本發明涉及一種天然柞蠶絲素蛋白/聚乳酸-聚己內酯復合納米纖維神經組織工程支架的制備方法，屬于生物醫學材料涉及神經缺損修復領域。

背景技術：

在人類醫療和保健方面，器官和組織的缺損或衰竭是發生最為頻繁、最具破壞性和花費最為昂貴的問題。神經的再生以及功能的恢復一直是困擾臨床的一個難題，全世界每年都有很多的患者因神經組織壞死需要進行神經修復。而目前的治療方法主要是自體神經移植來治療神經斷裂或損傷。這種方法雖然拯救或延長了不少人的生命，但采用以犧牲健康組織為代價的“以傷治傷”方法并不完美，關鍵問題是具有生物活性的自體神經來源非常有限。此外在目前的醫療條件下很難避免神經纖維的錯向對接，從而影響神經功能的恢復。近年來，組織工程與再生醫學的發展為重建或修復神經組織提供了有效的治療手段，利用生物材料構建的神經再生導管，為臨床神經缺損修復帶來了曙光。

神經支架材料的設計應該最大限度仿生人體內細胞外基質(ECM)的結構與功能特點才能有效解決材料的生物相容性問題，調控生物信號的傳導，誘導神經細胞和組織生長，促進神經機體的再生與修復。人體細胞外基質本質上是由蛋白質和糖胺聚糖交聯而成的納米纖維網絡，纖維直徑一般為50-500nm。天然的細胞外基質包含很多生物信息，能使細胞更容易附著并維持細胞功能。細胞通過細胞膜上的受體系統與細胞外基質上的配體特異性結合并對外界信號做出反應，影響細胞行為。因此從結構和功能上仿生細胞外基質的理想神經支架具有廣闊的開發前景。

柞蠶絲素蛋白是絲素蛋白的一種，但在絕大部分的絲素蛋白材料的研究或報道中，所用的原料都是家蠶絲。柞蠶絲素蛋白是由柞蠶絲腺內壁上的內皮細胞分泌的高純度蛋白質，其氨基酸組成中以甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸為主，具有良好的生物相容性，其本身及其降解產物對細胞和機體無毒，不會或較少引起炎癥和免疫排斥反應。特別是其蛋白質分子中含有特殊的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(RGD)三肽序列。RGD序列作為細胞膜整合素受體與細胞外配體相結合的識別位點，介導細胞與細胞外基質及細胞之間的相互作用，能夠促進細胞對于支架的識別及粘附。但由于天然蛋白質力學性能較差無法滿足組織功能的需要，所以限制了其在生物醫學領域中應用。

聚乳酸-聚己內酯(P(LLA-CL))是乳酸和己內酯的共聚物，由于其具有良好的生物可降解性和良好機械性能，被廣泛用于組織工程和藥物釋放領域。但是聚乳酸-聚己內酯屬于合成高分子材料，不能為神經組織生長提供所需的生物信號，同時親水性較差，不利于細胞的粘附和生長。因此，將柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內酯混紡可以結合二者的優點，既能使支架材料具有較高且符合神經組織的力學性能，又能為組織生長提供生物信號，促進神經細胞的粘附、增值和分化，從而滿足神經組織的需要。

因此，將柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內酯共混采用靜電紡絲技術制備的復合納米纖維支架能最大限度的從結構和功能上仿生人體細胞外基質，有望成為理想中的神經組織支架。公開號為101502671的中國發明專利中，公開了絲素蛋白/P(LLA-CL)復合納米纖維組織修復支架的制備方法，其絲素蛋白采用的是家蠶絲蛋白，由于家蠶絲素蛋白氨基酸序列中不含有RGD三肽序列，因此對于細胞識別以及粘附性方面不足。而柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內酯共混采用靜電紡絲的方法制備神經導管支架至今未見報道。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是提供一種天然柞蠶絲素蛋白/聚乳酸-聚己內酯復合納米纖維神經組織工程支架的制備方法。

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種納米纖維神經組織工程支架的制備方法，其特征在于，包括：將柞蠶絲素蛋白或柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內酯溶于溶劑中，得到靜電紡絲溶液，進行靜電紡絲，將所得的納米纖維膜采用乙醇或乙醇溶液進行熏蒸處理，真空干燥，得到納米纖維神經組織工程支架。

優選地，所述的靜電紡絲溶液中柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內酯的總濃度為4％-12％(w/v)。

優選地，所述的柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內酯的質量比為0∶100-100∶0，不包括0∶100。

更優選地，所述的柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內酯的質量比為100∶0、75：25、50∶50或25∶75。

