本發明屬于分子探針技術領域，涉及一種分子探針及其制備方法和應用。

背景技術：

細胞自噬是細胞依靠溶酶體將細胞內受損、變性或衰老的蛋白質以及細胞器運輸到溶酶體進行消化降解的過程。正常生理情況下，細胞自噬利于細胞保持自穩狀態；在發生應激時，細胞自噬防止有毒或致癌的損傷蛋白質和細胞器的累積，抑制細胞癌變，維持細胞內環境穩定和代謝平衡。細胞自吞噬在生物體生長發育、細胞分化及對環境應激的應答方面極為關鍵，它參與了細胞生存、死亡、病原體清除、抗原呈遞等過程，并與癌癥、感染、神經退行性疾病等多種疾病相關。因此，研究其作用機制不僅可以進一步了解生命的奧秘，同時也為一些疾病的治療提供新的思路。

對于細胞自噬研究所使用的檢測手段，如TEM,LC3免疫沉淀法，GFP-LC3熒光檢測等方法卻不能提供實時的、定量的檢測數據，并且這些方法不能應用于組織活體水平。因此，開發一種新型材料用于細胞自噬的體內體外檢測對于進行細胞自噬的基礎機理研究以及組織活體水平自噬相關疾病的診斷和治療具有重大意義。

目前已有研究的是基于FRET效應的納米探針，但由于其標記的熒光分子靈敏性不佳特異性不強并且納米顆粒影響細胞的自噬過程，影響了其廣泛應用。CN 103275697 A公開了一種雙芘兩親型熒光探針，該探針能檢測金屬離子，響應速度快、靈敏度高、響應范圍寬，但其無法應用于對細胞的檢測。

聚集誘導發光現象(Aggregation-induced emission,AIE)克服了傳統熒光材料在聚集狀態時熒光淬滅的缺點，顯著提高了生物探針的靈敏性,在生物成像等領域有著廣泛的應用前景。但用于體內細胞自噬成像的具有特異性響應的分子探針還鮮有報道，因而基于熒光分子的AIE特征，研發生物安全性能高、靈敏且特異性強的分子探針作為體內體外細胞自噬的診斷成像劑，將為實現自噬相關疾病的診斷和治療提供了可能。

光聲成像技術是一種非入侵式的新型生物醫學成像方法。當脈沖激光照射到生物組織時，組織的光吸收區域將產生超聲信號，通過探測光聲信號能重建出組織中的光吸收分布圖像。光聲成像結合了純光學組織成像中高選擇性和純超聲組織成像中深穿透特性的優點，可得到高分辨率和高對比度的組織圖像。因此，基于光聲成像技術，研發生物安全性高、靈敏且特異性好的光聲造影劑作為體內組織部位細胞自噬水平檢測的成像劑，將為癌癥的診斷及治療提供有效的解決方案，具有重要的臨床意義。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種分子探針及其制備方法和應用。

為達到此發明目的，本發明采用以下技術方案：

一方面，本發明提供一種分子探針，其特征在于，所述分子探針包括水溶性載體分子、響應性多肽和信號分子；其中，所述響應性多肽的序列為(Xaa)_m(Thr-Phe-Gly-Phe)(Xaa)_nLys(Xaa)_i，其中Xaa表示為任意氨基酸，i,n和m獨立地為0-4；所述水溶性載體分子和信號分子以酰胺鍵與響應性多肽相連。

其中，所述Xaa可以為Ala,Arg,Asp,Cys,Glu,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Phe,Ser,Thr,Trp,Try,Pro,或Met。

其中，所述i可以為0、1、2、3或4；n可以為0、1、2、3或4；所述m可以為0、1、2、3或4。

本發明中，所述響應性多肽是對細胞自噬標志酶ATG4特異響應的，正常環境中，分子探針保持無熒光或低光聲信號的單分子狀態，當細胞自噬激活時，分子探針中多肽被切割并釋放出信號分子，信號分子的聚集特征賦予探針熒光或光聲信號增強的特性。

