本發明涉及一種多功能多模態腫瘤特異性靶向相變型納米微球光聲造影劑及其制備方法和應用，屬影像學診斷和治療用藥物技術領域。

背景技術：

腫瘤治療的關鍵在早期診斷。超聲、MRI、CT等常用的影像檢測手段在腫瘤早期診斷中發揮著各自不同的優勢。但無論那種成像技術，對于腫瘤而言，在其早期階段發現其結構、代謝和生化信息的改變至關重要。隨著各種造影劑的出現，各種成像技術對早期腫瘤的檢出大幅提高，然而普通造影劑對腫瘤組織缺乏親和力和特異性，在瘤組織不能有效駐留，只能在短暫的動脈相中對腫瘤組織產生一過性增強，因此對腫瘤僅能做出定性診斷，且診斷的特異性也欠佳。

目前，腫瘤的診斷和治療需要非侵入性地對活體內腫瘤組織在分子及細胞水平的變異信息、生理和病理過程進行定性或定量的可視化觀察。目前常用的各種成像技術和造影劑均達不到此要求。但新型分子影像技術和靶向分子造影劑的發展，為此目標的實現帶來了可能。光聲成像技術(photoacoustic tomography，PAT)是21世紀初發展起來的生物醫學成像技術。它是采用脈沖激光照射到生物組織，組織因吸收光能量產生熱，伴隨熱膨脹而產生超聲波，這種現象稱為光聲效應[Guan J F，Shen Z H，Xu B Q et a l.Spectral analysis of the scattering wave form of the laser-generated ultrasonic waves for detecting the crack in the material[J].Laser Technology，2005，29(3)：287～290]，其產生的信號稱為光聲信號。利用光聲效應，通過圖像重建后，獲得材料二維斷層圖像或者三維立體圖像的一種新穎的成像方法稱為光聲成像[Yang J M，Favazza C，Chen R，et al.Simultaneous functional photoacoustic and ultrasonic endoscopy of internal organs in vivo[J].Nature Medicine，2012，18：1297～1302]。腫瘤組織和周圍正常組織的光吸收差異至少5倍以上，不同生理狀態的生物組織對光的吸收也大不相同，因此，與目前常用的成像技術比如超聲、MRI、CT等比較，光聲成像的重建圖像對比度更高、分辨率更好，可以反映組織的結構、病變特特征，代謝狀態、甚至神經活動。光聲成像的成像模式可以歸納為“光吸收→誘導光聲信號產生→外置的超聲波檢測→圖像重建”，這種模式集合了光學成像的高選擇性和超聲成像的高分辨率的特點。目前光聲成像的研究充滿活力，其分辨率已達到220nm。

近年來，雖然PAT得到迅速發展，但深層組織成像和圖像對比度的矛盾依舊突出。獲取深處組織的高分辨率圖像仍是需要解決的巨大難題[Kate O，Small E，Silberberg Y.Looking around corners and througn thin turbid Iayers in real time with scattered mcoherenthgnt[J].Nature Photonics，2012，6：549～553]。研究發現，在組織血管中注入特殊的納米顆粒，不但能增加PAT的深度和對比度，而且還可以實現組織的功能成像。雖然光聲成像具有高分辨率，可實現單個細胞成像，但就單細胞而言由于正常細胞和腫瘤細胞的光吸收無明顯差異，所以要實現細胞水平的腫瘤早期檢測，還必須要引入外源造影劑。

雖然，光聲造影劑已有報道，如中國專利(申請)第2014102138181、2013800385629、2010800437371號記載的，但或存在腫瘤特異性靶向不足，或存在光聲成像用造影劑低敏感的問題，即造影劑的每分子吸收系數低。由此可見，開發新型的生物安全性高、靈敏性好的光聲造影劑，特別是可與腫瘤細胞特異性結合的靶向光聲造影劑，有望幫助PAT實現非侵入性地對活體內腫瘤組織在分子及細胞水平的變異信息、生理和病理過程進行定性或定量的可視化觀察；有望解決光聲成像的技術難題，促進光聲成像技術的快速發展，早日應用于臨床。

光聲成像是一門新型技術，光聲造影劑的研究更是一個全新的領域。光聲成像是以超聲作為信息載體的非電離化的新興醫學成像方法。因而，光聲造影劑的研究更多的借鑒了超聲造影劑的成熟技術。

