堿對CMS小鼠海馬炎癥相關因子IL-1β、IL-6、TNF-а、NF-ΚB信號通路及神經營養因子BDNF、GDNF的影響。實驗結果顯示，益母草堿顯著抑制CMS小鼠腦內神經炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-а的蛋白表達及NF-ΚB信號通路的激活，升高神經營養因子BDNF、GDNF的水平。

本發明中所述的益母草堿，包含但不僅限于益母草堿及其鹽，包含且不僅限于在單組分及復方制劑中的應用。本發明所述的預防或治療抑郁癥藥物的劑型包含且不僅限于片劑、膠囊、緩釋片、控釋片、口服液、糖漿、滴丸、注射液劑型、凍干粉針劑型等。

已知抑郁癥發病機制復雜，可能涉及多系統、多環節功能失調或障礙。本發明運用多系統、多角度的研究，綜合闡明益母草堿對抑郁癥的預防與治療作用及其機制。由本發明所述可知，益母草堿改善CMS小鼠抑郁樣行為的作用，與其增加腦內單胺類神經遞質，抑制神經炎癥，增加神經營養因子，調節星形膠質細胞改善腦內微環境等有關。

本發明內容還包括益母草堿在構建CMS動物模型中的應用。

本發明內容還包括益母草堿在構建CMS小鼠模型中的應用。

作為優選，本發明中每kg的CMS小鼠每天益母草堿的劑量為30mg～60mg。

由本發明中所述益母草堿防治CMS小鼠抑郁有效劑量推算至臨床成人每日用量范圍約為50～300mg。

有益效果：本發明中所述益母草堿通過調整抑郁癥多個病理環節從而發揮抗抑郁作用，且安全性高(口服最大耐受劑量>5g/kg)，有望超越目前作用于單一靶點的治療藥物。

附圖說明

圖1：益母草堿對CMS小鼠糖水偏愛率的影響。實驗期間每周的糖水偏愛率以均數±標準誤表示，n＝11～13，^*P＜0.05，^**P<0.01，與同時期對照組比較；^#P＜0.05，^##P<0.01，與同時期模型組比較。CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；FLX，氟西汀；

圖2：益母草堿對CMS小鼠強迫游泳實驗的影響。數值以均數±標準誤表示，n＝8～12，^*P＜0.05，^**P<0.01，與同時期對照組比較；^#P＜0.05，^##P<0.01，與同時期模型組比較；CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；FLX，氟西汀；

圖3：益母草堿對CMS小鼠懸尾實驗的影響。數值以均數±標準誤表示，n＝8～12，^*P＜0.05，^**P<0.01，與同時期對照組比較；^#P＜0.05，^##P<0.01，與同時期模型組比較；CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；FLX，氟西汀；

圖4：益母草堿對CMS小鼠腦內單胺類神經遞質5-HT、NE、DA的影響(A-F)；數值以均數±標準誤表示，n＝7～9；其中圖4A-4C是海馬腦區5-HT、NE、DA的實驗結果；圖4E-4F是前額葉皮層5-HT、NE、DA的實驗結果；^*P＜0.05，^**P<0.01，與同時期對照組比較；^#P＜0.05，^##P<0.01，與同時期模型組比較；CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；FLX，氟西汀；

圖5：益母草堿對CMS小鼠海馬神經元形態的影響(A-B)(×100)；其中圖5A是海馬DG區尼氏染色實驗結果；圖5B是海馬CA3區尼氏染色實驗結果；n＝7～9，CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；

圖6：益母草堿對CMS小鼠海馬神經元損傷的影響；其中是圖6(A-C)是神經元透射電鏡實驗結果(×1900)；圖6(D-F)分別是圖(A-C)放大的透射電鏡實驗結果(×11000)；n＝3，線粒體(arrows)，CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；

圖7：益母草堿對CMS小鼠海馬神經元髓鞘的影響；其中是圖7A是透射電鏡實驗結果(×1900)；圖7B是各組的G-比率即髓鞘的內徑/外徑(n>100)；CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；

