本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種腫瘤進(jìn)展位點(diǎn)2基因(tumorprogresslocus2，TPL2)作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著老齡人口的增加，都市化的生活以及生活方式的改變，肥胖、非酒精性脂肪肝病、代謝綜合征和糖尿病等代謝異常人群劇增，現(xiàn)已經(jīng)成為全球性的公眾健康的重要危害。Ⅱ型糖尿病(type2diabetesmellitus,T2DM)為非胰島素依賴型糖尿病。其病因?yàn)檫z傳、肥胖、高熱量飲食、體力活動(dòng)不足等。主要表現(xiàn)為胰島素敏感性下降。糖尿病目前作為慢性多發(fā)性疾病已經(jīng)成為全球關(guān)注的重點(diǎn)公共衛(wèi)生問題。中國(guó)的糖尿病人數(shù)已經(jīng)躍居世界第一。但針對(duì)糖尿病的治療，除胰島素替代療法外，還包括雙胍類及磺脲類等多種類型不同機(jī)制的口服藥物。目前無治療糖尿病的基因調(diào)節(jié)及治療制劑等。糖尿病慢性并發(fā)癥是導(dǎo)致糖尿病患者致死致殘的主要原因，不僅累及心腦血管、腎臟、視網(wǎng)膜、神經(jīng)等重要臟器和組織，肝臟也是其重要的靶器官之一。脂肪肝是指由于各種原因引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積過多的病變。脂肪肝為一種較為常見的臨床不良表現(xiàn)，可由多種疾病誘發(fā)，是眾多肝臟疾病對(duì)肝臟正常功能影響的綜合表現(xiàn)。臨床表現(xiàn)輕者無癥狀，重者可危及生命。其病因可分為多種，包括酒精性和非酒精性脂肪肝。其中非酒精性脂肪肝(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)是指除去酒精和其它明確肝損傷導(dǎo)致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積的臨床病理綜合征。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展加速及高節(jié)奏生活方式的影響，非酒精性脂肪肝正嚴(yán)重威脅我國(guó)人群的健康，已經(jīng)成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，亦被公認(rèn)為隱蔽性肝硬化的常見原因。非酒精性脂肪肝除可直接導(dǎo)致肝硬化肝細(xì)胞癌等，還可參與Ⅱ型糖尿病的發(fā)病，在有些患者中肝臟脂肪沉積可能是影響其T2DM發(fā)展的主要因素。另一方面，如果T2DM控制不佳或充分發(fā)展，不僅促進(jìn)脂肪肝生成，而且使肝損傷加重，甚至形成非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維變性、肝硬化及肝細(xì)胞癌?，F(xiàn)階段，T2DM合并NAFLD的患病率正逐年增加，因此未來我們應(yīng)該制定特異的篩選標(biāo)準(zhǔn)以及治療方案以期應(yīng)用于臨床T2DM和NAFLD患者，尤其是T2DM和NAFLD合并的患者。TPL2為近年來新發(fā)現(xiàn)的絲/蘇氨酸激酶，包含467個(gè)氨基酸，為IKK分子的下游信號(hào)分子，廣泛表達(dá)與多種類型的機(jī)體細(xì)胞中，可調(diào)節(jié)白介素、腫瘤壞死因子等多種細(xì)胞因子表達(dá)和激活。蛋白序列研究表明該TPL2與其他激酶同源性很低；TPL2過表達(dá)可使SEK1磷酸化，激活JNK信號(hào)通路；在人的腫瘤細(xì)胞如胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌細(xì)胞中，TPL2在RNA水平過表達(dá)，調(diào)節(jié)COX-2的表達(dá)。本專利主要集中于研究TPL2基因表達(dá)與脂肪肝與Ⅱ型糖尿病之間的關(guān)系，以期待為脂肪肝與Ⅱ型糖尿病的治療找出新的作用靶點(diǎn)。參考文獻(xiàn)：1.ArabJP,KarpenSJ,DawsonPA,ArreseM,TraunerM.Bileacids&amp；nonalcoholicfattyliverdisease:Molecularinsightsandtherapeuticperspectives.Hepatology.2016Jun30.doi:10.1002/hep.28709.2.ValentiL,BugianesiE,PajvaniU,TargherG.Nonalcoholicfattyliverdisease:causeorconsequenceoftype2diabetes？LiverInt.2016Jun8.doi:10.1111/liv.13185.