最優選地，所述的柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內酯的質量比為25∶75。

優選地，所述的柞蠶絲素蛋白的制備方法包括：將柞蠶絲進行脫膠、溶解、透析處理后得到柞蠶絲素蛋白溶液，進行冷凍干燥，得到柞蠶絲素蛋白。

優選地，所述的聚乳酸-聚己內酯的分子量Mn為25-35萬。

優選地，所述的溶劑為六氟異丙醇。

優選地，所述的靜電紡絲的工藝參數為：電壓為10-15KV，噴絲頭和接收裝置之間的距離為8-15cm，紡絲速率為0.8-1.5ml/h。

優選地，所述的熏蒸處理采用體積分數為75％的乙醇進行。

優選地，所述的真空干燥時間為24-72h。

優選地，通過調節柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內酯的質量比及靜電紡絲溶液中柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內酯的總質量濃度來調節納米纖維神經組織工程支架的直徑、力學性能、親疏水性、降解速率和細胞粘附性中的至少一種。

本發明的納米纖維神經組織工程支架在生物醫學領域神經組織工程中應用。與現有技術相比，本發明的有益效果是：

(1)本發明采用含有RGD序列的柞蠶絲素蛋白和高分子共聚物聚乳酸-聚己內酯(P(LLA-CL))共混，采用靜電紡技術巧妙地將二者優點結合，得到柞蠶絲素蛋白/聚乳酸-聚己內酯復合納米纖維支架，既能使支架材料具有較高且符合神經組織的力學性能，又能為組織生長提供生物信號，促進神經細胞的粘附、增殖和分化。

(2)本發明以天然材料柞蠶絲素蛋白和生物可降解高聚物聚乳酸-聚己內酯共混采用靜電紡絲技術制備得到物理化學性能優異，生物相容性好的復合納米纖維神經組織工程支架材料。得到的復合納米纖維直徑，力學性能，親疏水性，降解速率，細胞粘附性等可由柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內酯的質量比及共混溶液的濃度比調節。制備的柞蠶絲素蛋白/聚乳酸-聚己內酯納米纖維神經支架能夠保持柞蠶絲素蛋白的相容性，對人體無毒無害，無免疫原性，同時，支架材料保持了柞蠶絲素蛋白的RGD序列，能夠促進神經細胞對于支架材料的識別，提高了細胞的粘附性以及材料的靶向性。

(3)本發明可通過調節混紡比例及濃度來控制神經組織工程支架的物理化學性能。同時制得的納米纖維支架能夠很好地仿生天然細胞外基質的結構、組成及功能，是理想的神經組織工程支架。

(4)本發明制備方法簡單，材料來源豐富，可重復性好，經濟效益高，為臨床中遇到的神經缺損修復提供了新的實驗思路，同時適合工業化批量生產。

附圖說明

圖1紡絲液濃度6％-12％，柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內酯質量比為50∶50的靜電紡納米纖維支架材料的掃描電鏡照片及直徑分布圖：(a)6％，(b)8％，(c)10％，(d)12％.

圖2紡絲液濃度為10％，不同質量比的柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內酯靜電紡納米纖維支架材料的掃描電鏡照片及直徑分布圖：(a)100∶0；(b)75∶25；(c)50∶50；(d)25∶75；(e)0∶100.

圖3紡絲液濃度為10％，不同質量比的柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內酯靜電紡納米纖維支架材料親疏水性能；

圖4雪旺細胞(SCs)在不同質量比的柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內酯靜電紡納米纖維支架材料上的增殖情況

圖5雪旺細胞(SCs)在不同質量比的柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內酯靜電紡納米纖維支架材料上生長形貌觀察掃描電鏡圖片(a)100∶0；(b)75∶25；(c)：50∶50；(d)25∶75；(e)0∶100；(f)對照組Cover slips(蓋玻片)。

圖6雪旺細胞(SCs)在不同質量比的柞蠶絲素蛋白和聚乳酸-聚己內酯靜電紡納米纖維支架材料上生長3天熒光染色圖片(a)100∶0；(b)75∶25；(c)：50∶50；(d)25∶75；(e)0∶100；(f)對照組Cover slips(蓋玻片)。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

本發明各實施例中所用的聚乳酸-聚己內酯為市售產品，其分子量Mn為30萬，其中，乳酸單元和己內酯單元的摩爾比為50∶50。

實施例1

一種納米纖維神經組織工程支架的制備方法，具體步驟為：

(1)將柞蠶絲在95～100℃環境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠后得到柞蠶絲素纖維，60℃烘干。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置于飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經冷凍干燥得到柞蠶絲素蛋白。

