本發(fā)明屬于組織工程生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，尤其涉及3D打印人工皮膚及制備方法。
背景技術(shù)：
：皮膚作為人體面積最大的器官，是人體與外界環(huán)境的天然屏障，具有保護、調(diào)節(jié)、排泄等作用。當(dāng)炎癥、潰瘍、外傷、燒傷、手術(shù)等原因造成皮膚的缺損和異常時，輕則影響患者的外表美觀，重則引發(fā)感染或電解質(zhì)和水分的大量流失，導(dǎo)致患者的死亡。尤其對于治療大面積皮膚缺損，關(guān)鍵在于盡早封閉創(chuàng)面、減少機體的消耗和內(nèi)環(huán)境的紊亂、防止有害物質(zhì)的入侵、促進創(chuàng)面皮膚的再生。目前醫(yī)學(xué)上對于皮膚的缺損，多采用自體皮膚移植的方法，這不僅造成供皮區(qū)新的創(chuàng)傷缺陷，而且經(jīng)常受到供皮來源的限制。為了彌補皮膚缺損對機體帶來的傷害，修復(fù)、替代缺損的皮膚組織，各國科學(xué)家都致力于人工皮膚的研究。既往很多解決方案或者產(chǎn)品，是通過對異體或異種皮膚加工處理而得到的，存在著加工成本高、免疫排斥等問題。隨著工程學(xué)技術(shù)的發(fā)展，工程化人工皮膚已成為皮膚缺損治療的熱點，但至今沒有真正理想的皮膚替代物得以應(yīng)用?，F(xiàn)有技術(shù)中也有用不同的材料制成的合成人工膜作為人工皮膚。但諸如透明質(zhì)酸鈉、殼聚糖、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素一類的水凝膠，存在制成的人工皮膚強度不夠，透氣性差的問題，而且隨著用量增加，有抑制成纖維細(xì)胞生長的作用。而聚氨酯、硅橡膠、聚乙二醇、對苯二甲酸乙二醇酯等醫(yī)用高分子材料，雖然解決了人工皮膚的強度問題，但是親水性不高，往往降解緩慢、存留時間較久甚至不降解，造成異物殘留，引起無菌性炎癥，影響自身細(xì)胞在創(chuàng)面的定植和生長，而且由于這些材料不能參與進行生理代謝，往往只能用做外層敷料。理想的人工皮膚需要足夠柔軟、舒適、既透氣又透水，能夠與創(chuàng)面有良好的貼合，同時又需要有一定的延展性、韌性和機械強度，即使是用來修復(fù)關(guān)節(jié)附近的皮膚缺損時，也能適應(yīng)關(guān)節(jié)活動引起的局部皮膚張力升高而不至于形成新的創(chuàng)口，此外還應(yīng)具有良好的材料-細(xì)胞界面，以利于細(xì)胞的定植、生長。但還應(yīng)考慮到合成材料制備由于沒有表皮層、毛囊等主要皮膚輔助器官往往無法再生，若完全依靠創(chuàng)面附近的細(xì)胞增殖后移行定植到材料表面，需要耗費的時間較久，不利于創(chuàng)面的修復(fù)。且這些皮膚附屬器具有重要的生理功能：如形成角質(zhì)層、分泌皮脂、潤滑作用，分泌汗液、調(diào)整內(nèi)環(huán)境作用等，還涉及信號傳導(dǎo)、響應(yīng)生長因子和細(xì)胞因子的作用等方面。僅依靠形態(tài)的修復(fù)無法滿足恢復(fù)再生皮膚的生理功能需求。已有研究發(fā)現(xiàn)毛囊是表皮-毛囊-皮脂腺單位干細(xì)胞的所在部位，毛囊干細(xì)胞定位于毛囊外根鞘的立毛肌附著處。在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境因素刺激下毛囊干細(xì)胞可定向分化為表皮、毛囊和皮脂腺組織，這些組織細(xì)胞及其細(xì)胞因子對創(chuàng)面的正?；暇哂胁豢商娲淖饔?。因此，要構(gòu)建功能性的人工皮膚，必須重視皮膚附屬器的構(gòu)建，從而縮短創(chuàng)面修復(fù)時間，恢復(fù)皮膚功能，使人工皮膚具有初步的生理功能已成為發(fā)展趨勢。故而設(shè)計一種工藝簡單，易于量產(chǎn)，容易保存，生物相容性好，應(yīng)用便捷，價格低廉的人工皮膚，對于快速、高效修復(fù)創(chuàng)面，減少創(chuàng)面缺損對人們帶來的不便和危害具有十分重要的現(xiàn)實意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種易于量產(chǎn)，容易保存，生物相容性好的3D打印人工皮膚及制備方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:這種3D打印人工皮膚，自上而下依次包括含角質(zhì)細(xì)胞的水凝膠層、編織層、含毛囊細(xì)胞的水凝膠層和編織層；編織層由高分子可降解材料編織而成，含有孔隙；含角質(zhì)細(xì)胞的水凝膠層和含毛囊細(xì)胞的水凝膠層中均含有表皮生長因子和納米銀。