超聲造影劑從發明到今天共經歷了4個發展階段(如下表示)。目前技術最成熟、臨床使用最廣泛的是第三代超聲造影劑，其最大特點是包裹高分子量、低溶解度、低彌散度的(氟碳或氟硫氣體等)惰性氣體。我國僅批準了Sonovue^TM進口在臨床使用。這代造影劑的最大特點是血池造影劑，在體內留存時間相對短，無特異性。

第四代造影劑為靶向微球超聲造影劑，即使用偶連了各種特異性配體(如抗體、小分子物質、大分子蛋白、多肽、多糖等)的各類高分子殼膜材料(如聚乳酸及其共聚物、磷脂、聚乙二醇、殼聚糖等)包裹低溶解度低彌散度氣體(如氟碳或氟硫氣體)、液態氟碳、納米金屬等或攜帶藥物、基因等具有治療作用的造影劑。由于靶向超聲造影劑上的配體與靶標上的 相應受體特異性結合，可在疾病早期在細胞水平或分子水平對靶組織或器官特異性顯像[王志剛.超聲分子影像學研究進展[J].中國醫學影像技術，2009，25(6)：921～924]。目前，第四代造影劑仍在探索階段，尚無上市產品，但其發展潛力巨大。

靶向超聲造影劑由三部分構成：一是作為殼膜的材料，二是與靶位連接的配體，三是殼膜上或殼膜內攜帶或包裹核心物質。

殼膜材料最常見的如聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]、聚乳酸羥基乙酸共聚物、乳酸共聚物、乙烯基共聚物、聚氨基酸、聚酞胺、聚原酸酯、聚磷酸酯、環氧烷基共聚物、磷脂、表面活性劑、蛋白質、多糖等，近年來因PLGA具有良好的相容性，對其研究較多。

PLGA由乳酸和羥基乙酸兩種單體隨機聚合而成，具有良好的生物相容性、生物降解性且降解速度可控。在人體內可通過三羧酸循環降解為乳酸和羥基乙酸，并最終生成水和二氧化碳，毒副作用小。其良好的成囊和成膜性能，被廣泛應用于制藥、醫用工程材料和現代化工業領域。在美國PLGA通過FDA認證，正式作為藥用輔料收錄進美國藥典。國內主要用于緩釋微球的研究。PLGA形成的納米粒，通過制備過程中控制粒徑大小，可使其粒徑不超過100nm，從而透過血管內皮到達組織間隙，實現組織顯影，同時，PLGA納米粒具有EPR效應(The enhanced permeability and retentivityeffect，EPR)，可以顯著減少網狀內皮系統和腎臟的清除作用，延長在體內留存時間。

研究表明，腫瘤細胞膜表面或腫瘤供應血管表面存在著一些受體并在腫瘤組織中存在異常表達，與相應配體或配體類似物能特異結合。受體與配體的結合具有特異性、選擇性、飽和性、親合力強和生物效應明顯的特點，為腫瘤的靶向診治提供了靶向途徑。很多腫瘤細胞表面高表達一些代謝型受體、營養型受體或白細胞分化抗原。常見的的代謝型受體有葉酸受體、膽酸受體、酪氨酸激酶、激素受體等；常見的白細胞分化抗原有CD20、CD52等。針對以上靶點的腫瘤分子靶向藥物或抗體藥均有上市。比如血小板衍生生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑包括伊馬替尼(Imatinib)、舒尼替尼(Sunitinib)、索拉菲尼(Sorafenib)。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑包括吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)。單抗藥包括達利珠單抗(Daclizumab)、易普利姆瑪(Ipilimumab)、貝伐單抗(Bevacizumab)、曲妥珠單抗、利妥昔單抗、西妥昔單抗、阿倫珠單抗、替伊莫單抗、阿侖單抗等。

