本發明涉及生物醫學技術領域，具體是涉及高致病性豬葡萄球菌分泌蛋白在作為亞單位疫苗中的應用。

背景技術：

豬滲出性表皮炎是哺乳仔豬或早期斷乳仔豬因感染豬葡萄球菌而引起的一種急性致死性淺表膿皮炎，以全身油脂樣滲出性皮炎為特征并具有高度傳染性的疾病。世界上大多數國家的哺乳仔豬和斷奶仔豬都有滲出性皮炎，發病率10％～90％，死亡率5％～90％。近年來豬滲出性皮炎在國內外豬場的發生率也逐漸增高，雖然國內外對豬葡萄球菌的研究己有不少，但它的毒力及其致病機理至今仍不十分明確。

本實驗室于2011年從增城某豬場分離得到一株高致病性豬葡萄球菌(S.hycius,命名為ZC-4)，之后對其致病性以及分子機理進行了較深入的研究。目前我們用免疫蛋白質組學的方法，篩選得到了多個具有免疫原性的豬葡萄球菌蛋白，經過篩選，發現了其分泌蛋白enolase具有較好的免疫原性。而目前對豬葡萄球菌的研究主要基于基因水平和細胞水平，在蛋白水平上的研究較少，而對于豬葡萄球菌在蛋白水平上的研究也未見相關報道。

技術實現要素：

本發明解決的技術問題是：提供一種高致病性豬葡萄球菌(S.hycius,命名為ZC-4)的分泌蛋白在作為亞單位疫苗中的應用，該分泌蛋白具有較好的免疫保護能力，能夠預防豬葡萄球菌感染。

本發明的技術方案是：一種高致病性豬葡萄球菌的分泌蛋白在作為亞單位疫苗中的應用。

進一步地，所述的分泌蛋白在作為預防豬葡萄球菌感染的亞單位疫苗中的應用。

進一步地，所述分泌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

進一步地，制備所述的高致病性豬葡萄球菌的分泌蛋白亞單位疫苗的方法，其特征在于：將豬葡萄球菌的分泌蛋白中加入佐劑、賦形劑、凍干穩定劑，攪拌均勻，即成。

更進一步地，所述的佐劑為水性佐劑或油性佐劑或其他佐劑混合使用，如本領域常見的白油佐劑、鋁膠佐劑、弗氏佐劑等等。所述賦形劑選自氨基乙酸。

進一步地，所述高致病性豬葡萄球菌的分泌蛋白的制備為重組蛋白的原核表達，具體步驟如下：

1)細菌培養；

2)基因組DNA提取；

3)Enolase基因克?。篜CR擴增；

4)Enolase表達載體構建：所用原核表達載體為pET32a；

5)Enolase重組蛋白表達；

6)重組Enolase過鎳柱純化。

本發明的有益效果是：高致病性豬葡萄球菌(S.hycius,命名為ZC-4)其分泌蛋白enolase具有較好的免疫原性，保護率達到60％，免疫小鼠和仔豬后能誘導較高抗體水平。攻毒保護力實驗表明該蛋白能夠增強小鼠和仔豬對豬葡萄球菌的抵抗力，將其作為亞單位疫苗能夠預防豬葡萄球菌感染。

附圖說明

圖1A為豬葡萄球菌分泌蛋白ENO的IPTG誘導表達及其免疫原性分析結果；

圖1B為分離純化后的Enolase重組蛋白ENO。

圖2為用純化的Enolase重組蛋白(ENO)處理后的BALB/c小鼠的血清細胞因子水平，其中，圖2C為注射ENO第3小時的結果；圖2D為注射ENO第24小時的結果。

圖3A，第一次免疫后28天Enolase重組蛋白(ENO)的抗體的水平；

圖3B，Enolase重組蛋白ENO免疫應答小鼠的存活率。

具體實施方式

一種高致病性豬葡萄球菌的分泌蛋白在作為預防豬葡萄球菌感染引起的豬滲出性表皮炎的亞單位疫苗中的應用。所述分泌蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