[Epubaheadofprint].3.KatsikiN,MikhailidisDP,MantzorosCS.Non-alcoholicfattyliverdiseaseanddyslipidemia:Anupdate.Metabolism.2016Aug；65(8):1109-23.doi:10.1016/j.metabol.2016.05.003.Epub2016May13.4.TahraniAA,BarnettAH,BaileyCJ.Pharmacologyandtherapeuticimplicationsofcurrentdrugsfortype2diabetesmellitus.NatRevEndocrinol.2016Jun24.doi:10.1038/nrendo.2016.86.5.Alemán-González-DuhartD,Tamay-CachF,S,Mendieta-WejebeJE.CurrentAdvancesintheBiochemicalandPhysiologicalAspectsoftheTreatmentofType2DiabetesMellituswithThiazolidinediones.PPARRes.2016；2016:7614270.doi:10.1155/2016/7614270.Epub2016May23.6.FanJG,FarrellGC.Epidemiologyofnon-alcoholicfattyliverdiseaseinchina.JHepatol.2009；50:204-2107.LoriaP,LonardoA,AnaniaF.Liveranddiabetes.Aviciouscircle.HepatolRes.2013；43:51-648.CusiK.Treatmentofpatientswithtype2diabetesandnon-alcoholicfattyliverdisease:Currentapproachesandfuturedirections.Diabetologia.2016；59:1112-11209.LeeHW,ChoiHY,JooKM,NamDH.Tumorprogressionlocus2(Tpl2)kinaseasanoveltherapeutictargetforcancer:double-sidedeffectsofTpl2oncancer.IntJMolSci.2015Feb25；16(3):4471-91.10.MartelG,RousseauS.TPL2signalling:fromToll-likereceptors-mediatedERK1/ERK2activationtoCysticFibrosislungdisease.IntJBiochemCellBiol.2014Jul；52:146-51.11.CohenP.Targetingproteinkinasesforthedevelopmentofanti-inflammatorydrugs.CurrOpinCellBiol.2009Apr；21(2):317-24.技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種TPL2基因的表達(dá)與脂肪肝、Ⅱ型糖尿病之間的相互關(guān)系，提供一種TPL2作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用，進(jìn)而提供一種TPL2的抑制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明以野生型C57小鼠與TPL2基因敲除小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型(dietinducedobesity，DIO)研究TPL2基因的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型WT小鼠對(duì)比，高脂飼料喂養(yǎng)的TPL2基因敲除小鼠表現(xiàn)出肥胖緩解，其體重低于同種高脂肪飼料飼養(yǎng)的WT小鼠，并且TPL2基因敲除后小鼠的空腹血糖水平低于對(duì)照組WT小鼠，TPL2基因敲除小鼠的肝功能障礙較WT小鼠明顯減輕。進(jìn)一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TPL2基因敲除小鼠對(duì)葡萄糖的耐受能力明顯增強(qiáng)。從小鼠肝臟組織膽固醇含量變化等結(jié)果說明HFD組(Highfatdiet，高脂飲食)的TPL2-KO小鼠脂肪肝病變明顯減輕，脂質(zhì)蓄積顯著減少。這表明TPL2基因敲除會(huì)改善脂肪肝并減緩Ⅱ型糖尿病的發(fā)生，TPL2基因的表達(dá)能夠加重脂肪肝、Ⅱ型糖尿病。因此，TPL2基因可作為藥物靶點(diǎn)，構(gòu)建TPL2基因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物；TPL2基因也可作為基因治療中的靶基因，設(shè)計(jì)并制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物和/或生物學(xué)試劑，通過基因工程技術(shù)達(dá)到預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的目的。例如以TPL2為靶基因，設(shè)計(jì)可干擾TPL2表達(dá)的雙鏈siRNA，通過化學(xué)方法合成以后，注射入人體通過RNA干擾的方法使TPL2基因沉默來治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病；還可以設(shè)計(jì)并構(gòu)建TPL2的突變體，注射后進(jìn)入細(xì)胞，競(jìng)爭(zhēng)TPL2原形的作用底物，從而抑制TPL2的功能，起到治療目的；此外，還可以以TPL2為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)小分子化合物抑制劑，利用TPL2基因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，通過篩選，發(fā)現(xiàn)其中能夠特異性抑制TPL2的分子，從而為脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的治療提供新的治療性分子。