本發明中，所述響應性多肽被切割的位置為保守序列中(Thr-Phe-Gly-Phe)甘氨酸羧基。

優選地，所述響應性多肽的長度為5-17個氨基酸，例如可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17，優選為6-12個氨基酸，進一步優選為7個氨基酸。

優選地，所述信號分子為具有聚集誘導效應(AIE)的熒光信號分子和/或具有聚集導致光聲信號增強的脂溶性信號分子。

優選地，所述具有聚集誘導效應(AIE)的熒光信號分子為雙芘類衍生物和/或四苯乙烯類化合物，優選為雙芘。

所述雙芘類化合物結構式如下：

所述四苯乙烯類化合物結構式如下：

優選地，所述具有聚集導致光聲信號增強的脂溶性信號分子為共軛環狀結構的卟啉類衍生物，優選為紫紅素-18。

所述紫紅素-18結構式如下：

優選地，所述水溶性載體分子為樹枝狀類超分子和/或超支化類分子，優選為四代樹枝狀分子。

優選地，所述分子探針具有如下式I所示結構：

第二方面，本發明提供一種第一方面所述的分子探針的制備方法，包括以下步驟：

(1)利用Fmoc固相合成方法在不溶于水的樹脂上合成所述響應性多肽；

(2)將響應性多肽與所述信號分子和水溶性載體分子相連。

優選地，步驟(1)所述的不溶于水的樹脂為Wang樹脂。

優選地，所述Wang樹脂的修飾密度為0.3-0.4mM，例如可以是0.3mM、0.31mM、0.32mM、0.35mM、0.36mM、0.38mM或0.4mM，優選為0.35mM。

優選地，步驟(1)的具體步驟包括：

(a)將第一個氨基酸的氨基端用Fmoc保護，羧基端固定于樹脂上；

(b)用六氫吡啶的DMF溶液脫去氨基端的Fmoc保護，下一個賴氨酸使用側鏈氨基為Dde保護的氨基酸，羧基用4-甲基嗎啉和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液進行活化，與脫保護的第一個氨基酸進行縮合反應；

(c)剩余氨基酸的氨基端用Fmoc保護，重復步驟(b)，直到完成所有氨基酸的縮合。

優選地，所述步驟(2)具體包括：將所述信號分子羧基活化，并連接在響應性多肽的氨基端；將響應性多肽中賴氨酸支鏈氨基活化，并連接在所述的載體分子羧基端，再從樹脂上脫除。

優選地，所述響應性多肽中賴氨酸支鏈氨基活化在含0.2％水合肼的DMF溶液中進行。

優選地，所述從樹脂上脫除在4-甲基嗎啉和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液中進行。

第三方面，本發明提供一種如第一方面所述的分子探針用于體內體外細胞自噬酶ATG4的檢測或用于體內體外細胞自噬水平實時定量評估。

優選地，所述細胞為腫瘤細胞。

相對于現有技術，本發明具有以下有益效果：

本發明的分子探針具有良好的水溶性和穩定性，可以自由擴散及胞吞形式進入細胞內部，并通過信號改變強度反映胞內自噬標志酶的活性，進而對體內體外細胞自噬水平進行定量評估。因此本發明的分子探針，不僅具備良好的特異性及信號穩定性，而且豐富了細胞自噬檢測手段，具有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1是實施例1中所述分子的核磁圖譜(1H NMR)；

