本發明涉及醫藥技術領域，特別涉及一種用于成像和光熱治療的磁性納米材料和制備方法及應用。

背景技術：

隨著生物技術和納米科學的快速發展，近紅外激光介導的光熱治療已逐漸作為一種具有廣闊前景的替代療法用于腫瘤治療。光熱治療是一種侵襲性較小的局部治療方式。當腫瘤區域暴露于近紅外激光輻照范圍時，富集在腫瘤區域的光熱轉換試劑能夠將光能轉換為熱能，有效殺傷腫瘤細胞。與傳統療法(如手術切除，化療，放療等)相比，光熱治療具有非侵襲性、高選擇性、高治療效率，對周圍健康組織損傷小等優勢。目前研究較多的光熱轉換試劑主要有貴金屬納米材料，碳納米材料，銅硫屬化合物，有機聚合物等。盡管取得了一定進展，絕大多數光熱轉換試劑具有難以代謝、非降解性，可能引起潛在的長期毒性(如氧化應激、肺炎等)。而且，它們缺乏臨床診斷和實時動態監測深部組織的能力，臨床應用受到限制。

磁共振成像作為一種具有高空間分辨力的多方位多參數成像模態，在臨床腫瘤診斷方面具有極大的價值。憑借優異的磁學性能，氧化鐵納米顆粒已被廣泛應用于磁共振對比增強，藥物遞送，磁熱療等研究。目前，有多篇文獻報道了基于氧化鐵納米顆粒的雜合納米材料用于磁共振成像引導下的光熱治療，如將金、硫化銅、二硫化鉬、石墨烯、二硫化鎢等光熱模塊包被在氧化鐵納米顆粒表面。然而，這些材料均需要繁瑣的合成步驟將不同功能組分整合至同一納米平臺，因此合成繁瑣，成本高。

最近發現單組分的磁性材料也具有一定的光熱轉換能力，如四氧化三鐵納米顆粒，四氧化三鐵納米團簇等。也有文獻將具有近紅外區吸收的聚合物包被在四氧化三鐵納米材料表面以提高其光熱轉換效率，如聚吡咯、聚多巴胺等。然而，這些納米顆粒多采用溶劑熱法或熱沉積法合成，需要較長的反應時間、嚴苛的反應條件、繁瑣的配體交換、復雜的化學修飾。

黑色素是一種廣泛存在于生物體各組織內的天然聚合物。它具有良好的生物相容性，生物可降解性及較強的近紅外區吸收，是一種理想的光熱轉換試劑。有文獻利用黑色素優異的金屬離子螯合能力，在已合成的黑色素納米顆粒表面吸附鐵離子，錳離子，銅64離子等，進行多模態成像指導下的光熱治療，取得了較好的效果。然而，由于金屬離子是通過螯合作用吸附在納米顆粒表面，具有脫落的風險。

因此，迫切需要開發出一種簡單溫和的方法來制備具有良好生物相容性和良好光熱轉換能力的新型磁性納米顆粒。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種用于成像和光熱治療的磁性納米材料，該材料具有非毒性和良好生物相容性，并且具有成像能力。