但目前針對葉酸受體尚無藥物上市。與大分子抗體比，葉酸分子質量小、人體免疫原性低；達靶點時間短、血液清除速度快、易于修飾和穿透腫瘤細胞[Moore J L.The significance of folic acid for epilepsy patients[J].Epilepsy Behav，2005，7(2)：172～181]^[、與葉酸受體有高親和力(Kd＝10-10mol/L))。因而葉酸導向的靶向系統已成為腫瘤診斷和治療領域的研究熱 點[WangA Z，Gu F，ZhangLF，eta.l Biofunctionalized targeted nano-particles for therapeutic applications[J].ExpertOpin Biol Ther，2008，8(8)：1063～1070]。葉酸(FA)是人體所必需的一種B族維生素。葉酸受體(foiate receptor，FR)在正常組織低表達或不表達，但在多數惡性腫瘤細胞過度表達，FRα主要在上皮細胞系腫瘤(如卵巢癌、結直腸癌、子宮內膜癌、睪丸癌、腦瘤、肺腺癌等)中高水平表達。雖然在正常細胞中FR可選擇性的表達在細胞表面但是其呈極性分布，血液循環中的靶向制劑不能接近該受體，亦不能進入正常細胞，而惡性腫瘤細胞中FR分布失去極性，血液循環中的靶向制劑可接觸該受體。因而具有良好的腫瘤組織特異性。由于葉酸結構的特殊性——其末端具有兩個-COOH(羧基)，使其很難自由地通過細胞膜，而主要通過FR介導的胞吞作用進入細胞內。因此，通過以葉酸介導的靶向納米微球可通過同樣的方式，即FR介導的胞吞作用進入細胞內，從而達到靶向腫瘤的目的。

液態氟碳是一種多功能影像學造影劑，有低毒理學、低危險度、強壓力抵抗力的特點，具有多模態成像潛能，在CT和MRI領域均有研究和應用，同時還具有“光吸收子”的特性。常見的液態氟碳包括液態氟碳是指包括全氟戊烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟己烷、全氟庚烷、、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟溴辛烷、全氟碘辛烷或全氟萘烷。由于液態氟碳具有聲透過性，如單獨使用其超聲顯影效果不佳。包裹液態氟碳所形成納米微粒，可穿過血管內皮，到達組織間隙聚集顯像，但往往到達組織濃度較低，增強超聲顯影效果不如常用的微泡造影劑。只有大量聚集于病灶后，才會在靶區產生明顯增強的回聲信號，使信噪比大大提高。為了提高造影劑在腫瘤或其他組織的聚集濃度，靶向是非常好的策略；再利用液態氟碳的可相變的特性，通過超聲、光等外界條件促發液態氟碳在聚集局部產生相變，有望達到顯著增強超聲顯影的目的，且通過其相變的腔化作用達到治療的目的，成為較理想的血管外顯影的造影劑。

雖然液態氟碳具有“光吸收子”的特性，但它吸收光的作用弱于傳統的光吸收對比劑。因而，要研究葉酸靶向相變載金高分子超聲及光聲造影劑，必須要引入新的“光吸收子”。常見的“光吸收子”有金納米材料(金納米粒子、金納米棒、金納米籠、金納米球、包覆有二氧化硅殼層的金納米棒、)、碳納米材料(單壁碳納米管等)以及具有紅外吸收的一些染料(如吲哚青綠、印度墨水以及亞甲基藍等)。

納米金顆粒(GNP)是一種良好的“光吸收子”，由于具有良好的生物相容性、表面易于修飾、對X射線有較高的吸收等性質，已經被廣泛的研究以用于癌癥的早期檢測，而且可以用于CT成像。其對光的吸收比傳統的光吸收對比劑(如吲哚青綠)要強1000000倍左右，具有形態及尺寸可控、溫和的表面化學性質以及良好的生物相容性等特點，且能通過增強的滲透保留效應大量累積在腫瘤部位，間接達到靶向腫瘤的目的。加上其獨特的表面等離子共 振效應(surface plasmon resonance，SPR)，使其在腫瘤成像以及治療等方面引起廣泛關注。SPR的效應表現為劇烈的光吸收和強烈的光散射以及顯著增強電磁場。因此GNP非常適合作為光聲成像的光吸收子。夏幼南等人[Yang X，Skrabalak S E，L₁Z Y，et al.Photoacoustic tomography of a rat cerebral cortex in vivo with Au nanocages as an optical contrast agent[J].Nano letters，2007，7(12)：3798～3802]以GNP為造影劑對大鼠大腦皮層血管進行了PAT，檢測到皮層血管的光吸收增強了81％。此外，Strohm[Strohm E，Rui M，Gorelikov I，et al.Vaporization of perfluorocarbon droplets using optical irradimion[J].Biomedical optics express，2011，2(6)：1432～1442]研究發現，通過光吸收材料(如金、氧化鐵或碳)，激光也能促進液態氟碳微球發生相變。