針對(duì)TPL2的上述功能，提供TPL2作為藥物靶標(biāo)在篩選保護(hù)神肝臟及糖代謝的藥物中的應(yīng)用。針對(duì)TPL2的上述功能，提供TPL2作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。針對(duì)TPL2的上述功能，提供TPL2的抑制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。一種預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物，包含TPL2的抑制劑。所述的TPL2的抑制劑優(yōu)選為TPL2基因的siRNA、TPL2基因的RNA干擾載體，TPL2的抗體及其他能夠抑制TPL2表達(dá)的抑制劑。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)TPL2的新功能，即TPL2具有惡化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的作用。(2)基于TPL2在惡化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病疾病中的功能，其為研制預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物提供靶標(biāo)。(3)TPL2的抑制劑可用于制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物。附圖說明圖1是構(gòu)建肝臟特異性TPL2基因敲除小鼠的打靶策略圖。圖2是WT和TPL2-KO小鼠的體重、空腹血糖結(jié)果圖；A為小鼠體重結(jié)果圖，B為空腹血糖水平統(tǒng)計(jì)圖(***：p＜0.01vsWTNC組，###：p＜0.01vsWTHFD組)。圖3是WT和TPL2-KO小鼠通過腹腔注射葡萄糖耐量結(jié)果圖；A為通過腹腔注射葡萄糖后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血糖水平統(tǒng)計(jì)圖，B為各組胰島素耐受實(shí)驗(yàn)(***：p＜0.01vsWTNC組，##：p＜0.05vsWTHFD組，###：p＜0.01vsWTHFD組)。圖4是TPL2-KO和WT小鼠的肝臟重量結(jié)果圖；A為肝臟重量統(tǒng)計(jì)柱狀圖，B為肝臟重量與小鼠本身體重比值統(tǒng)計(jì)柱狀圖(***：p＜0.01vsWTNC組，###：p＜0.01vsWTHFD組)。圖5是TPL2-KO和WT小鼠肝臟脂質(zhì)測(cè)定結(jié)果，分別檢測(cè)肝臟總膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸含量(***：p＜0.01vsWTNC組，###：p＜0.01vsWTHFD組)。圖6是WT和TPL2-KO小鼠的肝功測(cè)量結(jié)果圖，分別采取AST、ALT和ALP對(duì)小鼠肝功進(jìn)行檢測(cè)(***：p＜0.01vsWTNC組，###：p＜0.01vsWTHFD組)。具體實(shí)施方式通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬，性別，周齡及來源：C57BL/6(WT)小鼠和肝臟特異性TPL2基因敲除(TPL2-KO)小鼠，雄性，8周齡。C57BL/6小鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司；TPL2基因敲除(轉(zhuǎn)基因)小鼠由TPL2-floxed小鼠與受蛋白啟動(dòng)子控制、肝細(xì)胞特異性表達(dá)的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠Albumin-Cre(購(gòu)自TheJacksonLaboratory，貨號(hào)003574)雜交得到，構(gòu)建策略見圖1。肝臟特異性TPL2基因敲除小鼠的構(gòu)建：根據(jù)基因信息，利用CRISPRDesign(網(wǎng)址：http://crispr.mit.edu/)分別在內(nèi)含子3和4中各設(shè)計(jì)一個(gè)CRISPR的打靶位點(diǎn)。靶序列分別為：TPL2-sRNA1：AGAGTTTAGGAATCCGAACAAGGTPL2-sRNA2：CAGTACTGAGTGGGTAGCTCAGG此外還設(shè)計(jì)了一個(gè)用于同源修復(fù)的供體質(zhì)粒(DonorVector)，它包括兩側(cè)同源臂、中間的外顯子3以及兩個(gè)同向的loxp序列。