本發(fā)明涉及醫(yī)療領(lǐng)域，特別涉及桂皮醛及衍生物在制備抑制腎臟鈉重吸收的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

腎臟在維持水鈉平衡中發(fā)揮重要作用。90％以上的水鈉在腎小管被重吸收。其中，60％以上的鈉主要通過近端小管重吸收；約30％的鈉在髓袢升支粗段通過鈉Na⁺-K⁺-2Cl^-同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(NKCC)重吸收；約7％的鈉在遠(yuǎn)曲小管通過Na⁺-Cl^-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體(NCC)重吸收；剩下的鈉在集合管通過上皮鈉通道(ENaC)重吸收。進(jìn)入腎小管上皮細(xì)胞的Na⁺隨即被細(xì)胞基側(cè)膜的Na⁺/K⁺-ATPase(鈉泵)泵入細(xì)胞組織間隙。其中，近端小管鈉重吸收在維持水鈉平衡中起著十分重要的作用。

過量鹽攝入會(huì)引起腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活、氧化應(yīng)激損傷和腎臟鈉水潴留等病理生理改變。腎臟鈉鹽排泄障礙是高鹽飲食導(dǎo)致鈉水潴留的重要因素。促進(jìn)腎臟排鈉可防止鈉水潴留。如前所述影響尿鈉重吸收的多個(gè)通道可通過利尿劑進(jìn)行特異性干預(yù)，但長期大量或聯(lián)合應(yīng)用利尿劑可導(dǎo)致代謝紊亂等副作用。因此，探索新的干預(yù)靶點(diǎn)和安全有效的利尿劑以促進(jìn)尿鈉排泄具有重要意義。

桂皮醛(cinnamaldehyde)又名肉桂醛，天然存在于斯里蘭卡肉桂油、桂皮油、藿香油、風(fēng)信子油和玫瑰油等精油中。桂皮醛有順式和反式兩種異構(gòu)體，現(xiàn)商用的桂皮醛，無論是天然的或者是合成的桂皮醛，都是反式體。桂皮醛是GB2076-2011規(guī)定的允許使用的食品用合成香料，已廣泛用于制備肉類、調(diào)味品、口腔護(hù)理用品、口香糖、糖果用香精。

所述桂皮醛的結(jié)構(gòu)式如下所示：

桂皮醛分子式：C₉H₈O；桂皮醛相對(duì)分子質(zhì)量：132.16。

既往研究發(fā)現(xiàn)桂皮醛具有抗菌、抗腫瘤和鎮(zhèn)痛等作用。

既往使用的利尿劑存在不良反應(yīng)發(fā)生率高的缺點(diǎn)和不足，耐受性差，因此降低了患者的服藥的依從性。因此，本領(lǐng)域需要安全有效、不良反應(yīng)發(fā)生率低的新利尿劑，為臨床醫(yī)生和患者提供更好的藥物選擇。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明的目的是提供一種桂皮醛及衍生物在制備抑制腎臟鈉重吸收的藥物中的用途，該藥物專門針對(duì)高鹽飲食人群，可以克服了現(xiàn)有利尿劑的局限性和毒副作用，是一種安全有效的利尿新藥物。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

桂皮醛及衍生物在制備抑制腎臟鈉重吸收的藥物中的用途。

所述桂皮醛為反式異構(gòu)體。

所述桂皮醛通過激活TRPA1促進(jìn)鈣內(nèi)流。

凡能通過激活TRPA1促進(jìn)鈣內(nèi)流的桂皮醛衍生物，都可用作制備抑制腎臟鈉重吸收的藥物。

本發(fā)明所述藥物，桂皮醛及衍生物可以采用藥物組合物用于抑制腎臟鈉重吸收，其中包括抑制腎臟鈉重吸收的有效量和藥用載體或賦形劑。

所述桂皮醛及衍生物可單獨(dú)或以藥物組合物形式使用并可通過口服，非腸道或局部途徑給予。舉例講，本發(fā)明藥物組合物的口服劑型可為片劑、膠囊、溶液或懸浮液等。

所述桂皮醛及衍生物的給藥劑量取決于多種因素如性別、年齡、體重或給藥途徑，其藥物用藥量為每公斤體重每天2-100mg，較好的技術(shù)方案是所述藥物的用量為每公斤體重每天20-30mg。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，