因而，本發明的目的是以新型材料為包裹載體，連接靶向腫瘤的配體，以液態氟碳和光吸收子為內核。通過包裹或攜載了不同物理性質的材料，使各種材料在納米粒子里發揮各自的優勢。本發明不僅提供一種多功能多模態腫瘤特異性靶向相變型納米微球光聲造影劑，而且提供了制備方法和應用。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供一種多功能多模態腫瘤特異性靶向相變型納米微球光聲造影劑。另外，本發明還提供了其制備方法和應用等。

具體而言，在第一方面，本發明提供了如式I所示的一種多功能多模態腫瘤特異性靶向相變型納米微球光聲造影劑。

從左到右依次表示納米微球從外到內的不同結構，其中：

P表示位于納米微球表面的與腫瘤細胞膜表面受體特異結合的配體；

L表示連接分子，連接P和X；

X表示殼膜材料；

Y表示由殼膜材料包裹在核心的相變分子；

Z表示由殼膜材料包裹在核心的光吸收子。

在本文中，結構式具有本領域技術人員所理解的意義，這不完全相同于嚴格的化學式。

本發明中的P是指位于納米微球表面的與腫瘤細胞膜表面受體特異結合的配體，包括而不 限于代謝型受體和營養型受體抑制劑以及抗體。代謝型受體抑制劑包括而不限于葉酸、酪氨酸激酶抑制劑、膽酸、激素類。營養型受體抑制劑是指包括而不限于低密度脂蛋白、轉鐵蛋白。本發明優選葉酸作為腫瘤靶向配體。

酪氨酸激酶抑制劑包括血小板衍生生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑和表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑。血小板衍生生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑包括而不限于伊馬替尼、舒尼替尼、索拉菲尼。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑包括而不限于吉非替尼、厄洛替尼。以上藥物可以通過商業化獲得也可以自己合成。

本發明中的抗體是指完整的抗體分子(含V區和C區)和含有V區的抗體片段。本發明優選完整的抗體分子，包括而不限于達利珠單抗、易普利姆瑪、貝伐單抗、曲妥珠單抗、利妥昔單抗、西妥昔單抗、阿倫珠單抗、替伊莫單抗、阿侖單抗。以上藥物可以通過商業化獲得也可以自己重組表達。

本發明中L表示連接分子，常見的有聚乙二醇(PEG)、聚左旋賴氨酸(PLL)、多聚乳酸(PLA)、各種氨基酸如脯氨酸、色氨酸(TPG)等。本發明優選聚乙二醇(PEG)，其分子量為100～10000道爾頓。更優選直鏈PEG，分子量3500道爾頓。

本發明中的聚乙二醇，其結構簡式為A-PEG-B。A和B表示分別連接配體和殼膜材料的功能基團。A和B可以是相同的功能基團，也可以是不同的功能基團。A和B可以是包括而不限于氨基、羧基、羥基中、醛基、琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺基的任何一種。本發明中優選NH₂-PEG-NH₂、NH₂-PEG-OH，進一步優選NH₂-PEG-NH₂。

本發明中的殼膜材料是指生物大分子和磷脂。生物大分子包括而不限于聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)、乳酸共聚物、乙烯基共聚物、聚氨基酸、聚酞胺、聚原酸酯、聚磷酸酯、環氧烷基共聚物。磷脂是指包括而不限于二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二硬硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、1，2-棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、1-棕櫚酰基-2-油酰基磷脂酰甘油(POPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、1，2-雙棕櫚酰基-3-磷脂酰膽堿甘油酯(DPPC)、二月桂酰基卵磷脂(DLPC)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)。本發明優選PLGA和DSPE。

本發明中的聚乳酸羥基乙酸共聚物，分子量為5000～40000道爾頓，摩爾比為50∶50、60∶40、75∶25、90∶10。本發明優選分子量25000道爾頓，摩爾比為50∶50。

本發明中Y表示由殼膜材料包裹在核心的相變分子，其相變分子是指液態氟碳。液態氟碳包括而不限于全氟戊烷(Perfluoropentane，PFP)、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟己烷(Perfluorohexane，PFH)、全氟庚烷、、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟溴辛烷、全氟碘辛烷或 全氟萘烷。本發明優選PFP和PFH。更進一步優選PFP。