圖8：益母草堿對CMS抑郁模型小鼠海馬星形膠質細胞的影響(×100)；其中圖8A是星形膠質細胞特異性marker GFAP的免疫熒光的實驗結果；圖8B是星形膠質細胞GFAP陽性細胞計數的實驗結果；^*P＜0.05，^**P<0.01，與同時期對照組比較；^#P＜0.05,^##P<0.01，與同時期模型組比較；n＝5，CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；

圖9：益母草堿對CMS小鼠海馬炎癥相關因子IL-1β、IL-6、TNF的影響；其中，數據用目的蛋白和內參β-actin相比；^*P＜0.05，^**P<0.01，與同時期對照組比較；^#P＜0.05，^##P<0.01，與同時期模型組比較；n＝3，CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；FLX，氟西汀；

圖10：益母草堿對CMS小鼠海馬NF-ΚB信號通路的影響；數據用目的蛋白和內參β-actin相比；^*P＜0.05，^**P<0.01，與同時期對照組比較；^#P＜0.05，^##P<0.01，與同時期模型組比較；n＝3，CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；FLX，氟西汀；

圖11：益母草堿對CMS小鼠海馬神經營養因子BDNF、GDNF的影響；數據用目的蛋白和內參β-actin相比；^*P＜0.05，^**P<0.01，與同時期對照組比較；^#P＜0.05，^##P<0.01，與同時期模型組比較；n＝3，CON，正常小鼠；CMS，CMS小鼠；Leonurine，益母草堿；FLX，氟西汀。

具體實施方式：

實驗材料和儀器：

實驗材料：益母草堿，白色粉末，純度＞99.0％，復旦大學藥學院提供。氟西汀(fluoxetine)購于sigma公司。標準品使用情況如下：去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、購自美國sigma公司。抗體使用情況如下：兔抗Bax、兔抗Bcl-2，兔抗Phospho-IKKα/β(Ser176/180)(16A6)，兔抗IKKβ(D30C6)，兔抗Phospho-NF-κB p65(Ser536)(93H1)，兔抗NF-κB p65(D14E12)購自美國Cell Signaling Technology公司；山羊抗IL-1β，小鼠抗β-actin購自美國Sigma公司，兔抗TNF-a，兔抗IL-6購自abcam公司，兔抗BDNF(N-20)，兔抗GDNF購自Santa Cruz Biotechnology公司。

實驗儀器：Forced Swim ScanTM(Clever Sys Inc.，VA，USA)；Tail Susp ScanTM(Clever Sys Inc.，VA，USA)，Thermo ultimate 3000高效液相色譜儀(Thermo，USA)，Image Quant LAS 4000化學發光成像分析儀(GE，USA)，透射電鏡(JEM-1010，Tokyo，Japan)，體視學系統(MBF，USA)。

小鼠來源：雄性C57BL/6J小鼠，體重18～22g，2～3月齡，購自揚州大學比較醫學中心(動物生成許可證號為SCXR(蘇)20120004)。

本發明中所有實施例中的30mg/kg/day或60mg/kg/day指的是每kg小鼠每天劑量為30mg或60mg。

實施例1：益母草堿對CMS小鼠抑郁樣行為的改善作用

本發明采用國際學術界公認的制備嚙齒類動物抑郁癥的CMS抑郁模型。雄性C57BL/6J小鼠，體重18～22g，2～3月齡，購自揚州大學比較醫學中心(動物生成許可證號為SCXR(蘇)20120004)。適應性飼養1周后，正常對照組小鼠正常攝食飲水，不給予任何刺激，應激小鼠每天進行兩種或三種隨機、溫和不可預測的刺激，直至抑郁樣癥狀的出現。CMS方法包含一系列不可預知的慢性溫和應激包括：夾尾、晝夜顛倒、45°斜籠(6h)、束縛(12h)、濕籠(12h)、空籠(10-14h)、食水剝奪(15h)、配對(2h)、更換墊料、頻閃照明12h等，同種刺激不能連續給予。每只小鼠每周測量一次糖水偏愛率。小鼠進行慢性溫和刺激至第6周，灌胃給予益母草堿(30mg/kg/day或60mg/kg/day)持續4周。于末次給藥結束后1h，進行糖水偏好、強迫游泳和懸尾實驗評價益母草堿對CMS小鼠行為學的影響。實驗結果進行單因素方差分析。