①打靶載體的構(gòu)建：分別將sgRNA1和sgRNA2對(duì)應(yīng)的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4DNA連接酶連入經(jīng)過限制性內(nèi)切酶BsaI處理過的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個(gè)T7啟動(dòng)子，可以用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。②條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp的構(gòu)建：分別合成4條寡聚單鏈核苷酸序列：loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2兩條雙鏈。將pBluescriptIISK(+)載體用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)雙酶切后連接入loxp1退火雙鏈，再將測(cè)序正確的載體用BamHI(NEB，R0136L)和SpeI(NEB，R0133L)雙酶切，連接入loxp2退火雙鏈，得到條件性敲除骨架載體，命名為pBluescriptSK(+)-2loxp。③供體載體(DonorVector)的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)如下引物(表1)用于擴(kuò)增供體載體的左右同源臂(LA和RA)以及中間的外顯子部分(M)。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)表1中所示限制性內(nèi)切酶酶切后得到3個(gè)片段，將其分別連入條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp中，得到DonorVector。表1構(gòu)建供體載體所需引物序列及對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)引物名稱引物序列酶切位點(diǎn)TPL2LA-FGGGGTACCTCATAGGTGCCAGACAGGTGKpnITPL2LA-RATGGACGTCACAAGGTTTCAAAATACTGACTGAGAatIITPL2M-FTCTACCGGTTCGGATTCCTAAACTCTAAATGAAGAgeITPL2M-RACGCTTAAGCTACCCACTCAGTACTGATTGTTAflIITPL2RA-FCGACGCGTCTCAGGGATAGAACTCCTGTTTAGCMluITPL2RA-RATAAGAATGCGGCCGCTACTCTCCTGTGAGCGTTGGNotI④打靶載體的轉(zhuǎn)錄：對(duì)CRIPR/Cas9系統(tǒng)包含的兩個(gè)部分(負(fù)責(zé)切割作用的Cas9蛋白和引導(dǎo)Cas9蛋白定位到靶位點(diǎn)的gRNA)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。對(duì)于Cas9蛋白，將其表達(dá)載體(pST1374-Cas9)用PmeI進(jìn)行酶切，以純化后回收線性化質(zhì)粒為轉(zhuǎn)錄模板，用T7mMESSAGEmMACHINE試劑盒(AM1345，Ambion)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得加帽的mRNA產(chǎn)物。并用Poly(A)Tailing試劑盒(Ambion)對(duì)上述產(chǎn)物加尾，獲得成熟的mRNA產(chǎn)物；對(duì)于sgRNA，使用MEGAshortscriptTMKit(AM1354，Ambion公司)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit(Qiagen，217084)進(jìn)行純化。⑤TPL2-floxed條件性敲除小鼠的制作將上述成熟的mRNA產(chǎn)物與供體質(zhì)粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內(nèi)進(jìn)行培育。得到的小鼠進(jìn)行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過PCR方法篩選陽性首建鼠。從確定發(fā)生同源重組的小鼠中隨機(jī)挑選一只作為F0代進(jìn)行后續(xù)的繁殖，最終獲得TPL2-floxed純合小鼠。⑥肝臟特異性TPL2基因敲除小鼠的制作將上述TPL2-floxed小鼠與肝臟特異性Albumin-Cre(購(gòu)自TheJacksonLaboratory，貨號(hào)003574)轉(zhuǎn)基因小鼠交配，篩選得到TPL2floxed/floxed/Albumin-Cre小鼠，待該小鼠長(zhǎng)至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen，誘導(dǎo)Cre酶的表達(dá)，Cre酶特異性的識(shí)別兩個(gè)同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個(gè)loxp，最后得到心臟細(xì)胞特異性TPL2基因敲除小鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料配方：高脂飼料(HFD)(購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，貨號(hào)D12942)：熱量百分比：蛋白質(zhì):20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，總的熱量質(zhì)量比:5.24kcal/g。