這種3D打印人工皮膚的制備方法，包括如下步驟：將高分子可降解編織線按照編織工藝編織成具有一定孔隙率和厚度的編織層；1)用常壓等離子態(tài)氦氣對編織層表面進行處理；2)將細(xì)胞生長因子和納米銀離子與水凝膠一起配置成水凝膠溶液；3)將角質(zhì)細(xì)胞和毛囊細(xì)胞分別與水凝膠溶液混合形成具有一定細(xì)胞濃度的混懸液4)采用連續(xù)打印方法將含有角質(zhì)細(xì)胞的水凝膠懸液打印在一張編織層表面；5)采用點陣打印方法將含有毛囊細(xì)胞的水凝膠懸液打印在另一張編織層表面；6)將打印完畢的角質(zhì)細(xì)胞的編織層重疊在打印了毛囊細(xì)胞的編織層上面，然后進行固化，凍干處理。作為優(yōu)選：步驟1)中，高分子可降解編織線采用聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)或聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)中的一種或幾種材料，編織工藝科采用赫格利斯編織或二維三軸向編織，編織層厚度為50-500μm，得到的編織層孔隙率為15％-35％。作為優(yōu)選：步驟2)中，所用常壓等離子態(tài)氦氣的氣體溫度為90-110℃，流量為4-12L/min，處理時長為3-10min。作為優(yōu)選：步驟3)中，水凝膠材料選用透明質(zhì)酸鈉、殼聚糖或硫酸軟骨素中的一種，水凝膠和去離子水的摩爾比為1:20～1:50。作為優(yōu)選：步驟3)中，所選細(xì)胞生長因子為表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，細(xì)胞生長因子、納米銀離子和水凝膠材料的摩爾比為10:1:5000～5:1:1000。作為優(yōu)選：步驟4)中，角質(zhì)細(xì)胞和毛囊細(xì)胞的來源為毛囊干細(xì)胞、經(jīng)誘導(dǎo)分化的間充質(zhì)干細(xì)胞或基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞的來源為經(jīng)誘導(dǎo)分化的間充質(zhì)干細(xì)胞或基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞和毛囊細(xì)胞在水凝膠中的濃度范圍均為2×104～5×106cells/mL。作為優(yōu)選：步驟5)中，打印角質(zhì)細(xì)胞時，噴嘴噴速為10-50μL/s，噴嘴在編織層表面的移動速度為0.5-2.5mm/s。作為優(yōu)選：步驟6)中，打印毛囊細(xì)胞時，噴嘴噴速為5-25μL/s，噴嘴在編織層表面的移動速度為1-5mm/s，其每個打印點之間的距離為2-5mm。作為優(yōu)選：步驟7)中，固化、凍干處理的條件為在4-6℃環(huán)境下，固化1-2h，真空冷凍干燥6-8h。本發(fā)明的有益效果是:1)所用材料為高分子可降解材料，易于獲得、生物相容性好，通過編織獲得的編織層孔隙較多，利于營養(yǎng)物質(zhì)的運輸和交換；2)多層結(jié)構(gòu)增加了人工皮膚的耐磨性、韌性和機械強度等物理特性；3)常壓等離子體射流處理增加了編織層表面積，有利于水凝膠和皮膚附屬器細(xì)胞的粘附；4)人工皮膚制作完畢即初步具有正常皮膚結(jié)構(gòu)，便于皮膚功能的恢復(fù)；5)表皮生長因子有利于皮膚附屬器細(xì)胞的定植和分化，銀離子使得人工皮膚具有良好的抗菌性能，延長人工皮膚保存期；6)本發(fā)明的制備方法步驟簡單，質(zhì)控方便，易于工業(yè)化制備。附圖說明圖1為3D打印人工皮膚含角質(zhì)細(xì)胞的水凝膠層-編織層的側(cè)面觀示意圖；圖2為3D打印人工皮膚含毛囊細(xì)胞的水凝膠層-編織層的側(cè)面觀示意圖；圖3為3D打印人工皮膚修復(fù)裸鼠背部皮膚4周后的病理切片，放大100倍；圖4為正常裸鼠背部皮膚病理切片，放大100倍；附圖標(biāo)記說明：編織層1、含角質(zhì)細(xì)胞的水凝膠層2、含毛囊細(xì)胞的水凝膠層3。