本發明涉及一種生物制品領域，具體涉及一種凍干疫苗耐熱保護劑及其制備方法和應用。
背景技術：
：凍干保護劑可能影響生物制品的質量、效價和穩定性，耐熱凍干保護劑有免疫活性而無藥理活性，它不僅具有保護制品生物學活性的作用，而且具有賦形劑和抗氧化劑的作用，直接與疫苗的滴度和穩定性相關聯，可在凍干和保存時維持疫苗的穩定性，確保制品在2～8℃條件下，保存期可長達24個月，效價無明顯下降，即使在37℃條件下也可以保存十天以上，從而解決了常規疫苗在長途運輸、長期保存和使用過程中不耐熱、儲存溫度低、保存期短和苛刻的冷凍條件造成大量能源浪費等難題。但國內疫苗企業常用的凍干保護劑組方簡單，保護性能差。如果在2～8℃條件下保存，保存期只有短短的3～6個月，大多需要在-15℃條件下保存。這就要求疫苗在保存、運輸和使用過程中盡可能在低溫條件下進行，否則疫苗的效價就會大打折扣。而在疫苗生產、運輸和使用過程中，如果任何一個環節的冷鏈系統控制不當，高溫環境就會導致疫苗效力下降，最終因免疫失敗而造成疫病流行。因此，提供耐熱型的疫苗就具有重要的意義。近年來，耐熱保護劑在獸用生物制品的凍干疫苗中得到了廣泛應用，給凍干疫苗的運輸和保存帶來了極大的方便，同時保證了疫苗的質量。通過大量研究者的努力，我國現階段已具備多種病毒的耐熱保護劑，少部分已達到國際水平。然而，一種耐熱保護劑適用于不同病毒的保護劑研究較少。不同的病毒需要不同的耐熱保護劑，同時需要不同的凍干工藝，這給疫苗企業的生產帶來了極大的不便。因此，一種凍干疫苗耐熱保護劑能適用于兩種及以上病毒的凍干就顯得尤為重要。技術實現要素：[要解決的技術問題]本發明的目的是解決上述現有技術問題，提供一種凍干疫苗耐熱保護劑及其制備方法和應用。[技術方案]為了達到上述的技術效果，本發明采取以下技術方案：一種凍干疫苗耐熱保護劑，它包括以下質量百分比的原料：0.3～0.6％的L-谷氨酸鈉、8～14％的蔗糖、2～5％的D-山梨醇、1～3％的牛血清白蛋白、0.1～0.3％的聚乙烯吡咯烷酮、0.2～1％的硫脲、3～5％的NZ-AmineAS、0.8～1.5％的水解明膠，余量為pH7.2的PBS。一種上述的凍干疫苗耐熱保護劑的制備方法，它包括以下步驟：A，組方Ⅰ的配制：按配比稱取L-谷氨酸鈉、蔗糖、D-山梨醇、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、硫脲和NZ-AmineAS，分別用PBS充分溶解后混合均勻，然后經0.22μm除菌濾器過濾后，4℃保存備用；B，組方Ⅱ的配制：按配比稱取水解明膠，用PBS在70℃條件下充分溶解后，經115℃滅菌20min，然后置37℃保存備用；C，用PBS調節組方Ⅰ與組方Ⅱ的體積比為3：1，然后將組方Ⅰ和組方Ⅱ混合均勻后，得到所述的凍干疫苗耐熱保護劑。上述的凍干疫苗耐熱保護劑的應用，該凍干疫苗耐熱保護劑用于豬偽狂犬病毒或豬繁殖培養液與呼吸綜合征病毒培養液的凍干。根據本發明更進一步的技術方案，所述豬偽狂犬病毒為Bartha-k61株，豬繁殖與呼吸綜合征病毒為JXA1-R株。根據本發明更進一步的技術方案，所述凍干的工藝包括以下步驟：(1)將凍干疫苗耐熱保護劑與豬偽狂犬病毒培養液或豬繁殖與呼吸綜合征病毒培養液混合配苗；然后按2mL/瓶進行分裝；(2)將分裝好的豬偽狂犬病毒培養液或豬繁殖與呼吸綜合征病毒培養液依次經預凍階段、一次干燥和解析干燥，密封后完成凍干，得到豬偽狂犬疫苗凍干產品或豬繁殖與呼吸綜合征疫苗凍干產品。