本發(fā)明所述吳桂皮醛采用純天然提取的桂皮醛，作為一種已知化合物可通過本領(lǐng)域已知方法制備或從市場上獲得。

發(fā)明人在小鼠動(dòng)物上采用口服給藥途徑，在高鹽喂養(yǎng)的WT小鼠模型中觀察證實(shí)桂皮醛可顯著促進(jìn)所述小鼠的尿鈉排泄具有治療作用，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了桂皮醛藥物通過激活TRPA1能促進(jìn)鈣內(nèi)流，可促進(jìn)尿鈉排泄緩解高鹽導(dǎo)致的腎臟功能損害。因此，本發(fā)明所述藥物，能有效促進(jìn)腎臟排鈉，發(fā)揮利尿劑的作用，保護(hù)高鹽飲食導(dǎo)致的腎臟損害，且無明顯不良反應(yīng)。

本發(fā)明具有以下有益效果：能有效降抑制尿鈉重吸收，促進(jìn)尿鈉排泄，并改善高鹽導(dǎo)致的腎臟功能損傷，無明顯不良反應(yīng)發(fā)。其有效成分桂皮醛為植物來源的天然化合物，非人工合成，是一種安全有效的、不良反應(yīng)少的促進(jìn)尿鈉排泄的藥物，無明顯毒副作用。

下面的試驗(yàn)實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)說明但不意味著對(duì)本發(fā)明的限制。

附圖說明

圖1為桂皮醛促進(jìn)尿鈉排泄并緩解高鹽導(dǎo)致的腎臟損傷，其中圖1A為在野生型(WT)小鼠，膳食補(bǔ)充桂皮醛(HS+CA)可以增加高鹽(HS)喂養(yǎng)小鼠的尿鈉排泄；圖1B為在TRPA1基因敲除(TRPA1^-/-)小鼠，膳食補(bǔ)充桂皮醛(HS+CA)不能顯著改變高鹽(HS)喂養(yǎng)小鼠的尿鈉排泄；圖1C為膳食補(bǔ)充桂皮醛(HS+CA)激活TRPA1可以降低高鹽(HS)喂養(yǎng)小鼠的血肌酐水平；圖1D為膳食補(bǔ)充桂皮醛(HS+CA)激活TRPA1可以降低尿白蛋白/肌酐比值，改善高鹽導(dǎo)致的腎臟功能損傷；

圖2為TRPA1在近端小管上皮細(xì)胞有表達(dá)及功能，其中圖2A為TRPA1基因在野生型(WT)小鼠近端小管和豬近端小管細(xì)胞系(LLC-PK1)有表達(dá)，在TRPA1基因敲除(TRPA1^-/-)小鼠沒有表達(dá)；圖2B為TRPA1和UCP2在豬近端小管細(xì)胞系(LLC-PK1)共表達(dá)；圖2C-2D為桂皮醛(CA)干預(yù)可以增加豬近端小管細(xì)胞系(LLC-PK1)鈣內(nèi)流，用HC-030031抑制TRPA1后可阻斷桂皮醛介導(dǎo)的細(xì)胞鈣內(nèi)流；

圖3為桂皮醛激活TRPA1對(duì)近端小管蛋白表達(dá)的影響，其中圖3A-3B為膳食補(bǔ)充桂皮醛可改善高鹽導(dǎo)致的TRPA1表達(dá)降低；圖3C-3E為高鹽飲食(HS)可增加近端小管鈉氫交換子3(NHE3)和鈉鉀泵(Na⁺/K⁺-ATPase)的表達(dá)，在野生型(WT)小鼠膳食補(bǔ)充桂皮醛(HS+CA)可抑制高鹽(HS)喂養(yǎng)導(dǎo)致的鈉氫交換子3(NHE3)和鈉鉀泵(Na⁺/K⁺-ATPase)表達(dá)上調(diào)，桂皮醛的效應(yīng)在TRPA1基因敲除(TRPA1^-/-)小鼠缺失。

具體實(shí)施方式

本實(shí)施例所用桂皮醛購自美國Sigma-Aldrich公司，型號(hào)W228613。

本實(shí)施例其它試劑為市售的分析純試劑；

野生型(WT)小鼠(C57BL/BJ)和TRPA1基因敲除小鼠(TRPA1^-/-)購自美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室。