糖水偏愛實驗結果(表1，附圖1)顯示，CMS刺激小鼠進行至第6周糖水偏愛率降低20.14％±1.08％，與正常對照組比較具有顯著差異(P<0.001)，給予益母草堿各組小鼠糖水偏愛率逐周增加，至第4周時，60mg/kg/day益母草堿組小鼠糖水偏愛率增加較CMS組增加了8.12％±0.87％，具有顯著性差異(P<0.05)。小鼠強迫游泳試驗結果(表2，附圖2)顯示：給予CMS刺激，小鼠強迫游泳的不動時間增加174.55％±4.53％，具有顯著差異(P<0.001)，益母草堿縮短CMS小鼠不動時間，其中60mg/kg/day益母草堿小鼠的不動時間縮短31.85％±2.13％，具有顯著性差異(P<0.05)；小鼠懸尾試驗結果(表2，附圖3)顯示：給予CMS刺激，小鼠懸尾不動時間增加83.11％±3.77％，具有顯著差異(P<0.01)，益母草堿縮短CMS小鼠懸尾不動時間，其中60mg/kg/day益母草堿小鼠的不動時間縮短28.93％±0.31％，具有顯著性差異(P<0.05)。提示，益母草堿具有改善CMS小鼠抑郁樣行為的作用。

表1小鼠糖水偏愛率(％)

注：^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001vs正常對照組，^#p<0.05，^##p<0.01vs CMS模型組Mean±S.E.M.

表2小鼠強迫游泳與懸尾實驗的不動時間

注：^***p<0.001vs正常對照組，^#p<0.05，^##p<0.01vs CMS模型組Mean±S.E.M.

實施例2：益母草堿對CMS小鼠腦內單胺類神經遞質的影響

本部分采用實施例1所述CMS抑郁模型，至第6周，灌胃給予益母草堿(30mg/kg/day或60mg/kg/day)，持續4周。末次給藥后1h深麻醉小鼠，迅速剝離腦組織，分離海馬和前額葉皮層，加入勻漿液(0.1M HClO₄，0.1mM EDTA)勻漿，離心(20,000rpm，30min)，取上清，Thermo ultimate 3000高效液相色譜系統(HPLC)檢測各樣本中單胺類神經遞質5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)含量。

海馬區單胺遞質測定結果(表3、附圖4A-4C)所示，與正常對照組比較，CMS應激小鼠5-HT、NE、DA的含量分別降低35.73％、27.91％、37.38％，具有顯著性差異(P<0.001，P<0.01，P<0.05)；連續給予4周60mg/kg益母草堿組小鼠海馬5-HT、NE、DA的含量較CMS組分別升高40.99％、35.50％、52.42％，具有顯著性差異(P<0.05)。前額葉皮層單胺遞質測定結果(表4、附圖4D-4F)所示，CMS應激小鼠5-HT、NE、DA的含量分別降低42.55％、37.68％、57.31％，具有顯著性差異(P<0.001，P<0.001，P<0.01)，給藥組5-HT、NE、DA的含量較CMS組分別升高21.37％、28.65％、68.30％，具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01，P<0.05)。提示，益母草堿增加CMS小鼠腦內5-HT、NE、DA等單胺類神經遞質含量，改善單胺類神經遞質的異常。表3小鼠海馬區單胺類神經遞質含量(ng/g濕組織)

注：^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001vs正常對照組，^#p<0.05，^##p<0.01vs CMS模型組Mean±S.E.M.

表4小鼠前額葉皮層單胺類神經遞質含量(ng/g濕組織)

注：^**p<0.01，^***p<0.001vs正常對照組，^#p<0.05，^##p<0.01vs CMS模型組Mean±S.E.M.