低脂飼料(NC)(購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，貨號(hào)D12450B)：熱量百分比：蛋白質(zhì):20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，總的熱量質(zhì)量比:3.85kcal/g。動(dòng)物飼養(yǎng)及環(huán)境條件：所有的實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心SPF級(jí)動(dòng)物房(許可證號(hào)：SYXK(鄂)：2009-0053)。每12小時(shí)交替照明，溫度24±2℃，濕度40％-70％，小鼠自由飲水進(jìn)食?！緦?shí)施例1】小鼠脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型(dietinducedobesity，DIO)獲得(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：選用8周齡，雄性，WT小鼠和TPL2-KO(TG)小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(Highfatdiet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normalchow，NC)飼養(yǎng)，即WTNC組，KONC組，WTHFD組，KOHFD組共4個(gè)組別。(2)模型通過高脂飼料誘導(dǎo)操作流程：采用WT和KO(TG)小鼠，建立DIO模型，進(jìn)行表型相關(guān)分析，明確TPL2基因?qū)χ靖?、Ⅱ型糖尿病發(fā)揮的作用。選用8周齡，雄性，WT小鼠和TPL2-KO(TG)小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(Highfatdiet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normalchow，NC)飼養(yǎng)，即WTNC組，KONC組，WTHFD組，KOHFD組共4個(gè)組別。小鼠空腹體重和空腹血糖每隔2周檢測(cè)1次。實(shí)驗(yàn)第11周，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖實(shí)驗(yàn)(IPGTT)，以評(píng)價(jià)小鼠機(jī)體對(duì)葡萄糖耐受能力。第12周終末取材，取出小鼠肝臟拍照，然后一部分置于甲醛溶液中固定或O.C.T冰凍切片包埋劑(TissueFreezingMedium)包埋作為病理分析用?！緦?shí)施例2】小鼠體重、血糖水平測(cè)定(1)小鼠空腹體重，食量檢測(cè)1)體重檢測(cè)。①禁食：上午8:00將待實(shí)驗(yàn)小鼠禁食(不禁水)，下午2:00開始實(shí)驗(yàn)操作。②稱重：分別在第0周、2周、4周、6周、8周、10周、12周稱重，將一塑料小桶放在動(dòng)態(tài)電子天平上，抓起小鼠，放入稱量小桶中，測(cè)量體重記錄數(shù)據(jù)。飼料量檢測(cè)：待稱體重操作完成后，給小鼠加飼料，并在動(dòng)態(tài)電子天平上記錄小鼠的飼料量。(2)空腹血糖水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)將所有待實(shí)驗(yàn)的小鼠從上午8:00至下午2:00間禁食(不禁水)，即禁食6小時(shí)后開始實(shí)驗(yàn)操作。①血糖儀準(zhǔn)備：檢查血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司，ONETOUCH)電池，按右側(cè)開關(guān)，將試紙正確放入左側(cè)插槽，屏幕顯示與血糖試紙條相應(yīng)代碼的數(shù)字，隨后顯示滴血圖案，提示血糖儀進(jìn)入待測(cè)狀態(tài)。②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一塊毛巾，將毛巾對(duì)折，用拇指和食指捏住毛巾對(duì)折處，將鼠頭部和身體包入手掌內(nèi)的毛巾，拇指和食指在將鼠尾根部固定。③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm處剪下鼠尾，待血滴自行流出。④血糖檢測(cè)：將血糖儀試紙邊緣輕觸血滴，血液浸入試紙，血糖儀倒計(jì)時(shí)5秒顯示讀數(shù)。Ⅱ型糖尿病損傷嚴(yán)重程度的評(píng)估指標(biāo)主要包括體重、血糖等水平，體重、血糖變化結(jié)果如圖2所示，WT小鼠在給與HFD飼料飼養(yǎng)后，從第4周開始體重低于其NC飼料組，其中第6周、第12周顯著低于其NC飼料組(見圖2A)；經(jīng)空腹血糖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在HFD組的小鼠從第6周、10周、12周的空腹血糖水平明顯較相應(yīng)NC對(duì)照組增高，HFD組的TPL2-KO小鼠空腹血糖水平也明顯低于WT組小鼠空腹血糖水平(見圖2B)。