(2)將柞蠶絲素蛋白0.3g和聚乳酸-聚己內酯0.3g溶于10ml六氟異丙醇，以200r/min的速率磁力攪拌4h至完全溶解，得到柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內酯的總濃度為6％(w/v)的靜電紡絲溶液，進行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏10x10cm²接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓14千伏，噴絲頭和接收板之間的距離為10cm，紡絲速率1.5ml/h，大約7h后鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜，取下后放入密閉容器內，用體積分數75％的乙醇在溫度為25℃、標準大氣壓的條件下進行熏蒸處理24h進行交聯，處理完畢后在溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空干燥48h，去除殘留溶劑，得到納米纖維神經組織工程支架。用Image J軟件分析納米纖維直徑為180±57m。

實施例2

一種納米纖維神經組織工程支架的制備方法，具體步驟為：

(1)將柞蠶絲在95～100℃環境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠后得到柞蠶絲素纖維，60℃烘干。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置于飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經冷凍干燥得到柞蠶絲素蛋白。

(2)將柞蠶絲素蛋白0.4g和聚乳酸-聚己內酯0.4g溶于10ml六氟異丙醇，以200r/min的速率磁力攪拌4h至完全溶解，得到柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內酯的總濃度為8％(w/v)的靜電紡絲溶液，進行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏10x10cm²接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓14千伏，噴絲頭和接收板之間的距離為10cm，紡絲速率1.5ml/h，大約7h后鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜，取下后放入密閉容器內，用體積分數75％的乙醇在溫度為25℃、25℃、標準大氣壓的條件下進行熏蒸處理24h進行交聯，處理完畢后溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空干燥48h，去除殘留溶劑，得到納米纖維神經組織工程支架。用Image J軟件分析納米纖維直徑為247±39nm。

實施例3

一種納米纖維神經組織工程支架的制備方法，具體步驟為：

(1)將柞蠶絲在95～100℃環境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠后得到柞蠶絲素纖維，60℃烘干。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置于飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經冷凍干燥得到柞蠶絲素蛋白。

(2)將柞蠶絲素蛋白0.5g和聚乳酸-聚己內酯0.5g溶于10ml六氟異丙醇，以200r/min的速率磁力攪拌4h至完全溶解，得到柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內酯的總濃度為10％(w/v)的靜電紡絲溶液，進行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏10x10cm²接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓14千伏，噴絲頭和接收板之間的距離為10cm，紡絲速率1.5ml/h，大約7h后鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜，取下后放入密閉容器內，用體積分數75％的乙醇在溫度為25℃、標準大氣壓的條件下的條件下進行熏蒸處理24h進行交聯，處理完畢后溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空干燥48h，去除殘留溶劑，得到納米纖維神經組織工程支架。用Image J軟件分析納米纖維直徑為539±90nm。

實施例4

一種納米纖維神經組織工程支架的制備方法，具體步驟為：

(1)將柞蠶絲在95～100℃環境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠后得到柞蠶絲素纖維，60℃烘干。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置于飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經冷凍干燥得到柞蠶絲素蛋白。

(2)將柞蠶絲素蛋白0.6g和聚乳酸-聚己內酯0.6g溶于10ml六氟異丙醇，以200r/min的速率磁力攪拌4h至完全溶解，得到柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內酯的總濃度為12％(w/v)的靜電紡絲溶液，進行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏10x10cm²接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓14千伏，噴絲頭和接收板之間的距離為10cm，紡絲速率1.5ml/h，大約7h后鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜，取下后放入密閉容器內，用體積分數75％的乙醇在在溫度為25℃、標準大氣壓的條件下的條件下進行熏蒸處理24h進行交聯，處理完畢后溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空干燥48h，去除殘留溶劑，得到納米纖維神經組織工程支架。用Image J軟件分析納米纖維直徑為838±147nm。

實施例5

一種納米纖維神經組織工程支架的制備方法，具體步驟為：

(1)將柞蠶絲在95～100℃環境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠后得到柞蠶絲素纖維，60℃烘干。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置于飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經冷凍干燥得到柞蠶絲素蛋白。

(2)將柞蠶絲素蛋白0.25g和聚乳酸-聚己內酯0.75g溶于10ml六氟異丙醇，以200r/min的速率磁力攪拌4h至完全溶解，得到柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內酯的總濃度為10％(w/v)的靜電紡絲溶液，進行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏10x10cm²接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓14千伏，噴絲頭和接收板之間的距離10cm，紡絲速率1.5ml/h，大約7h后鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜。取下后放入密閉容器內，用體積分數75％的乙醇在溫度為25℃、標準大氣壓的條件下的條件下進行熏蒸處理24h進行交聯，處理完畢后溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空干燥48h，去除殘留溶劑，得到納米纖維神經組織工程支架。用Image J軟件分析納米纖維直徑為399±83nm。