本發明的技術方案是：

用于成像和光熱治療的磁性納米材料，該材料是黑色素包被的氧化鐵納米顆粒。

該材料為水溶性的黑色素包被的氧化鐵納米顆粒。

每0.26mg黑色素包被1mg鐵。

本發明的第二個目的是提供一種用于成像和光熱治療的磁性納米材料的制備方法，該方法采用共沉淀法一步法合成水溶性的Fe₃O₄@mel NCs，具有溫和、簡單的優點。

本發明所述用于成像和光熱治療的磁性納米材料的制備方法，有以下步驟：

1)將FeCl₂·4H₂O和FeCl₃·6H₂O溶于5mL 1M HCl溶液中，充氮氣條件下加熱至90℃；

2)劇烈攪拌條件下，快速加入0.5mL濃度為28vol.％的NH₄OH溶液，反應20秒。隨后，在1分鐘內加入5mL黑色素溶液，90℃下攪拌30分鐘；

3)溶液冷卻至室溫，磁分離直至溶液pH值為中性。收集沉淀，將得到的黑色素包被的氧化鐵納米顆粒分散在水中。其制備方法如下所示：

所述FeCl₂·4H₂O：FeCl₃·6H₂O重量比為1:2.72。

步驟2)所述黑色素溶液的濃度為1mg/mL，pH＝9.0。

本發明第三個目的是提供用于成像和光熱治療的磁性納米材料在制備用于磁共振成像制劑中的應用；

以及，用于成像和光熱治療的磁性納米材料在制備用于光聲成像制劑中的應用。

以及，用于成像和光熱治療的磁性納米材料在制備治療腫瘤光熱消融制劑中的應用。

所述腫瘤為皮下瘤。

申請人采用本發明所述的Fe₃O₄@mel NCs，進行磁共振、光聲雙模態成像和腫瘤光熱治療。實驗結果表明：紫外-可見光吸收光譜顯示合成的Fe₃O₄@mel NCs在808nm處的光吸收值與濃度存在良好的線性關系；對Fe₃O₄@mel NCs的磁共振、光聲成像及光熱轉換性能進行表征，光熱治療儀熱成像圖結果顯示在808nm激光照射下，Fe₃O₄@mel NCs溶液溫度升高呈濃度和激光功率依賴性；與多種商業化的氧化鐵納米顆粒相比，本發明所述的Fe₃O₄@mel NCs近紅外區吸收最高，光熱性能最好，在700nm激光激發下光聲信號強度最高，并且R2弛豫率更高；細胞毒性實驗結果表明合成的Fe₃O₄@mel NCs細胞毒性很低；Fe₃O₄@mel NCs注入荷瘤鼠腫瘤部位后，腫瘤部位光聲信號和磁共振信號立刻發生變化，并在1小時左右比較彌散；接受Fe₃O₄@mel NCs+激光輻照組的荷瘤鼠腫瘤明顯縮小，生長減慢；各主要臟器細胞形態學無明顯差異。

本發明合成的Fe₃O₄@mel NCs，是一種新型的多功能用于腫瘤診療一體化的納米材料，該材料將為開發和構建多功能納米診療平臺提供新思路，在生物醫學領域具有一定的應用前景。

附圖說明

圖1為一步法合成Fe₃O₄@mel NCs及其診療應用的示意圖；

圖2為Fe₃O₄@mel NCs的合成及表征；其中，圖2a為未加入黑色素的原始四氧化三鐵納米顆粒(左)及Fe₃O₄@mel NCs水溶液(右)；圖2b為Fe₃O₄@mel NCs的透射電鏡圖像；圖2c為磁化曲線；圖2d為傅立葉變換紅外光譜；

圖3為黑色素溶液及鐵含量標準吸收曲線；其中，圖3a，3b表示黑色素溶液在500nm處的標準吸收曲線；圖3c，3d表示鄰二氮菲法在510nm處檢測鐵含量；

圖4為Fe₃O₄@mel NCs的吸收光譜及水合尺寸；其中，圖4a表示不同濃度Fe₃O₄@mel NCs的紫外-可見光吸收光譜；圖4b表示Fe₃O₄@mel NCs水溶液在808nm處的吸收值-鐵濃度曲線；圖4c表示Fe₃O₄@mel NCs的水合尺寸；圖4d為表面電勢。

圖5為Fe₃O₄@mel NCs的磁、光、熱性能表征；其中，圖5a表示Fe₃O₄@mel NCs的R2弛豫率；圖5b表示不同濃度Fe₃O₄@mel NCs的光聲信號強度；圖5c表示不同濃度Fe₃O₄@mel NCs在2W/cm²激光輻照下的熱成像圖；圖5d表示Fe₃O₄@mel NCs(鐵濃度為10mM)在不同功率激光輻照下的熱成像圖；

圖6為Fe₃O₄@mel NCs的光熱轉換性能圖；其中，圖6a、圖6b為不同激光功率下Fe₃O₄@mel NCs的溫度變化；圖6c、圖6d為不同濃度Fe₃O₄@mel NCs在同一激光功率下的溫度變化。

圖7為Fe₃O₄@mel NCs與多種商業化的氧化鐵納米顆粒在同等濃度下(鐵濃度為10mM)的性能比較；其中，圖7a為紫外-可見光吸收光譜；圖7b為光熱轉換性能；圖7c為700nm激光激發下光聲信號強度；圖7d為R2弛豫率；

圖8為Fe₃O₄@mel NCs對U87MG細胞活性的影響；其中，圖8a為U87MG細胞經Fe₃O₄@mel NCs處理24小時后的細胞活性；圖8b為不同處理加激光輻照后細胞行鈣黃綠素和碘化丙啶共染的熒光圖像；圖8c為不同處理加激光輻照后細胞活性檢測結果；