表明TPL2基因特異性敲除顯著改善了小鼠在HFD飼養(yǎng)狀態(tài)下的糖代謝穩(wěn)態(tài)，TPL2基因特異性敲除能顯著提高小鼠的糖代謝能力，表明TPL2基因在高脂誘導(dǎo)引起的Ⅱ型糖尿病中起到重要作用。【實(shí)施例3】葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(intraperitonealglucosetolerancetest，IPGTT)實(shí)驗(yàn)第11周，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖實(shí)驗(yàn)(IPGTT)，以評(píng)價(jià)小鼠機(jī)體對(duì)糖耐受能力。(1)在測(cè)血糖之前，先測(cè)量小鼠的空腹體重，根據(jù)10μL/g計(jì)算葡萄糖的注射體積。(2)先檢測(cè)葡糖糖注射前即0分鐘時(shí)空腹血糖，在檢測(cè)完畢后迅速經(jīng)腹腔注射葡萄糖液。(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和無名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，將小鼠腹部充分暴露。②進(jìn)針定位及注射：從腹部一側(cè)進(jìn)針右手持注射器，將尖端與小鼠腹部成45°的夾角，進(jìn)針，回抽，注射時(shí)針頭在腹部皮下穿行一小段距離，穿過腹中線后在腹部另一側(cè)進(jìn)入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。(4)分別于腹腔注射后15分、30分、60分、120分鐘時(shí)間點(diǎn)剪尾測(cè)小鼠血糖值，并記錄血糖數(shù)值和檢測(cè)時(shí)間。進(jìn)一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(intraperitonealglucosetolerancetests，IPGTT)來評(píng)估各組小鼠對(duì)葡萄糖的處理能力，在實(shí)驗(yàn)第11周，通過注射1.0g/kg體重的葡萄糖后，HFD組的WT小鼠和TPL2-TG小鼠血糖水平在15分鐘時(shí)間點(diǎn)劇增達(dá)到峰值，隨著時(shí)間推移至注射后60分鐘，兩組小鼠血糖水平稍微下降，但仍處于高于空腹血糖水平(0分鐘時(shí)血糖)，在2小時(shí)時(shí)恢復(fù)至空腹血糖水平，且TPL2-KO小鼠血糖水平從0分鐘至2小時(shí)一直處于低于WT小鼠的血糖水平(圖3A)。上述結(jié)果表明TPL2不利于維持糖代謝穩(wěn)態(tài)。【實(shí)施例4】胰島素耐受實(shí)驗(yàn)詳細(xì)操作步驟參考實(shí)例3葡萄糖耐受試驗(yàn)。胰島素用量根據(jù)小鼠的年齡和性別來決定，一般理想用量是使葡萄糖水平在注射30min后下降至注射前的40％左右。小鼠胰島素耐受實(shí)驗(yàn)的胰島素用量一般為0.5-1.2U/kg，胰島素用生理鹽水稀釋，如用量0.5U/kg，配制濃度0.5U/ml。0.75U/kg，0、15、30、60min測(cè)血糖；0.027U/10g＝2.7U/kg上午禁食4小時(shí)，正常飲水。下午試驗(yàn)，稱體重，標(biāo)記序號(hào)，注射胰島素前測(cè)血糖，胰島素按體重計(jì)算注射量，在15min、30min、45min、60min分別測(cè)血糖，實(shí)驗(yàn)完畢，每籠補(bǔ)充上飼料。胰島素耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3B所示。HFD組的WT小鼠和TPL2-TG小鼠血糖水平下降并在30分鐘時(shí)間點(diǎn)達(dá)到最低值，隨著時(shí)間推移至注射后60分鐘，兩組小鼠血糖水平稍微上升，但仍處于低于空腹血糖水平(0分鐘時(shí)血糖)。且TPL2-KO小鼠血糖水平從0分鐘至2小時(shí)一直處于低于WT小鼠的血糖水平(圖3B)。結(jié)果表明TPL2-KO小鼠的胰島素抵抗得到改善?！緦?shí)施例5】肝臟組織脂質(zhì)評(píng)估(1)終末肝臟組織取材①小鼠稱重后，迅速脫頸處死。仰臥固定小鼠，用蒸餾水將小鼠胸部，腹部毛發(fā)潤(rùn)濕。②用一鑷子鉗夾小鼠腹部正中皮膚，沿腹部正中向頭部剪開皮膚至劍突下，向尾端剪開皮膚，逐層暴露皮下筋膜，肌肉等，打開腹腔，充分暴露各臟器。③迅速找到并取下小鼠的肝臟，將取下的肝臟標(biāo)本置于滅菌紗布上，拭干肝臟表面上殘留血液，將肝臟置于無菌培養(yǎng)皿中，迅速稱重。(2)小鼠肝組織脂質(zhì)檢測(cè)①?gòu)?80℃冰箱取出肝臟組織樣品，稱量50mg組織，使用研磨器將肝臟組織研磨成粉末狀，溶于1mLPBS中，混勻后再與1mL氯仿/甲醇(2:1)共孵育過夜。②以12000g高速離心15min后，收集管底脂質(zhì)層物質(zhì)，風(fēng)干，以去除水分。③將分離出的脂質(zhì)層物質(zhì)溶于200μL含1％TritonX-100的PBS溶液中，仔細(xì)吹吸混勻。