實施例3：益母草堿對CMS小鼠腦內神經元、膠質細胞的影響

本部分采用實施例1所述CMS抑郁模型，至第六周，灌胃給予益母草堿(30mg/kg/day或60mg/kg/day)，持續4周。末次給藥后1h深麻醉小鼠，4％多聚甲醛灌注，梯度蔗糖脫水，腦組織進行冰凍切片，根據腦圖譜挑選海馬腦片進行尼氏染色觀察海馬神經元形態、結構；此外，于4％(質量百分比)多聚甲醛灌注后，分離海馬于2.5％(質量百分比)戊二醛中后固定，電鏡標本制樣，透射電鏡下觀察海馬區神經元的超微結構；應用免疫熒光法檢測海馬區星形膠質細胞，結合MBF體視學系統計數GFAP陽性細胞數。

尼氏染色結果(圖5)顯示，正常對照組，小鼠海馬齒狀回(DG)和CA3區神經元排列緊密，神經元胞體較大，細胞核大而圓，尼氏體豐富；CMS模型組小鼠海馬DG和CA3區神經元錐體細胞層變薄，細胞間隙大，排列疏松，細胞體積變小，尼氏體減少；益母草堿(60mg/kg/day)組小鼠海馬DG和CA3區神經元的排列、胞體大小、胞核形態及尼氏體數目均接近正常(附圖6C)。提示，益母草堿能夠改善CMS小鼠腦內神經元形態。

透射電鏡觀察(圖6)結果所示，正常對照組神經元胞體大小正常，表面光滑，細胞核呈卵圓形，兩層膜結構清晰，核染色質分布均勻，胞漿內細胞器豐富，結構完整，線粒體呈圓形或橢圓形，內嵴清晰可見(6A，6D)；CMS模型組神經元胞體變小，核異染色質增多，呈塊狀并向邊緣聚集；核周間隙增寬；胞質內線粒體腫脹，少量呈空泡樣；部分線粒體內嵴模糊(6B，6E)。益母草堿(60mg/kg/day)組神經元胞體基本正常，核內異染色質輕度增加，核周間隙基本正常，核緣光滑；線粒體結構基本完整，少見線粒體腫脹(圖6C，圖6F)。提示，益母草堿改善CMS小鼠海馬區神經元結構，減輕神經元損傷。

神經髓鞘是神經元之間相互作用的關鍵調解物，髓鞘結構異常間接地導致神經元損失或死亡，影響大腦突觸結構和空間記憶，是海馬功能的結構基礎。本發明采用透射電鏡技術檢測海馬髓鞘結構，結果如圖7A所示，正常對照組海馬區神經元髓鞘形狀和結構正常，具有密集的質膜環；模型組出現髓鞘結構異常表現為髓鞘松散排列、髓鞘變薄等組織損傷的跡象，益母草堿(60mg/kg/day)組髓鞘結構則趨于正常。應用髓鞘內直徑與總外徑的比值(G比率)作統計學分析，結果顯示(表5，圖7B)CMS模型組較正常對照組增加25.37％，具有顯著差異(P<0.001)；益母草堿(60mg/kg/day)組與正常對照組相近，較CMS組G比率降低15.48％，具有顯著差異(P<0.01)。提示，益母草堿能夠改善CMS小鼠腦內神經元結構。

表5各組小鼠髓鞘g-比率(髓鞘的內徑/外徑)

注：^***p<0.001vs正常對照組，^##p<0.01vs CMS模型組Mean±S.E.M.

星形膠質細胞是構成腦實質的重要組成部分，不僅為神經元提供多種營養支持物質，在突觸重塑，神經細胞再生，調節神經細胞外離子、神經遞質及代謝物等方面也起著重要作用，抑郁癥患者海馬區星形膠質細胞顯著減少。本實施例應用免疫熒光化檢測益母草堿對CMS小鼠星形膠質細胞的影響，結果(表6，圖8)顯示：與正常對照組比較，CMS模型組小鼠海馬DG區星形膠質細胞表達減少(8A)，膠質纖維酸性蛋白(GFAP)(星形膠質細胞特異性的標志物)陽性細胞數量減少36.09％(8B)，具有顯著差異(P<0.01)；益母草堿(60mg/kg/day)組小鼠星形膠質細胞數量較模型組增加31.20％，具有顯著差異(P<0.05)。提示，益母草堿具有增加腦內星形膠質細胞，顯著改善神經元生存微環境的作用。

表6各組小鼠海馬DG區星形膠質細胞數量

注：^**p<0.01vs正常對照組，^#p<0.05vs CMS模型組Mean±S.E.M.