圖9為Fe₃O₄@mel NCs被細胞有效攝取的情況；其中，圖9a為U87MG細胞和Fe₃O₄@mel NCs共孵育6小時后的細胞磁共振成像；圖9b為細胞光聲成像；圖9c為細胞普魯士藍染色；

圖10為體內光聲、磁共振雙模態成像；其中，圖10a為瘤內注射Fe₃O₄@mel NCs(25μL，2mg Fe/mL)前后不同時間點腫瘤部位光聲圖像；圖10b為瘤內注射Fe₃O₄@mel NCs(25μL，2mg Fe/mL)前后不同時間點腫瘤部位磁共振圖像；圖10c為腫瘤區域的光聲成像信號強度變化；圖10d為腫瘤區域的磁共振信號強度變化；

圖11為Fe₃O₄@mel NCs治療小鼠腫瘤的情況；其中，圖11a為U87MG荷瘤鼠經瘤內注射25μL Fe₃O₄@mel NCs 1小時后行光熱治療的熱成像圖；圖11b為不同分組小鼠在治療前后不同時間的腫瘤體積；圖11c為不同分組小鼠在治療前后不同時間的小鼠體重；圖11d為不同分組小鼠在治療前及治療后第15天圖片；

圖12為不同分組小鼠治療后第15天行蘇木精-伊紅染色圖片。

具體實施方式

本發明采用的試劑：

黑色素購自西格瑪奧德里奇公司；

商業化的氧化鐵納米顆粒分別購自美國大洋納米科技有限公司、法國加柏公司和中國萬德高科技有限公司；

其余試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

實施例1共沉淀法合成Fe₃O₄@mel NCs

將100umol，19.881mg的FeCl₂·4H₂O與200umol，54.058mg的FeCl₃·6H₂O溶于5mL 1M HCl溶液中，在充氮氣條件下加熱至90℃，劇烈攪拌條件下快速加入0.5mL的28vol.％NH₄OH溶液，反應20秒。隨后，在1分鐘內加入5mL黑色素溶液(1mg/mL，pH＝9.0)，90℃下攪拌30分鐘，冷卻至室溫，磁分離直至溶液pH值達到中性。收集沉淀，將獲得的Fe₃O₄@mel NCs分散于水中，參見圖1。

實施例2Fe₃O₄@mel NCs的合成及表征

透射電鏡觀察形貌：移取50uL Fe₃O₄@mel NCs溶液滴加在表面碳涂層銅網上，用濾紙吸走多余的溶液，室溫條件下自然風干。采用透射電子顯微鏡在200kV電壓條件下觀察納米顆粒的形貌、粒徑和分散情況。

振動樣品磁強計檢測磁學性能：稱量干燥后的粉末樣品約10mg，置于測試專用微量試管內，用脫脂棉塞緊壓實。采用振動樣品磁強計進行常溫性能測試：電源工作頻率86Hz，輸入功率5W，在電腦上X軸記錄磁場變化，Y軸記錄磁化強度變化。

傅里葉變換紅外光譜儀檢測化學基團：將真空干燥的溴化鉀粉末用瑪瑙研缽研磨，移取適量冷凍干燥后的待測樣品，將樣品和溴化鉀按照約1：100的質量比在研缽中再次混勻、研磨。在紅外烤燈照射下壓片制樣，將樣品放置在傅里葉紅外光譜儀上進行檢測。

透射電鏡結果表明成功制備尺寸均一的納米顆粒，其結果見圖2。圖2a顯示未加入黑色素的反應液在室溫靜置過夜后會發生聚沉，加入黑色素后，能夠顯著改善納米顆粒的水分散性。磁性測量數據表明Fe₃O₄@mel NCs的飽和磁化率為47.8emu/g，并且具有優異的磁響應性能。傅里葉變換紅外光譜表明黑色素成功包被在納米顆粒表面。

實施例3檢測Fe₃O₄@mel NCs中黑色素及鐵含量

配制不同濃度的黑色素溶液，采用全波長酶標儀測量其光學吸收情況。取500nm處光吸收值，作吸光度值-黑色素溶液濃度曲線，測量合成的Fe₃O₄@mel NCs中的黑色素含量。用(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O配制鐵標準浴液，采用標準鄰二氮菲法在510nm處作鐵濃度標準吸收曲線，測量合成的Fe₃O₄@mel NCs中的鐵含量。計算Fe₃O₄@mel NCs中黑色素和鐵的含量比例。