④開啟電腦labman軟件，打印機(jī)，再開啟生化分析儀；⑤選擇并清洗檢測(cè)探針、比色杯等，保證探針通暢、比色杯無雜質(zhì)附著，吸光值在設(shè)定的參考范圍；⑥在labman軟件上檢查所需檢測(cè)指標(biāo)試劑是否足夠，設(shè)定檢測(cè)指標(biāo)和檢測(cè)順序等。⑦將制得的混勻液上機(jī)檢測(cè)，分析。(3)肝功能測(cè)定①開啟電腦labman軟件，打印機(jī)，再開啟生化分析儀；②選擇并清洗檢測(cè)探針、比色杯等，保證探針通暢、比色杯無雜質(zhì)附著，吸光值在設(shè)定的參考范圍；③將待檢測(cè)的血清標(biāo)本從-80℃冰箱中找出；將待檢測(cè)的血清在室溫下復(fù)融至液態(tài)，準(zhǔn)備檢測(cè)；④在labman軟件上檢查所需檢測(cè)指標(biāo)試劑是否足夠，設(shè)定檢測(cè)指標(biāo)和檢測(cè)順序等；⑤加入待檢血清樣品50μl，開始檢測(cè)；⑥待檢測(cè)完畢后記錄檢測(cè)數(shù)值。在HFD組的TPL2-KO小鼠肝臟重量較WT小鼠低(如圖4A)，同時(shí)，肝臟重量與小鼠本身體重比值較HFD組的WT小鼠低(如圖4B)。肝臟組織的總膽固醇含量變化如圖5所示。TPL2基因敲除后，肝臟組織總膽固醇、甘油三酯以及有利脂肪酸含量均下降(如圖5A-C)。這些結(jié)果說明TPL2基因敲除小鼠的脂肪肝明顯減輕。進(jìn)一步肝功能檢測(cè)表明，HFD組小鼠肝功明顯較NC組差，而TPL2-KO小鼠的三種肝酶(AST(谷草轉(zhuǎn)氨酶)、ASLT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)、ALP(堿性磷酸酶))均較HFD組的WT小鼠低(如圖6)。這些結(jié)果說明TPL2基因敲除小鼠的脂肪肝明顯被抑制。上述結(jié)果顯示TPL2-KO小鼠在HFD的誘導(dǎo)下發(fā)生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病變顯著減輕。這些結(jié)果表明TPL2基因敲除對(duì)改善Ⅱ型糖尿病和脂肪肝具有顯著的作用。本發(fā)明結(jié)果說明TPL2基因可促進(jìn)脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發(fā)生，TPL2基因抑制劑在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有著潛在的重要保護(hù)作用。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>武漢大學(xué)<120>腫瘤進(jìn)展位點(diǎn)2在治療脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和應(yīng)用<160>12<170>PatentInversion3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>TPL2-sRNA1<400>1agagtttaggaatccgaacaagg23<210>2<211>23<212>DNA<213>TPL2-sRNA2<400>2cagtactgagtgggtagctcagg23<210>3<211>54<212>DNA<213>loxp1-F<400>3agcttgacgtcataacttcgtatagcatacattatagcaatttataccggtgat54<210>4<211>50<212>DNA<213>loxp1-R<400>4atcaccggtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatgacgtca50<210>5<211>52<212>DNA<213>loxp2-F<400>5gatcccttaagataacttcgtatagcatacattatagcaatttatacgcgta52<210>6<211>52<212>DNA<213>loxp2-R<400>6ctagtacgcgtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatcttaagg52<210>7<211>28<212>DNA<213>TPL2LA-F<400>7ggggtacctcataggtgccagacaggtg28<210>8<211>34<212>DNA<213>TPL2LA-R<400>8atggacgtcacaaggtttcaaaatactgactgag34<210>9<211>34<212>DNA<213>TPL2M-F<400>9tctaccggttcggattcctaaactctaaatgaag34<210>10<211>32<212>DNA<213>TPL2M-R<400>10acgcttaagctacccactcagtactgattgtt32<210>11<211>33<212>DNA<213>TPL2RA-F<400>11cgacgcgtctcagggatagaactcctgtttagc33<210>12<211>36<212>DNA<213>TPL2RA-R<400>12ataagaatgcggccgctactctcctgtgagcgttgg36當(dāng)前第1頁1 2 3