實施例4：益母草堿對CMS小鼠腦內神經炎癥的影響

本部分采用實施例1所述CMS抑郁模型，至第6周，灌胃給予益母草堿(30mg/kg/day或60mg/kg/day)，持續4周。末次給藥后1h深麻醉小鼠，迅速分離海馬組織，加入蛋白裂解液，組織蛋白提取，應用Western blot方法檢測小鼠海馬神經炎癥相關因子IL-1β、IL-6、TNF的蛋白表達及NF-ΚB信號通路的變化。將海馬組織稱重后，按1:10(w/v)加入RIPA裂解液，進行組織勻漿，冰上裂解30min，16000rpm×4℃×15min，吸取上清。取1μL進行BCA蛋白定量(碧云天，上海)，余下上清蛋白按照體積比加入5X上樣緩沖液95℃下變性5min，分裝后-20℃保存。根據BCA定量結果，取40μg樣品/泳道上樣，根據蛋白的分子量選擇濃度制備SDS-PAGE膠進行恒壓(80-120V)凝膠電泳分離，300mA恒流下電轉70-120min至PVDF膜(Millipore，USA)。5％(質量百分比脫脂奶粉的TBST(pH7.4，10mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％Tween-20)室溫下震蕩封閉1h，加入5％(質量百分比)BSA-TBST配制的一抗：兔抗Phospho-IKKα/β(Ser176/180)(16A6)(1:1000，CST，2697)，兔抗IKKβ(D30C6)(1:1000，CST，8943)，兔抗Phospho-NF-κB p65(Ser536)(93H1)(1:1000，CST，3033)，兔抗NF-κB p65(D14E12)(1:1000，CST，8242S)，兔抗Bcl-2(1:1000，CST，2876)，兔抗Bax(1:1000，CST，2772)，山羊抗IL-1β(1:1000，sigma，13767，)，兔抗TNF-a(1:1000，Abcam，ab9739)，兔抗IL-6(1:1000，Abcam，ab83339)，兔抗BDNF(N-20)(1:1000，Santa Cruz，sc-546)，兔抗GDNF(1:1000，Santa Cruz，sc-328)，小鼠抗β-actin(1:1000，Sigma，A5441)。4℃孵育過夜。TBST漂洗10min 3遍，加入辣根過氧化物酶標記的二抗：山羊抗兔-HRP(1:800，KPL)，山羊抗小鼠-HRP(1:800，KPL)，兔抗山羊-HRP(1:800，KPL)，室溫孵育60min，加入ECL(Pierce)化學發光底物顯色。用Image Quant LAS 4000化學發光成像分析儀顯影分析；將磷酸化蛋白激酶灰度值與各自總蛋白激酶灰度值進行比較判斷磷酸化程度，用目的蛋白灰度值與各自內參β-actin灰度值之比進行半定量分析(Image J.)。以上的1:1000均指的是稀釋1000倍。

結果顯示(附圖9、圖10)。與正常小鼠組比較，CMS小鼠海馬炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-а的蛋白表達(附圖9)及IKKβ和P65的磷酸化水平(附圖10)顯著升高。益母草堿組較CMS組海馬炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-а的蛋白水平及IKKβ和P65的磷酸化水平降低，其中60mg/kg/day益母草堿具有顯著性差異(P<0.01)。提示，益母草堿抑制CMS小鼠腦內NF-ΚB信號通路的激活，從而抑制炎癥反應。

實施例5：益母草堿對CMS小鼠腦內神經營養因子的影響

本部分采用實施例1所述CMS抑郁模型，至第六周，灌胃給予益母草堿(30mg/kg/day或60mg/kg/day)，持續4周。末次給藥后1h深麻醉小鼠，迅速分離海馬組織，加入蛋白裂解液，組織蛋白提取，應用Western blot方法(同實施例4)檢測小鼠海馬區神經營養因子BDNF、GDNF的蛋白水平。

結果如圖11所示，CMS小鼠海馬神經營養因子BDNF、GDNF蛋白水平顯著降低，益母草堿(60mg/kg/day)組BDNF、GDNF蛋白水平較CMS組升高具有顯著性差異(P<0.05)。提示，益母草堿能夠顯著恢復CMS小鼠腦內神經營養因子水平。