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步描述。下述實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。實施例11)編織層的制備：取PLA編織線，采用赫格利斯編織工藝進行編織，得到厚度200μm的編織層，孔隙率為25％；2)常壓等離子體處理:所用氣體溫度為90℃，流量為4L/min，處理時長為4min；3)配置水凝膠溶液:取透明質(zhì)酸鈉與去離子水按照1:50的摩爾比例配置成水凝膠溶液，再將表皮生長因子、納米銀離子和水凝膠溶液按照10:1:3000的摩爾比例均勻混合；4)制備細(xì)胞懸液：將角質(zhì)細(xì)胞、毛囊細(xì)胞分別按照2×104/mL的濃度懸于水凝膠溶液；5)角質(zhì)細(xì)胞打?。簾o菌條件下將角質(zhì)細(xì)胞水凝膠溶液進行連續(xù)3D打印，噴嘴噴速為10μL/s，移動速度為0.5mm/s；6)毛囊細(xì)胞打?。簾o菌條件下將毛囊細(xì)胞水凝膠溶液進行點陣3D打印，噴嘴噴速為5μL/s，移動速度為1mm/s，每個打印點之間的距離為20μm；7)將打印了角質(zhì)細(xì)胞的編織層覆蓋在打印了毛囊細(xì)胞的編織層上面，并在6℃下固化2h，真空冷凍干燥8h。實施例21)編織層的制備：取PGA編織線，采用赫格利斯編織工藝進行編織，得到厚度100μm的編織層，孔隙率為35％；2)常壓等離子體處理:所用氣體溫度為100℃，流量為6L/min，處理時長為6min；3)配置水凝膠溶液:取透明質(zhì)酸鈉與去離子水按照1:30的摩爾比例配置成水凝膠溶液，再將成纖維細(xì)胞生長因子、納米銀離子和水凝膠材料按照10:1:4000的摩爾比例均勻混合；4)制備細(xì)胞懸液：將角質(zhì)細(xì)胞、毛囊細(xì)胞分別按照1×105/mL的濃度懸于水凝膠溶液；5)角質(zhì)細(xì)胞打?。簾o菌條件下將角質(zhì)細(xì)胞水凝膠溶液進行連續(xù)3D打印，噴嘴噴速為20μL/s，移動速度為1mm/s；6)毛囊細(xì)胞打印：無菌條件下將毛囊細(xì)胞水凝膠溶液進行點陣3D打印，噴嘴噴速為10μL/s，移動速度為2mm/s，每個打印點之間的距離為30μm；7)將打印了角質(zhì)細(xì)胞的編織層覆蓋在打印了毛囊細(xì)胞的編織層上面，并在4℃下固化2h，真空冷凍干燥7h。實施例31)編織層的制備:取PLGA編織線采用二維三軸向編織工藝進行編織，得到厚度150μm的編織層，孔隙率為20％；2)常壓等離子體處理:所用氣體溫度為100℃，流量為8L/min，處理時長為8min；3)配置水凝膠溶液:取透明質(zhì)酸鈉與去離子水按照1:40的摩爾比例配置成水凝膠溶液，再將血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、納米銀離子和水凝膠材料按照10:1:5000的摩爾比例均勻混合；4)制備細(xì)胞懸液：將角質(zhì)細(xì)胞、毛囊細(xì)胞分別按照2.5×106/mL的濃度懸于水凝膠溶液；5)角質(zhì)細(xì)胞打印：無菌條件下將角質(zhì)細(xì)胞水凝膠溶液進行連續(xù)3D打印，噴嘴噴速為40μL/s，移動速度為1.5mm/s；6)毛囊細(xì)胞打?。簾o菌條件下將毛囊細(xì)胞水凝膠溶液進行點陣3D打印，噴嘴噴速為20μL/s，移動速度為3mm/s，每個打印點之間的距離為40μm；7)將打印了角質(zhì)細(xì)胞的編織層覆蓋在打印了毛囊細(xì)胞的編織層上面，并在4℃下固化1h，真空冷凍干燥6h。人工皮膚性能測試如下：1.實施例1-3制備的人工皮膚的機械強度比較表1三組人工皮膚的機械強度比較結(jié)果(n＝8，)樣本厚度(μm)拉伸強度(Mpa)斷裂伸長率(％)1403±1.61.21±0.13411±9.52201±0.50.96±0.08294±4.73300±0.91.08±0.25356±6.9機械強度測試結(jié)果提示人工皮膚的拉伸強度和斷裂伸長率與人工皮膚的厚度呈正相關(guān)。2.用3D打印人工皮膚修復(fù)裸鼠背部皮膚4周后與正常裸鼠背部皮膚病理切片比較。如圖3至圖4所示?？梢?D打印人工皮膚已形成薄層角質(zhì)層，并可在表皮層下觀察到毛囊結(jié)構(gòu)(黑箭頭)，初步具備正常人皮膚的基本結(jié)構(gòu)。當(dāng)前第1頁1 2 3