本發明中Z表示由殼膜材料包裹在核心的光吸收子，其光吸收子是指包括金納米粒子(GNP)、金納米棒、金納米籠、金納米球、包覆有二氧化硅殼層的金納米棒、單壁碳納米管、吲哚青綠、印度墨水以及亞甲基藍。本發明優選GNP。

需要進一步說明的是Y和Z可以是包裹在核心，也可以是鑲嵌在殼膜里。本發明優選包裹在核心。

本發明的另一方面提供了一種多功能多模態腫瘤特異性靶向相變型納米微球光聲造影劑的制備方法。

目前，靶向納米微粒的制備多采用先制備微泡再偶聯各種特異性配體。由于納米微粒一旦形成后，即處于混懸狀態(即不溶狀態)。在此種狀態下，無論是靠電荷吸附、還是通過非共價或共價修飾，特別是共價連接，偶聯率均較低。這種方法制備的靶向納米微粒常常靶向效果較差。因而本發明首先采用五步法合成腫瘤靶向殼材，再采用特殊的雙乳化法將靶向殼材包裹相變分子和光吸收子獲得多功能多模態腫瘤特異性靶向相變型納米微球光聲造影劑。

具體來講，“五步法”為①活化殼膜上的羧基(-COOH)，比如PLGA或磷脂上的羧基。本發明優選PLGA，即合成PLGA-NHS：PLGA和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)偶聯活化羧基，PLGA-COOH+NHS→PLGA-NHS。②合成單氨基保護的NH₂-PEG-BOC：NH₂-PEG-NH₂與二碳酸二叔丁酯(BOC)反應，NH₂-PEG-NH₂+BOC→NH2-PEG-NH-BOC；③將單氨基保護的PEG與活化后的殼膜連接，如與PLGA或磷脂連接。本發明優選為PLGA-PEG-NH-BOC合成：NH₂-PEG-NH-BOC和PLGA偶聯，NH₂-PEG-NH-BOC+PLGA-NHS→PLGA-PEG-NH-BOC；④氨基脫保護，優選PLGA-PEG-NH₂合成：用三氟乙酸(TFA)與BOC置換，氨基脫保護，PLGA-PEG-NH-BOC+TFA→PLGA-PEG-NH₂；⑤將配體(葉酸、索拉菲尼等血小板衍生生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑；吉非替尼等表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制；以及貝伐單抗、曲妥珠單抗等抗體類似藥)與PEG的另一個氨基(即脫掉BOC的氨基)連接獲得腫瘤靶向殼膜材料的合成。本發明中配體優選葉酸。即PLGA-PEG-FA的合成：PLGA-PEG-NH₂和葉酸偶聯，PLGA-PEG-NH₂+FA→PLGA-PEG-FA。本發明在五步法合成腫瘤靶向殼材過程中，還分別采用了甲醇和乙醚低溫沉淀、分子篩離心、反向層析分離等方法純化，最終獲得98％以上的靶向殼膜材料。關于合成步驟中的具體投料詳見實例1。

獲得靶向殼膜材料后，將其溶于一定體積的有機溶劑中。本發明優選二氯甲烷、三氯甲烷和二甲亞砜。更優選二氯甲烷。將一定量的液態氟碳和光吸收子加入溶解有殼膜材料的溶液中，冰鹽水浴中聲振，得到納米微球。由于液態氟碳非脂溶性非水溶性的特性，本發明人按常規雙乳化法獲得的納米微球，配體均被包裹到微球內側，無法與腫瘤細胞上相應的受體 結合，即不具有靶向性。本發明人經過潛心研究，優化了包裹方法：先將未連接配體的殼膜材料包裹液態氟碳和光吸收子得到初乳液，再將初乳液加入溶解有一定量的靶向殼膜材料中，劇烈震蕩，加入再緩慢加入PVA，冰鹽水浴中聲震，磁力攪拌充分揮發有機溶劑。得到粒徑為260nm左右納米微球。經體內外實驗證明該微球可以和腫瘤細胞膜上的特異性受體結合，具有特異靶向性。并能檢測到光聲、超聲以及X線信號。表明本發明人成功獲得了一種多功能多模態腫瘤特異性靶向相變型納米微球光聲造影劑。本發明人將優選配體葉酸，優選殼膜材料PLGA，以及優選液態氟碳PFP和優選光吸收子GNP在實例中詳細公開一種多功能多模態腫瘤特異性靶向相變型納米微球光聲造影劑的制備方法。