制備所述的高致病性豬葡萄球菌的分泌蛋白亞單位疫苗的方法為：將豬葡萄球菌的分泌蛋白中加入弗氏佐劑、賦形劑、凍干穩定劑，攪拌均勻，即成。

所述高致病性豬葡萄球菌的分泌蛋白的制備方法為重組蛋白的原核表達，具體步驟如下：

1)細菌培養：將凍存的豬葡萄球菌(S.hycius,命名為ZC-4)菌種劃線接種于LB平板上，37℃振蕩培養約12小時；

2)基因組DNA提?。簩⑸鲜雠囵B菌液按照細菌基因組提取試劑方法提取基因組DNA；

3)Enolase基因克?。阂陨鲜鯠NA為模板進行PCR擴增，反應體系：10×PCR buffer緩沖液2.5-5ul，Mg²⁺試劑5-10ul，PCR引物5-10ul，Taq DNA聚合酶2-5ul，加純化水補足至25ul；反應條件為：94℃3min；94℃30s、45℃30s、72℃40s，30個循環；72℃10min，得到PCR擴增產物；

4)Enolase表達載體構建：以pET32a為載體，經過酶切連接轉化得到重組質粒，得到含目的基因的重組質粒；

5)Enolase重組蛋白表達：用上述重組質粒轉化BL21(DE3)，用IPTG誘導，表達重組蛋白；

6)重組Enolase過鎳柱純化。

實驗驗證

1.豬葡萄球菌的分泌蛋白的免疫原性驗證：

鑒定蛋白質的免疫原性驗證為了驗證鑒定通過免疫蛋白質組學分析獲得蛋白質的免疫原性，取豬葡萄球菌分泌蛋白(烯醇化酶)ENO進行生物功能驗證。通過SDS-PAGE分析，該ENO蛋白在大腸桿菌中高度正確地表達，如圖3所示。通過Western blot分析證明分泌蛋白ENO可與針對ZC-4的豬血清反應，如圖3A所示。這表明這種蛋白表現出免疫原性。

使用Ni2+的瓊脂糖凝膠柱對重組蛋白ENO進行進一步的分離純化后的免疫原性，結果如圖3B所示。

圖1A中，泳道：M，10kDa的-170kDa的預染蛋白分子量標記；2，通過1mM IPTG誘導重組ENO；3，重組蛋白ENO的免疫印跡分析(與S.hycius感染的陽性血清反應)。

圖1B中，泳道：M，10kDa的-170kDa的預染蛋白分子量標記；1，重組ENO的純化。

2.豬葡萄球菌分泌蛋白對小鼠的免疫功能驗證：

用純化的豬葡萄球菌的分泌蛋白對小鼠進行注射，收集小鼠血液樣本，并對收集的小鼠血液樣本的細胞因子水平進行測定，并在第3小時和第24小時通過蛋白質芯片測定白細胞介素(IL)-6，IL-8，IL-12和INF-γ，在第3小時和第24小時這兩組小鼠G-CSF和MCP-5的水平顯著升高(P<0.05)，IL-12p40p70顯著增加(P<0.05)。

用純化蛋白注射BALB/c小鼠，并在3小時和24小時后測定所收集血液樣品的細胞因子水平。

3.ENO作為對S.hycius亞單位疫苗在小鼠體內的血免疫保護試驗：

于0，7，14，21和28天從免疫小鼠和對照小鼠的尾靜脈收集血液，通過ELISA測量這些時間抗體的水平。28天第一次免疫后得到的值。結果表明，治療組的抗體水平明顯高于PBS中的抗體水平，PBS組的血清是作為陰性對照，HIS治療組和PBS組無顯著差異(P<0.05)。

為了評估針ENO蛋白疫苗對S.hycius ZC-4感染的效果，用300uL 2.8×10⁹CFU/毫升ENO對S.hycius小鼠進行免疫應答。PBS和他組小鼠在免疫12小時死亡，24小時后，兩組有83.3％(5/6)和80％(4/5)的死亡率。而在ENO免疫組小鼠開始挑戰后24小時后死亡，36小時后，他們有40％(2/5)的死亡率。ENO，HIS和對照組有5只小鼠，PBS組有6只小鼠，對照組不感染S.hycius ZC-4，于免疫后0，6，20，48，60，72小時觀察到的生命或死亡情況。

上述結果表明，用ENO免疫小鼠后可以預防小鼠感染豬葡萄球菌S.hyciusZC-4。

以上述依據本發明的理想實施例為啟示，通過上述的說明內容，相關工作人員完全可以在不偏離本項發明技術思想的范圍內，進行多樣的變更以及修改。本項發明的技術性范圍并不局限于說明書上的內容，必須要根據權利要求范圍來確定其技術性范圍。