實施例6

一種納米纖維神經組織工程支架的制備方法，具體步驟為：

(1)將柞蠶絲在95～100℃環境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠后得到柞蠶絲素纖維，60℃烘干。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置于飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經冷凍干燥得到柞蠶絲素蛋白。

(2)將柞蠶絲素蛋白0.75g和聚乳酸-聚己內酯0.25g溶于10ml六氟異丙醇，以200r/min的速率磁力攪拌4h至完全溶解，得到柞蠶絲素蛋白與聚乳酸-聚己內酯的總濃度為10％(w/v)的靜電紡絲溶液，進行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏10x10cm²接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓14千伏；噴絲頭和接收板之間的距離10cm，紡絲速率1.5ml/h，大約7h后鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜。取下后放入密閉容器內，用體積分數75％的乙醇在溫度為25℃、標準大氣壓的條件下的條件下進行熏蒸處理24h進行交聯，處理完畢后溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空干燥48h，去除殘留溶劑，得到納米纖維神經組織工程支架。用Image J軟件分析納米纖維直徑為514±102nm。

實施例7

類似于實施例6，區別在于：所述步驟(2)中，柞蠶絲素蛋白的用量為1g，聚乳酸-聚己內酯的用量為0g。

對比例1

類似于實施例6，區別在于：所述步驟(2)中，柞蠶絲素蛋白的用量為0g，聚乳酸-聚己內酯的用量為1g。

實施例1-4中的納米纖維神經組織工程支架的掃描電鏡照片及直徑分布如圖1所示。實施例3，5-7和對比例1中的納米纖維神經組織工程支架的掃描電鏡照片及直徑分布如圖2所示。

實施例3，5-7和對比例1中的納米纖維神經組織工程支架的親疏水性如圖3所示，采用接觸角測試儀進行測試，其結果表明，實施例3，5-7和對比例1相比親水性降低，疏水性增加，且親水性隨著P(LLA-CL)含量的增加而降低。

神經雪旺細胞接種于實施例3，5-7和對比例1中的納米纖維神經組織工程支架及蓋玻片上，即利用24孔打孔器進行各樣品的準備，每種樣品在特定時間點準備3個平行樣，將各樣品置于24孔培養板中，以蓋玻片作為對照樣，將各板置于體積分數為75％的酒精蒸汽缸中進行滅菌處理2h后置于超凈工作臺備用，利用PBS依次清洗支架以及空白培養板3次，以此除去未揮發的酒精蒸汽。雪旺細胞的種植密度為每孔1×10⁴個，再將配好的DMEM培養基(89％DMEM，10％胎牛血清，1％雙抗)依次加入各孔中，放入37℃和5％CO₂的培養箱內孵育，以上操作步驟均在超凈臺內完成。在培養基中培養1，3，5和7天后的細胞活力如圖4所示。細胞活力采用MTT測試法表征，其結果表明相比于蓋玻片和對比例，實施例3，5-7中的樣品更有利于細胞的增殖，且實施例5增殖更顯著。

神經雪旺細胞接種于實施例3，5-7和對比例1中的納米纖維神經組織工程支架及蓋玻片上，利用24孔打孔器進行各樣品的準備，將各樣品置于24孔培養板中，以蓋玻片作為對照樣，將各板置于體積分數為75％的酒精蒸汽缸中進行滅菌處理2h后置于超凈工作臺備用，利用PBS依次清洗支架以及空白培養板3次，以此除去未揮發的酒精蒸汽。雪旺細胞的種植密度為每孔8×10³個，再將配好的DMEM培養基(89％DMEM，10％胎牛血清，1％雙抗)依次加入各孔中，放入37℃和5％CO₂的培養箱內孵育，以上操作步驟均在超凈臺內完成。培養3天后，進行酒精脫水處理，干燥后用于電鏡的拍攝，在培養基中培養3天后細胞的生長狀態如圖5所示。

神經雪旺細胞接種于實施例3，5-7和對比例1中的納米纖維神經組織工程支架及蓋玻片上，利用24孔打孔器進行各樣品的準備，將各樣品置于24孔培養板中，以蓋玻片作為對照樣，將各板置于體積分數為75％的酒精蒸汽缸中進行滅菌處理2h后置于超凈工作臺備用，利用PBS依次清洗支架以及空白培養板3次，以此除去未揮發的酒精蒸汽。雪旺細胞的種植密度為每孔8×10³個，再將配好的DMEM培養基(89％DMEM，10％胎牛血清，1％雙抗)依次加入各孔中，放入37℃和5％CO₂的培養箱內孵育，以上操作步驟均在超凈臺內完成。培養3天后進行羅丹和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料染色，其結果如圖6所示，表明相比于蓋玻片和對比例，實施例3，5-7中的樣品更有利于細胞粘附鋪展，細胞形貌較好，且實施例5所述樣品更顯著。