根據本發明更進一步的技術方案，在所述凍干的工藝的步驟(2)中，凍干疫苗耐熱保護劑與豬偽狂犬病毒培養液按體積比為1:3進行配苗；或者將凍干疫苗耐熱保護劑與豬繁殖與呼吸綜合征病毒培養液按體積比為1:4進行配苗。根據本發明更進一步的技術方案，在所述凍干的工藝的步驟(2)中，所述預凍階段是指在1h內將病毒培養液從常溫降至-42℃后，維持該溫度放置3h；所述一次干燥是將經預凍階段的病毒培養液的溫度在0.5h從-42℃升溫至-5℃，維持該溫度并控制壓力為0.12mbar放置2h；接著10min將病毒培養液的溫度從-5℃升溫至0℃，維持該溫度并控制壓力為0.12mbar放置12h；最后10min將病毒培養液的溫度從0℃升溫至10℃，維持該溫度并控制壓力為0.12mbar放置1.5h；所述解析干燥是至將經一次干燥的病毒培養液的溫度在0.5h從10℃升溫至30℃，維持該溫度并控制壓力為0.22mbar放置5h；然后1min將病毒培養液的溫度從30℃降溫至28℃，維持該溫度并控制壓力為0.00mbar放置1h。下面將詳細地說明本發明。本發明中，NZ胺(NZ-AmineAS)，又稱為酪蛋白的酶促水解物。蔗糖具有滲透作用，能抑制有害微生物生長，延長產品保藏期，具有很好的水溶性；可提高微生物存活率，形成均一懸液，起到水分緩解作用，可防止活性組分變性；蔗糖與聚乙烯吡咯酮(PVP)聯合使用，可起到良好的低溫、干燥保護劑作用；同時，蔗糖、聚乙烯吡咯酮(PVP)可作為凍干劑，能防止和減少冷凍過程結晶水的形成；明膠、山梨醇可防止有效成分隨水蒸氣一起升華逸散，并對微生物有保護作用，可促進升華形成耐熱骨架，阻斷熱傳導和熱輻射；此外，牛血清白蛋白、明膠均為高分子化合物，能夠對微生物起保護作用，促進升華形成耐熱骨架阻斷熱傳導和熱輻射；硫脲作為抗氧化劑可以通過抑制氧化酶的活性而防止凍干樣品的氧化變質；PBS緩沖液的主要目的是為了保證病毒培養液加入凍干疫苗耐熱保護劑后，可以有效保證pH值不產生較大的波動，以避免引起病毒蛋白的變性，此外，由于本發明中PVP的添加，可以有效抑制PBS緩沖液中磷酸氫二鈉的結晶，從而抑制了這個混合液中的pH降低；L-谷氨酸鈉是作為氨基酸類保護劑可用于病毒微生物的保護。本發明制備的凍干疫苗耐熱保護劑可以用于兩種病毒培養液的凍干，因此需要合理配比各種原料的質量百分含量，保證豬偽狂犬病毒培養液或豬繁殖與呼吸綜合征病毒培養液兩種培養液在進行凍干過程中都有較好的效果，以使制備得到疫苗凍干產品效果好。將本發明耐熱凍干保護劑應用于豬偽狂犬病毒或豬繁殖培養液與呼吸綜合征病毒培養液的凍干，得到的凍干疫苗放置于37℃7日后，測定病毒含量，與放置前相比病毒含量降低不超過1個滴度。[有益效果]本發明與現有技術相比，具有以下的有益效果：本發明的耐熱凍干保護劑配方簡單，制備容易，適于大規模生產，對疫苗具有良好的保護功效。制得的疫苗無菌安全，且性狀穩定，具有耐熱、保存時間長的特點，解決了疫苗在運輸過程中需要低溫冷凍、貯存不便等問題。本發明的耐熱凍干保護劑可以使兩種耐熱活疫苗在2～8℃條件下均能保存24個月，且疫苗效價達標。此外，兩種疫苗的凍干工藝一致，為凍干疫苗的生產帶來了極大的便利。提高了凍干疫苗的產品競爭力和影響力。具體實施方式下面結合本發明的實施例對本發明作進一步的闡述和說明。實施例11.豬偽狂病毒的培養及收獲Vero細胞的傳代及培養：待培養瓶中Vero細胞長滿單層時，棄掉細胞培養液，用含0.25％胰酶的細胞消化液消化細胞，待培養瓶中消化細胞在倒置顯微鏡下觀察呈圓縮狀時，立即向培養瓶中加入細胞生長液，振蕩培養瓶，使細胞消化分散成單個細胞，將消化后的細胞按1:3的比例進行細胞下一個代次的培養。