圖2是實施例1中所述分子單體和聚集體的熒光光譜；

圖3是實施例1中所述分子在不同濃度的分子探針在細胞自噬標志酶ATG4作用下的熒光光譜；

圖4是實施例1中所述分子在雷帕霉素激活細胞自噬的MCF-7細胞模型中的熒光信號；

圖5是實施例1中所述分子在雷帕霉素激活細胞自噬的MCF-7細胞模型中實時成像；

圖6是實施例1中所述分子在雷帕霉素激活細胞自噬的MCF-7細胞模型中對細胞自噬水平的定量評價；

圖7是實施例1中所述分子在MCF-7細胞自噬激活模型(雷帕霉素，饑餓兩小時)和抑制模型(3甲基嘌呤，巴伐洛霉素)中的熒光成像；

圖8是實施例1中所述分子在活體水平上細胞自噬激活模型中的熒光成像；

圖9是實施例2中所述分子在活體水平上細胞自噬激活模型中的光聲成像。

具體實施方式

下面通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案。本領域技術人員應該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發明，不應視為對本發明的具體限制。

實施例1：分子探針的制備

1、以AIE效應的雙芘分子探針為例，響應性多肽序列為：

Gly-Lys-Gly-Ser-Phe-Gly-Phe-Thr-Gly。

多肽合成采用Fmoc固相合成法合成：(1)合成選用0.35mM修飾密度的Wang樹脂，其中第一個氨基酸(甘氨酸)C端被固定于樹脂上，N端被Fmoc保護，用20％(v/v)的六氫吡啶的DMF溶液脫去Fmoc保護，然后用茚三酮測試法測試去保護結果；

(2)將下一個氨基酸的羧基用0.4M的4-甲基嗎啉和0.4M的苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液活化，并加入到脫去保護的樹脂中反應2小時，其中第二個氨基酸采用側鏈氨基為Dde保護的賴氨酸，完成所有序列氨基酸的反應后，將雙芘分子作為最后一個氨基酸重復上述步驟偶聯在多肽的N端；

(3)將0.2％水合肼脫除第二個氨基酸(賴氨酸)的側鏈氨基保護，將四代羧基樹枝狀分子偶聯在賴氨酸側鏈氨基上，再用含有2.5％水和2.5％三異丙基硅烷的三氟乙酸溶液將合成好的多肽從樹脂上脫除，同時脫除其他氨基酸的側鏈保護，將三氟乙酸用旋轉蒸發法去除，然后產物用無水乙醚沉淀，洗滌并干燥，得到本發明所述的分子探針。

上述方法所得到的AIE效應的雙芘分子探針的化學結構如下：

其核磁圖譜如圖1所示，從圖中可以看出虛框中的峰為合成的雙芘分子和響應性多肽的結構，四代樹枝狀分子結構有箭頭標出，說明得到了設計的分子探針。

制備得到的分子探針的單體和聚集體的熒光光譜及在細胞自噬ATG4半胱氨酸酶作用下的熒光信號變化，其結果分別如圖2、圖3所示，由圖2和圖3可見，本發明的分子探針具有單體熒光淬滅和酶作用下產生聚集體并可見信號增強特性。

2、細胞水平細胞自噬成像實驗：

選取MCF-7細胞為細胞自噬細胞模型。2×10⁵個細胞首先接種在專用的細胞共聚焦培養皿中并在含10％的PBS DMEM 37℃以及5％CO₂的條件下，孵育15個小時；再加入1μM的細胞自噬誘導劑雷帕霉素，保持在37℃以及5％CO₂的條件下，孵育1個小時；將100μg/mL分子探針加入培養皿中，2小時后進行共聚焦成像。成像使用Zeiss LSM710激光共聚焦顯微鏡。激發光為405nm，收集450-600nm波段。從圖4中可以看出，在雷帕霉素處理的細胞中檢測有較強的熒光信號，說明該細胞處于自噬激活的狀態；沒有經過雷帕霉素處理的細胞中沒有檢測到熒光信號，說明該細胞處于自噬非激活的狀態。另外通過應用細胞自噬誘導劑，我們檢測了細胞自噬激活前后的實時狀態。其結果如所圖5所示，在雷帕霉素處理之前的細胞中并沒有檢測到熒光信號，但在雷帕霉素加入之后,隨著時間的延長，檢測到細胞內的熒光信號逐漸增強，說明雷帕霉素激活了細胞自噬,并隨時間變化而增強。