采用全波長酶標儀及鄰二氮菲法分別在500nm處及510nm處作吸收標準曲線，檢測產物中黑色素及鐵含量。測得每1mg Fe對應0.26mg黑色素，參見圖3。

實施例4紫外-可見光吸收光譜及水合尺寸檢測

配制不同濃度的Fe₃O₄@mel NCs，采用全波長酶標儀測量其光學吸收情況。取808nm處光吸收值，作吸光度值-Fe₃O₄@mel NCs溶液濃度曲線。

動態光散射儀檢測水合尺寸及表面電勢：取1mL Fe₃O₄@mel NCs溶液至樣品池中，置于粒度分析儀檢測腔體內。數據采集條件為衍射角173°，測試溫度25℃。

紫外-可見光吸收光譜顯示Fe₃O₄@mel NCs在808nm處的光吸收值與濃度存在良好的線性關系，動態光散射儀測得Fe₃O₄@mel NCs的水合尺寸約為91nm，表面電勢約-26.1mV，參見圖4。

實施例5Fe₃O₄@mel NCs的磁共振、光聲成像及光熱轉換性能表征

磁共振成像：配制不同鐵摩爾濃度的Fe₃O₄@mel NCs溶液。在室溫條件下，將樣品置于德國布魯克7.0T小動物磁共振成像儀進行實驗。測試參數設定：TR＝4000ms，TE＝45ms，視野為25×25mm。

光聲成像：配制不同鐵摩爾濃度的Fe₃O₄@mel NCs溶液。在室溫條件下，將樣品置于Endra128小動物光聲成像儀進行實驗。成像參數：能量，2.8毫焦；波長，700nm；角度，60°。

光熱轉換性能檢測：(1)配制鐵摩爾濃度為10mM的Fe₃O₄@mel NCs溶液，將溶液移至酶標儀孔板中，分別采用不同功率的808nm激光器對溶液進行照射5分鐘，用紅外溫度監測儀記錄激光照射時溶液的溫度變化情況。繪制成溫度-時間曲線，分析Fe₃O₄@mel NCs溶液溫度變化與激光功率的關系。(2)配制不同鐵摩爾濃度的Fe₃O₄@mel NCs溶液，將溶液移至酶標儀孔板中，采用功率為2W/cm²的808nm激光器對溶液進行照射5分鐘，同時用紅外溫度監測儀記錄材料進行激光照射時的溫度變化情況。繪制成溫度-時間曲線，分析Fe₃O₄@mel NCs溶液溫度變化與溶液濃度的關系。

對Fe₃O₄@mel NCs的磁共振、光聲成像及光熱轉換性能進行表征。7.0T小動物磁共振儀測得Fe₃O₄@mel NCs的T2信號強度隨著溶液濃度的升高而逐漸降低，其R2弛豫率約為246mM^-1S^-1，Endra128光聲成像結果顯示Fe₃O₄@mel NCs的光聲信號強度具有濃度依賴性；光熱治療儀熱成像圖結果顯示在808nm激光照射下，Fe₃O₄@mel NCs溶液溫度升高呈濃度和激光功率依賴性。參見圖5，圖6。

實施例6Fe₃O₄@mel NCs與商業化氧化鐵納米顆粒性能的比較

將合成的Fe₃O₄@mel NCs與三種商業化的氧化鐵納米顆粒進行性能比較：配制鐵摩爾濃度為10mM的四種納米顆粒溶液，分別采用全波長酶標儀測量其吸收光譜；采用功率為2W/cm²的808nm激光器對溶液進行照射5分鐘；采用Endra128小動物光聲成像儀進行檢測溶液在700nm波長處的光聲信號；采用布魯克7.0T小動物磁共振成像儀測量溶液的R2弛豫率。

由于有黑色素的包裹，在同等濃度下，本發明所述的Fe₃O₄@mel NCs在近紅外區吸收最高，因此光熱性能最好，并且在700nm激光激發下光聲信號強度最高。同時發現本發明所述的Fe₃O₄@mel NCs R2弛豫率明顯高于商業化的氧化鐵納米顆粒。參見圖7。