本發明的第三方面提供了一種組合物，該組合物包括所述的造影劑以及一種藥學可接受的稀釋劑或載體。在本文中，“藥學上可接受的稀釋劑或載體”指適于與人或動物的組織接觸而且無過多的毒性、刺激或變態反應等。藥學上可接受的釋劑或載體是本領域熟知的。本發明的造影劑可以單獨使用，也可以以藥學上可接受的稀釋劑或載體使用。

本發明的第四方面提供了組合物作為一種診斷劑、一種治療劑或這二者的用途。所述用途，其中該診斷成像或成像輔助應用為光聲成像(PAT)、超聲成像(Ultrasonic Imaging)、計算機斷層成像(CT)、單光子發射計算機斷層成像(SPECT)、正電子發射斷層成像(PET)、PAT輔助應用、Ultrasonic Imaging輔助應用、CT輔助應用、SPECT輔助應用或PET輔助應用。本發明優選光聲成像、超聲成像。

為了便于理解，以下將通過具體的實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發明范圍的限制，即不意味著本發明必須依賴下述才能實施。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。對本發明的任何改進，對本發明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。另外，本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重復敘述過一樣。

附圖說明

圖1、PLGA-PEG-FA核磁共振圖譜(¹H-NMR)：峰4、7、8、9、10、11、12為葉酸特征峰，峰2和3為PEG特征峰，峰1、5、6為PLGA特征峰。

圖2、GNP/PFP/PLGA-PEG-FA納米粒掃描電鏡圖。

圖3、GNP/PFP/PLGA-PEG-FA納米粒透射電鏡圖。

圖4、GNP/PFP/PLGA-PEG-FA與FR的結合呈“S”型曲線。

圖5、體外激光輻照前GNP/PFP/PLGA-PEG-FA的超聲造影表現：左圖為超聲基波模式，右圖為造影模式。

圖6、體外激光輻照后GNP/PFP/PLGA-PEG-FA的超聲造影表現：左圖為超聲基波模式，右圖為造影模式。

圖7、體外激光輻照后GNP/PFP/PLGA-PEG-FA的超聲顯影表現和光聲顯影表現：左圖為超聲顯影，右圖為光聲顯影。

圖8、體內SKOV3裸鼠荷瘤模型靜脈注射GN P/PFP/PLGA-PEG-FA光聲造影劑后的超聲和光聲顯像：左圖為超聲顯影，右圖為光聲顯影。

具體實施方式

下面實施例將以制備葉酸靶向相變型載金PLGA納米微球光聲造影劑對本發明作進一步詳細、完整地說明。如未特別指明之處，可參考本領域技術人員所熟悉的《有機合成》、《分子克隆實驗指南》、《細胞實驗指南》等書籍和SFDA的動物實驗規范和指引以及所用的試劑和設備的使用說明。其中，如未特別指明，所用的試劑和設備均可通過商業渠道購買。

實例1葉酸靶向聚乳酸羥基乙酸的制備(PLGA-PEG-FA)

1、實驗方法

①PLGA-COOH和NHS偶聯合成PLGA-NHS：取0.04MM PLGA-COOH溶解在4mlDCM中，取0.4MM NHS和0.3MM DCC溶解在2ml DCM中，兩者混合，放置在搖床中慢速搖勻過夜，加入80ML冰甲醇和乙醚混合溶液(甲醇和乙醚體積比1∶1)搖勻，4℃冰箱靜置過夜，見有大量沉淀出現時，離心收集沉淀，真空干燥，即獲得PLGA-NHS。

②合成單氨基保護的NH2-PEG-NH-BOC：雙氨基PEG溶解在50ml NaHCO3，pH7.50，終濃度為1mg/ml；二碳酸二叔丁酯(BOC試劑)溶解在10ml DMSO，終濃度為0.1mg/ml。按PEG和BOC質量比為5∶1混合，室溫攪拌反應過夜。BOC后上層析柱15Q分離純化，得到單氨基保護的NH2-PEG-BOC。