病毒的增殖培養及收獲：從-70℃超低溫冰箱中取PRVBartha-k61株濕毒，按1％(V/V)接毒比例接種已長滿單層的Vero細胞培養瓶中，接種繼續培養觀察，待細胞出現病變達80％以上時進行收獲，將培養瓶于-20℃凍融1次后收集病毒液，將收集的病毒液于-70℃保存備用。2.凍干疫苗耐熱保護劑的制備按照表1的配方進行凍干疫苗耐熱保護劑的制備：表1為凍干疫苗耐熱保護劑個配方的配方表組方Ⅰ的配制：將表1中的L-谷氨酸鈉、蔗糖、D-山梨醇、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、硫脲和NZ-AmineAS按配比分別用PBS充分溶解后混合，經0.22μm除菌濾器過濾后，37℃保存備用；組方Ⅱ的配制：將水解明膠按上述配比用PBS在70℃條件下充分溶解后，經115℃，20min滅菌后，37℃保存備用；用PBS調節組方Ⅰ與組方Ⅱ的體積比為3：1，然后將組方Ⅰ和組方Ⅱ混合均勻后，得到所述的凍干疫苗耐熱保護劑A、B、C。3.豬偽狂病耐熱保護劑活疫苗的制備收獲的豬偽狂犬病毒培養液經無菌和病毒含量測定合格后，與上述制備的耐熱保護劑3個配方(A、B、C)分別按體積比為3:1進行配苗，2.0ml/瓶進行分裝，然后利用冷凍真空干燥機進行凍干，同時設立牛奶蔗糖保護劑(常規保護劑)為對照組。凍干工藝如下：預凍階段：常溫進箱，1小時內將制品降至-42℃并維持3小時；一次干燥：0.5小時將制品從-42℃升至-5℃，維持2小時，壓力0.12mbar；10分鐘將制品溫度從-5℃升至0℃，維持13小時，壓力0.12mbar；10分鐘將制品溫度從0℃升至10℃，維持1.5小時，壓力0.12mbar；解析干燥：0.5小時將制品溫度從10℃升至30℃，維持5小時，壓力0.22mbar；1分鐘將制品溫度從30℃降至28℃，維持1小時，壓力0.00mbar；最后加塞出箱完成凍干。4.豬偽狂犬病耐熱保護劑活疫苗凍干后檢測將耐熱保護劑的配方A、配方B、配方C及對照組凍干的成品按照現行《中國獸藥典》要求進行檢測，包括物理性狀、無菌檢驗、鑒別檢驗、真空度檢驗、剩余水分含量檢測，所有檢測項目均合格。病毒含量測定：將疫苗用無血清DMEM細胞培養液稀釋為1頭份/ml，再做10倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-6共4個稀釋度，分別接種已長成良好單層、棄去細胞培養液的96孔Vero細胞培養板，每個稀釋度接種6孔，每孔0.1ml，同時設正常細胞對照。置37℃、含5％CO2培養箱中吸附1小時后，每孔補加含4％新生牛血清的DMEM細胞培養液0.1ml。置37℃、含5％CO2培養箱中培養觀察5日，根據Reed-Muench法計算TCID50。每頭份病毒含量應≥105.5TCID50。各配方凍干前后病毒含量見表2。從表中可以看出耐熱保護劑配制的苗凍干前后病毒含量損失最大為0.12個滴度，然而常規保護劑損失達到0.41個滴度。表2為豬偽狂犬病活疫苗各耐熱保護劑配方的病毒含量(TCID50/頭份)測定結果狀態配方A配方B配方C對照凍干前106.25106.25106.25106.25凍干后106.13106.16106.13105.84耐老化試驗：將制備的3批疫苗及對照組各取5瓶在37℃放置7日，然后各隨機取3瓶，測定PRV的TCID50。結果見表3。