實施例7細胞毒性實驗及細胞光熱治療

細胞毒性實驗：將5000個U87MG細胞接種在96孔細胞培養板中，待細胞貼壁后，加入不同濃度梯度的Fe₃O₄@mel NCs，與細胞共孵育24小時。MTT實驗檢測Fe₃O₄@mel NCs對細胞活性的影響。細胞光熱治療：將5000個U87MG細胞接種在96孔培養板中，待細胞貼壁后，加入不同濃度梯度的Fe₃O₄@mel NCs，與細胞共孵育6小時。用磷酸鹽緩沖液清洗三次，加入100微升無血培養基，采用808nm激光器以1W/cm²的功率照射細胞5分鐘。對照組包括未處理組、僅NCs組和僅激光組。照射完成后，細胞繼續孵育4小時，MTT實驗檢測光熱治療對細胞活性的影響。

細胞毒性實驗結果表明合成的Fe₃O₄@mel NCs細胞毒性很低。人膠質瘤細胞U87MG與Fe₃O₄@mel NCs共孵育6小時后，進行光熱治療，發現Fe₃O₄@mel NCs加激光輻照組的細胞活性明顯低于其它對照組。表明Fe₃O₄@mel NCs可通過光熱效果有效殺傷腫瘤細胞。參見圖8。

實施例8細胞攝取實驗

細胞成像實驗：將U87MG細胞接種于10cm細胞培養皿，待細胞融合至80％左右時，加入不同濃度的Fe₃O₄@mel NCs，與細胞共孵育6小時。未進行處理的細胞作為對照。消化、離心、收集細胞。將細胞用1％的瓊脂糖分散，分別比較不同分組細胞的磁共振T2信號或在700nm波長處光聲信號。細胞普魯士藍染色實驗：將U87MG細胞接種于12孔細胞培養板，待細胞融合至80％左右時，加入不同濃度的Fe₃O₄@mel NCs，與細胞共孵育6小時。未進行處理的細胞作為對照。行普魯士藍染色，倒置顯微鏡進行觀察、拍照。

與Fe₃O₄@mel NCs共孵育6小時后，細胞磁共振T2信號顯著降低，光聲信號明顯增強。普魯士藍染色結果表明Fe₃O₄@mel NCs能夠被細胞有效攝取。參見圖9。

實施例9腫瘤光聲和磁共振雙模態成像

將Fe₃O₄@mel NCs(25μL，2mg Fe/mL)采用梅花注射法注入荷瘤鼠腫瘤部位后，分別在注射前、注射后5分鐘和注射后1小時對小鼠腫瘤部位行光聲成像和磁共振成像。比較不同時間點信號變化情況。

將Fe₃O₄@mel NCs(25μL，2mg Fe/mL)注入荷瘤鼠腫瘤部位后，腫瘤部位光聲信號和磁共振信號立刻發生變化，并在1小時左右比較彌散。參見圖10。

實施例10腫瘤光熱治療及療效監測

將Fe₃O₄@mel NCs(25μL，2mg Fe/mL)注入荷瘤鼠腫瘤部位后，在注射1小時后行光熱治療。對照組分為未處理組、僅NCs組和僅激光組。以2W/cm²的激光功率照射腫瘤部位8分鐘，采用紅外溫度監測儀動態記錄腫瘤部位溫度變化。療效監測：在不同分組小鼠治療前后不同時間點，每隔一天稱量一次小鼠體重，并用游標卡尺測量腫瘤體積。并分別在治療前和治療后第15天對小鼠進行大體拍照。

在注射1小時后行光熱治療，Fe₃O₄@mel NCs組腫瘤部位溫度可升高至51.3℃，而未注射組僅為39.4℃。動態監測不同分組小鼠在治療前后不同時間點的腫瘤體積和小鼠體重，與對照組相比，接受Fe₃O₄@mel NCs+激光輻照組的荷瘤鼠腫瘤明顯縮小，生長減慢。各組小鼠體重變化無明顯差異。參見圖11。

實施例11組織切片伊紅-蘇木精染色

在治療后第15天，10％水合氯醛麻醉小鼠。先用50mL生理鹽水經心臟沖洗血液后，再用50mL 4％多聚甲醛灌注。迅速分離并獲取心、肝、脾、肺、腎等主要臟器，浸泡于10％福爾馬林中。24小時后進行石蠟包埋。以5微米的層厚進行切片，脫蠟。組織切片浸入蘇木精染液中10分鐘，伊紅染色5分鐘，倒置顯微鏡觀察、拍照。

各主要臟器細胞形態學無明顯差異，表明納米顆粒具有較好的生物相容性。其結果參見圖12。