實(shí)施例1桂皮醛與激活TRPA1促進(jìn)尿鈉排泄的影響

野生型(WT)小鼠(C57BL/BJ)和TRPA1基因敲除小鼠(TRPA1^-/-)購自美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室。小鼠隨機(jī)分為普食組、高鹽組和高鹽加桂皮醛組，連續(xù)干預(yù)6個(gè)月。期間每個(gè)月測定鼠尾血壓，鼠尾動(dòng)脈血壓測定方法：采用鼠尾血壓測定儀(Powerlab，澳大利亞)按照儀器的要求進(jìn)行測量。測量前先讓小鼠在35℃的溫箱溫?zé)?min。測量過程中小鼠保持清醒狀態(tài)，活動(dòng)受到限制。每只動(dòng)物測3次，取平均數(shù)。在測血壓的同時(shí)，可監(jiān)測心率的變化。每周測量小鼠的尿量和尿鈉排泄量。

將小鼠稱重后置于代謝籠(泰尼百斯，意大利)中，自由進(jìn)食水，收集24h的小便；收集完成后計(jì)量小便體積，并使用電解質(zhì)分析測定儀(揚(yáng)州越化)測定尿電解質(zhì)水平。使用小鼠肌酐和尿白蛋白ELISA試劑盒測定(南京建成)，具體方法參照試劑盒使用說明進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)桂皮醛可顯著促進(jìn)高鹽喂養(yǎng)的WT小鼠尿鈉排泄，桂皮醛的利鈉效應(yīng)在TRPA1^-/-小鼠不明顯(圖1A,圖1B)。此外，補(bǔ)充膳食桂皮醛可降低高鹽喂養(yǎng)WT小鼠血肌酐和尿蛋白水平，改善高鹽飲食導(dǎo)致的腎臟功能損害，該效應(yīng)在TRPA1^-/-小鼠缺失(圖1C,圖1D)。提示膳食桂皮醛可促進(jìn)尿鈉排泄緩解高鹽導(dǎo)致的腎臟功能損害，該效應(yīng)依賴于TRPA1；桂皮醛的降壓效應(yīng)與激活TRPA1促進(jìn)尿鈉排泄有關(guān)。

實(shí)施例2TRPA1和UCP2在近端小管上皮細(xì)胞的表達(dá)

一、用免疫印跡法(Western blot)檢測TRPA1在近端小管的表達(dá)情況。具體實(shí)驗(yàn)過程如下：

(1)分離小鼠腎臟和豬近端小管上皮細(xì)胞，加入適量預(yù)冷的RIPA裂解液(蛋白質(zhì)勻漿緩沖液1ml加PMSF 50μg，Leuptin 5μg)，勻漿機(jī)勻漿，收集勻漿液于1.5ml的離心管中；如為細(xì)胞樣品，則將適量裂解液直接加入到培養(yǎng)瓶或六孔板中，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞。(2)-20℃放置20min以沉淀蛋白。

(3)4℃條件下12000rpm離心20min，收集上清液即組織蛋白，用于蛋白定量及免疫印跡實(shí)驗(yàn)，或者于-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

(4)Bradford法進(jìn)行蛋白定量。

(5)取500μg樣品于干凈EP管中，用蛋白加樣緩沖液定容至200ul，混勻，置于沸水中變性6分鐘。4℃保存，Western blot上樣備用。

Western blot操作步驟

(1)灌制聚丙烯凝膠：先灌下層的分離膠(檢測不同分子量的蛋白，分離膠濃度不同)，再灌上層的4％濃縮膠，然后上樣，每孔上樣量為50μg，每個(gè)樣本至少上二塊平行膠；

(2)蛋白電泳：電泳電壓濃縮膠為90V，分離膠為140V，電泳液為甘氨酸緩沖液；

(3)轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，將凝膠與大小相同的PVDF膜(事先用95％乙醇固定)置于上下各三層濾紙中間，置入轉(zhuǎn)移槽，加滿轉(zhuǎn)移液，4℃95mA電泳轉(zhuǎn)膜14h左右；