我們驗證了分子探針能否提供細胞自噬水平的定量信息。應用雷帕霉素建立細胞自噬水平不同的細胞模型，0μM雷帕霉素處理的細胞熒光信號定為100％。其結果如所圖6所示，隨著雷帕霉素濃度的增加，檢測得到的熒光信號強度從100％(0μM)增強到154％(0.1μM)、268％(0.5μM)、350％(1.0μM)，說明分子探針能夠提供細胞自噬水平的定量信息。

3、分子探針特異性成像

選取EBSS緩沖液(饑餓)、雷帕霉素為細胞自噬誘導劑，選取3甲基嘌呤、巴伐洛霉素為細胞自噬抑制劑分別與MCF-7細胞孵育建立細胞自噬激活及抑制模型。100μg/mL分子探針加入培養皿中，2小時后進行共聚焦成像。成像使用Zeiss LSM710激光共聚焦顯微鏡。激發光為405nm，收集450-600nm波段。通過激光共聚焦顯微鏡觀察分子探針對細胞自噬激活和非激活狀態的響應。

結果如圖7所示，在雷帕霉素和饑餓處理兩個小時的細胞自噬激活模型中檢測到較強的熒光信號；在3甲基嘌呤、巴伐洛霉素處理的細胞自噬抑制模型中，沒有檢測到熒光信號。結果說明分子探針對細胞自噬激活狀態有特異性響應。

4、活體水平細胞自噬成像實驗

選取2dpf斑馬魚胚胎為活體模型。首先2dpf斑馬魚胚胎在含1μM的細胞自噬誘導劑雷帕霉素的養魚水中孵育24小時，將100μg/mL分子探針加入養魚水中，4小時后進行共聚焦成像，確定分子探針可以用于活體水平細胞自噬的成像。

結果如圖8所示，在生理鹽水處理的細胞自噬抑制斑馬魚模型中，沒有檢測到熒光信號，但在雷帕霉素處理的細胞自噬激活模型中檢測到較強的熒光信號，說明分子探針可用于活體水平細胞自噬成像實驗。

實施例2：活體水平細胞自噬光聲成像實驗

以具有聚集產生增強光聲信號特性的紫紅素18分子探針在小鼠腫瘤模型中檢測細胞自噬成像為例。其分子探針化學結構如下：

選取6-7周BALB/c裸鼠，在后腿部肌肉注射1×10⁷個U87膠質瘤細胞建立小鼠后腿部腫瘤模型。通過尾靜脈注入1μM的細胞自噬誘導劑雷帕霉素100μL細胞自噬激活腫瘤模型，之后通過尾靜脈注入濃度為100μg/mL分子探針200μL，選取0.25、0.5、1、2、4、6、7、9、12和24小時時間節點，觀察在不同的時間點對腫瘤部位細胞自噬水平的成像。

結果如圖9所示，生理鹽水處理的小鼠腫瘤部位，任何時間段都沒有檢測到熒光信號，說明生理鹽水處理的小鼠腫瘤部位細胞自噬水平很低；在雷帕霉素處理的小鼠腫瘤部位，0.25小時時檢測到微弱的熒光信號，隨著時間延長，熒光信號強度也隨之增強。7小時時，信號強度達到最大，但之后隨著時間變化熒光信號強度隨之變弱。說明雷帕霉素處理的小鼠腫瘤部位細胞處于自噬激活的狀態，分子探針注入7小時時檢測效果最好，之后腫瘤部位的分子探針可能被逐漸清除。

申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的基于雙芘的酶響應自組裝的多肽納米材料及其制備方法和應用，但本發明并不局限于上述實施例，即不意味著本發明必須依賴上述實施例才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。