③PLGA-PEG-NH-BOC合成：取0.02MM PLGA-NHS溶解在20ml DCM中，依次加入0.05MM NH2-PEG-NH-BOC和0.4MM N，N-二異丙基乙胺(DIEA)，放置在搖床中慢速搖勻過夜，加入80ml冰甲醇和乙醚混合溶液(甲醇和乙醚體積比1∶1)，4℃冰箱靜置過夜，見有大量沉淀出現時，離心收集沉淀，真空干燥。即獲得PLGA-PEG-NH-BOC。

④PLGA-PEG-NH2合成：取PLGA-PEG-NH-BOC 250mg溶解在25ml 100％三氟乙酸(TFA)，脫保護30分鐘后加入50倍雙蒸水(DDW)終止反應，終止反應后的脫保護溶液上反相純化，得到PLGA-PEG-NH2單體，純度為98％。再加入５倍體積的冰甲醇和乙醚混合溶液(甲醇和乙醚體積比1∶1)，4℃冰箱靜置過夜。見有大量沉淀出現時，離心收集沉淀，真空干燥。即獲得PLGA-PEG-NH2干粉。

⑤PLGA-PEG-FA的合成：分別取100mg的PLGA-PEG-NH2和葉酸(FA)溶解于50ml100％二甲亞砜(DMSO)，終濃度2mg/ml。二者混勻后加入6MM DCC，放置在搖床中慢速搖勻過夜，加入5倍體積冰甲醇和乙醚混合溶液(甲醇和乙醚體積比1∶1)搖勻，4℃冰箱靜置過夜。見有大量沉淀出現時，離心收集沉淀，真空干燥，即獲得PLGA-PEG-FA。將PLGA-PEG-FA用100％二甲亞砜復溶，用10KD的分子篩10000轉/分離心，去離心液，再加入二氯甲烷復溶，上反相純化。加入5倍體積冰甲醇和乙醚混合溶液(甲醇和乙醚體積比1∶1)搖勻，4℃冰箱靜置過夜。見有大量沉淀出現時，離心收集沉淀，真空干燥，即獲得PLGA-PEG-FA保存備用。

2、實驗結果

通過“五步法”，制備獲得純度在98％以上的PLGA-PEG-FA干粉。經氫譜鑒定，結構正確。如附圖1所示。

基本參照以上制備方法，用磷脂(如本發明權利要求書中所述各種磷脂)替代PLGA，可以制備獲得磷脂-PEG-FA。

基本參照以上制備方法，用本發明權利要求書中所述各種酪氨酸激酶抑制劑和/或抗體替代葉酸，可以制備獲得PLGA/磷脂-PEG-酪氨酸激酶抑制劑和/或PLGA/磷脂-PEG-抗體。本發明權利要求書中所述各種酪氨酸激酶抑制劑和抗體可以通過商業途徑夠得，也可以是直接合成或重組表達。

實例2葉酸靶向相變載金高分多功能多模態光聲造影劑的制備(GNP/PFP/PLGA-PEG-FA和GNP/PFH/PLGA-PEG-FA)

1、實驗方法

①各取25mgPLGA+3mg納米金+3ml二氯甲烷至完全溶解；

②分別加入200ulPFP或PFH；

③在冰鹽水浴中聲振100W，1min。至此，得到初乳液；

④另各取75mg靶向殼材PLGA-PEG-FA，分別加入2ml二氯甲烷溶解，得到溶液；

⑤向初乳液內加入步驟4中得到的溶液后，劇烈震蕩2.5min；

⑥在持續的攪拌下，分別緩慢加入3ml的5％PVA溶液，冰鹽水浴中聲振75W，2min；

⑦室溫下磁力攪拌4h，使二氯甲烷盡量充分揮發；

⑧分別將其轉入離心管中，5000rpm，離心5分鐘后收集沉淀；

⑨多次加入雙蒸水重懸，洗滌、離心，以去除有機溶劑，得到沉淀即為(GNP/PFP/PLGA-PEG-FA)及(GNP/PFH/PLGA-PEG-FA)納米粒，加入雙蒸水重懸，調整納米微球濃度為3.6x10¹⁵個/ml后置于4℃冰箱中保存備用。

2、實驗結果

掃描電鏡對GNP/PFP/PLGA-PEG-FA納米粒進行形態學觀察；呈球形，形態規則，分散度好(見附圖2)。透射電鏡觀察GNP/PFP/PLGA-PEG-FA亦呈球形，并可見棕黑色納米金呈不規則團片狀顆粒樣不均勻地分布于納米粒上內(見附圖3)。粒徑為(268.1±90.87)nm，符合納米微球標準。