(4)封閉：取出PVDF膜，自然晾干后，置于95％乙醇中固定；0.01mol/L PBST洗15min×3次；5％脫脂奶粉中封閉非特異性蛋白，37℃搖床中封閉約4h；

(5)抗原抗體反應(yīng)：分別加一抗和內(nèi)參照GAPDH抗體(用PBST稀釋成1：1000的濃度)，37℃搖床中結(jié)合3～4h或置于4℃過夜，PBST洗15min×3次；加IgG二抗(用PBST稀釋成1：1000)，37℃搖床中結(jié)合1～2h，PBST洗15min×3次；

(6)顯影：將PVDF膜置于化學(xué)發(fā)光試劑中反應(yīng)1～3min；在暗室中使X光片曝光，常規(guī)方法顯影定影；

(7)定量：凝膠成像系統(tǒng)掃描分析條帶光密度值(OD值)。計(jì)算每個(gè)蛋白條帶光密度值與內(nèi)參照GAPDH光密度值的比值，代表各樣品的蛋白表達(dá)水平。

免疫印跡檢測證實(shí)TRPA1在WT小鼠腎臟近端小管和豬近端小管細(xì)胞系有表達(dá)(圖2A)。

二、用免疫熒光法檢測TRPA1和UCP2在近端小管上皮細(xì)胞表達(dá)情況。具體方法如下：

(1)細(xì)胞準(zhǔn)備。將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次。

(2)固定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。PBS洗滌3×5min。

(3)通透。使用交聯(lián)劑(多聚甲醛)固定通透5-15min。通透后用PBS洗滌3×5min。

(4)封閉。使用封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間30min。

(5)一抗結(jié)合。4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min。

(6)二抗結(jié)合。室溫避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。

(7)封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

免疫熒光結(jié)果提示TRPA1和UCP2在原代培養(yǎng)的近端小管上皮細(xì)胞有表達(dá)(圖2B)。

三、桂皮醛干預(yù)對(duì)近端小管鈣內(nèi)流影響

細(xì)胞鈣測定方法如下：

(1)將細(xì)胞消化之后離心，F(xiàn)ura-2(Sigma，美國)鈣染料(5μM)37℃避光孵育40min。

(2)PBS清洗3次。

(3)300ul無鈣HBSS重懸后，加入96孔板，100ul/孔。

(4)加入桂皮醛(CA，10uM)和/或TRPA1抑制劑HC-030031(3uM)刺激。

(5)Prism軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

結(jié)果提示在LLC-PK1細(xì)胞，桂皮醛通過激活TRPA1能促進(jìn)鈣內(nèi)流,使用TRPA1抑制劑HC-030031能顯著抑制桂皮醛導(dǎo)致的鈣內(nèi)流(圖2C)。

實(shí)施例3桂皮醛對(duì)高鹽攝入小鼠近端小管TRPA1、NHE3和Na⁺/K⁺-ATP酶表達(dá)的影響

用免疫印跡法(Western blot)檢測桂皮醛對(duì)高鹽攝入小鼠近端小管TRPA1、NHE3和Na⁺/K⁺-ATP酶表達(dá)的影響(具體參照實(shí)施例2中的免疫印跡法)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)桂皮醛可以防止高鹽攝入導(dǎo)致的近端小管TRPA1表達(dá)減少(圖3A,圖3B)，高鹽攝入會(huì)顯著增加近端小管NHE3和Na⁺/K⁺-ATP酶的表達(dá)，而桂皮醛可以抑制高鹽導(dǎo)致的NHE3和Na⁺/K⁺-ATP酶表達(dá)增加；桂皮醛的效應(yīng)在TRPA1^-/-小鼠缺失(圖3C、圖3D、圖3E)。說明桂皮醛是通過激活近端小管TRPA1，抑制NHE3和Na⁺/K⁺-ATP酶的表達(dá)來抑制尿鈉重吸收。

結(jié)論：膳食補(bǔ)充桂皮醛激活TRPA1可以促進(jìn)腎臟尿鈉排泄，改善高鹽飲食導(dǎo)致的腎臟損傷。其機(jī)制與抑制腎臟近端小管NHE3和Na⁺/K⁺-ATP酶的表達(dá)減少尿鈉重吸收有關(guān)。