表3豬偽狂犬病活疫苗各耐熱保護劑配方耐老化結果(病毒含量：TCID50/頭份)配方放置前37℃放置7日后下降滴度配方A106.13105.75、105.69、105.64分別下降0.38、0.44、0.49配方B106.16105.84、105.75、105.84分別下降0.32、0.41、0.32配方C106.13105.69、105.64、105.5分別下降0.44、0.49、0.63對照組105.84104.24、104.16、104.0分別下降1.60、1.68、1.84從表中可以看出，耐熱保護劑配方制備的苗耐老化后病毒含量下降滴度均不超過0.7，而常規保護劑下降滴度為1.6以上。保存期試驗：將制備的3批疫苗及對照組各取7瓶，放置于2～8℃保存，分別在放置后第1、3、6、12、18、24、30個月各取其中1瓶測定病毒含量，觀察該疫苗的保存期。具體結果見表4。從表中可以看出，耐熱保護劑配方凍干的疫苗在2～8℃保存條件下，均可以保存24個月。然而，常規保護劑凍干疫苗的保存期則只有6個月。表4為豬偽狂犬病活疫苗各耐熱保護劑配方保存期結果(病毒含量：TCID50/頭份)實施例21.豬繁殖與呼吸綜合征病毒的培養及收獲細胞的傳代及培養：待細胞培養瓶中Marc-145細胞長滿單層時，棄掉生長液，用含0.25％胰酶的消化細胞，待培養瓶中消化細胞在倒置顯微鏡下觀察呈圓縮狀時，立即向培養瓶中加入細胞生長液，振蕩培養瓶，使細胞消化分散成單個細胞，將消化后的細胞按1:4的比例進行擴大培養。病毒的增殖培養及收獲：從-70℃冰箱中取PRRSVJXA1-R株種毒，按0.5％(V/V)接毒比例接種已長滿單層的Marc-145細胞培養瓶中，接種后繼續培養觀察，待細胞出現病變達75％以上時收獲，將培養瓶于-20℃凍融1次后收集病毒液，將收集的病毒液于-70℃保存備用。2.凍干疫苗耐熱保護劑的制備該實例的耐熱保護劑配方見表1。組方I的配制：將上述L-谷氨酸鈉、蔗糖、D-山梨醇、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、硫脲和NZ-AmineAS按表1的配比分別用PBS充分溶解后混合，經0.22μm除菌濾器過濾后，37℃保存備用；組方Ⅱ的配制：將水解明膠按上述配比用PBS在70℃條件下充分后，經115℃，20min滅菌后，37℃保存備用。用PBS調節組方Ⅰ與組方Ⅱ的體積比為3：1，然后將組方Ⅰ和組方Ⅱ混合均勻后，得到所述的凍干疫苗耐熱保護劑A、B、C。3.豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護劑活疫苗的制備收獲的豬繁殖與呼吸綜合征病毒培養液經無菌檢驗和病毒含量測定合格后，與上述制備的耐熱保護劑3個配方分別按體積比為4:1進行配苗，2.0ml/瓶進行分裝，然后利用冷凍真空干燥機進行凍干，同時設立牛奶蔗糖保護劑為對照組。凍干工藝如下：預凍階段：常溫進箱，1小時內將制品降至-42℃并維持3小時；一次干燥：0.5小時將制品從-42℃升至-5℃，維持2小時，壓力0.12mbar；10分鐘將制品溫度從-5℃升至0℃，維持13小時，壓力0.12mbar；10分鐘將制品溫度從0℃升至10℃，維持1.5小時，壓力0.12mbar；解析干燥：0.5小時將制品溫度從10℃升至30℃，維持5小時，壓力0.22mbar；1分鐘將制品溫度從30℃降至28℃，維持1小時，壓力0.00mbar；最后加塞出箱完成凍干。4.豬繁殖與呼吸綜合征耐熱保護劑活疫苗凍干后檢測將耐熱保護劑的配方A、配方B、配方C及對照組凍干的成品按照現行《中國獸藥典》要求進行檢測，包括物理性狀、無菌檢驗、鑒別檢驗、真空度檢驗、剩余水分含量檢測，所有檢測項目均合格。