基本參照以上制備方法，用磷脂-PEG-FA或PLGA/磷脂-PEG-酪氨酸激酶抑制劑或PLGA/磷脂-PEG-抗體替代PLGA-PEG-FA，用本發明權利要求書中所述其他液態氟碳替代PFP、PFH，用其他光吸收子替代GNP可以制備類似多功能多模態腫瘤特異性靶向相變型納米微球光聲造影劑。

實例3GNP/PFP/PLGA-PEG-FA體外腫瘤細胞特異性靶向研究

以高表達葉酸受體的人卵巢癌細胞(SKOV3細胞)為實驗材料。取對數生長期的SKOV3細胞，將調整好濃度的SKOV3細胞懸液200μl加入6只EP管，每管細胞個數為1.6萬個，將用FITC標記的GNP/PFP/PLGA-PEG-FA(用GNP/PFP/PLGA-PEG-FA-FITC表示)稀釋為2×104個/ml、4×104個/ml、8×104個/ml、16×104個/ml、32×104個/ml五個不同濃度，每管加入50μl。剩下1管加入50μl的FITC做陰性對照外，37℃孵育30min后。離心，去上清，PBS重新懸浮后2小時內上流式細胞儀檢測陽性細胞。當SKOV3細胞細胞中加入FITC后孵育后，流式細胞未檢測到帶FITC熒光的陽性細胞，隨著加入GNP/PFP/PLGA-PEG-FA光聲造影劑量的增加，陽性細胞數大幅增加，當加入的量到達一定濃度時(16×104個/ml)，已到達飽和(接近100％)，陽性細胞數不再隨造影劑濃度增加(見下表)，GNP/PFP/PLGA-PEG-FA與FR的結合呈“S”型曲線(附圖4)，符合受體和配體結合規律。提示GNP/PFP/PLGA-PEG-FA光聲造影劑能與腫瘤細胞膜上的葉酸受體特異性結合。

實例4激光體外促發GNP/PFP/PLGA-PEG-FA相變增強超聲顯像和光聲顯像

取GNP/PFP/PLGA-PEG-FA 1ml置入用1％瓊脂糖凝膠制成的孔洞中。采用激光垂直于孔洞內的液面輻照，激光儀采用能量為200mj，作用時間為1min。診斷超聲儀或光聲成像儀從孔洞的另一側壁觀察，掃查平面與孔洞長軸垂直。觀察激光輻照GNP/PFP/PLGA-PEG-FA后，超聲顯像的基波與諧波模式聲像圖改變以及檢測光聲信號。

激光輻照前，超聲諧波模式聲像圖信號較弱，如附圖5所示。激光輻照后，超聲諧波模式聲像圖信號顯著增強，見附圖6。提示激光輻照激發GNP/PFP/PLGA-PEG-FA相變后可顯著增強超聲顯像。

激光輻照后，光聲信號顯著增強。見附圖7。

實例5GNP/PFP/PLGA-PEG-FA多種條件激發體內相變增強超聲顯像和光聲成像

常規建立SKOV3裸鼠荷瘤模型。飼養2-3周后，如果目測背部可見1-2cm包塊，超聲下測量腫瘤大小范圍1-2cm，即判斷荷瘤成模。

成模后，裸鼠尾靜脈注射0.2ml濃度為3.6×1015個/ml的GNP/PFP/PLGA-PEG-FA。分別在注射后采用低強度聚焦超聲、高強度聚焦超聲以及激光輻照腫瘤組織及其周圍正常組織。分別采用超聲造影模式和光聲成像儀檢測。

腫瘤周圍正常組織在低強度聚焦超聲、高強度聚焦超聲以及激光輻照前后，超聲信號均較弱，無明顯改變。而腫瘤組織在輻照后，超聲信號顯著增強。提示GNP/PFP/PLGA-PEG-FA在腫瘤組織富集，輻照后產生了相變，增強了超聲顯影。見附圖8。

輻照前后，腫瘤周圍正常組織光聲信號均較弱。輻照前，腫瘤組織可以檢測到較強光聲信號，但輻照后，光聲信號顯著增強。提示相變可以增強光聲信號。見附圖8。