病毒含量測定：將疫苗用無血清DMEM細胞培養液稀釋為1頭份/ml，再做10倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-64個稀釋度，分別接種已長成良好單層、棄去細胞培養液的96孔Marc-145細胞培養板，每個稀釋度接種6孔，每孔0.1ml，同時設正常細胞對照。置37℃、含5％CO2培養箱中吸附1小時后，每孔補加含4％新生牛血清的DMEM細胞培養液0.1ml。置37℃、含5％CO2培養箱中培養觀察5日，根據Reed-Muench法計算TCID50。每頭份病毒含量應≥105.5TCID50。各配方凍干前后病毒含量見表5，表中數據表明采用耐熱保護劑的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗凍干前后病毒含量損失最大為0.2個滴度，常規保護劑凍干前后病毒含量損失達到0.36個滴度。表5豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗各耐熱保護劑配方的病毒含量(TCID50/頭份)測定結果狀態配方A配方B配方C對照凍干前106.36106.36106.36106.36凍干后106.25106.20106.16106.0耐老化試驗：將制備的3批疫苗及對照組各取5瓶在37℃放置7日，然后各取3瓶，測定PRRSV的TCID50。結果見表6。表中顯示：耐熱保護劑配方制備的苗耐老化后病毒含量下降滴度均不超過0.6，而常規保護劑下降滴度為1.6以上。表6豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗各耐熱保護劑配方耐老化結果(病毒含量：TCID50/頭份)配方放置前37℃放置7日后下降滴度配方A106.25105.84、105.75、105.75分別下降0.41、0.5、0.5配方B106.20105.69、105.64、105.88分別下降0.51、0.56、0.32配方C106.16105.64、105.69、105.64分別下降0.52、0.47、0.52對照組106.0104.31、104.25、104.36分別下降1.69、1.75、1.64保存期試驗：將制備的3批疫苗及對照組各取7瓶，放置于2～8℃保存，分別在放置后第1、3、6、12、18、24、30個月各取其中1瓶測定病毒含量，觀察該疫苗的保存期。具體結果見表7。表中數據顯示：耐熱保護劑配方凍干的疫苗在2～8℃保存條件下，均可以保存24個月。然而，常規保護劑凍干疫苗的保存期則只有3個月。表7豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗各耐熱保護劑配方保存期結果(病毒含量：TCID50/頭份)綜上所述，本發明的保護劑經過無菌處理后應用于豬偽狂犬病活疫苗和豬繁殖與呼吸道綜合征活疫苗的凍干。兩種病毒采用同樣的耐熱保護劑和凍干工藝，凍干損失低于0.2個滴度，37℃放置7日，病毒含量滴度降低小于1個滴度，能在2～8℃保存24個月。為凍干疫苗的生產提供了便利，同時也提高了產品質量及競爭力。盡管這里參照本發明的解釋性實施例對本發明進行了描述，上述實施例僅為本發明較佳的實施方式，本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，應該理解，本領域技術人員可以設計出很多其他的修改和實施方式，這些修改和實施方式將落在本申請公開的原則范圍和精神之內。當前第1頁1 2 3