本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)或保健食品等技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大鯢粘液的新用途。
背景技術(shù)：
大鯢(Andrias davidianus Blanchard)為大型兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，俗名“娃娃魚”，屬國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，被稱為“生物界活化石”。隱鰓鯢科目前僅存2屬3種，其中大鯢屬有2種：即中國(guó)大鯢(Andrias davidianus)和日本大鯢(Andrias japonicus)；隱鰓鯢屬僅有分布于北美的隱鰓鯢(Cryptobranshus alleganiensis)一種。大鯢雌雄異體，7-8月產(chǎn)卵于巖石之上，隨水漂流孵化。大鯢頭部寬而扁闊，口大眼小，四肢短小，皮膚兩側(cè)有明顯的褶皺，軀體多分布疣粒。大鯢的遷徙能力較差，對(duì)水環(huán)境的依賴性大，故常棲于水質(zhì)清涼、巖石空洞較多的山間小溪的陰暗潮濕之地；其性情兇猛，以肉食為主，多有冬眠，成年大鯢體長(zhǎng)可達(dá)2m以上。大鯢體表光滑無鱗，皮膚多顯暗黑色和灰褐色，皮膚上有各種斑紋和豐富的腺體結(jié)構(gòu)，當(dāng)大鯢受到外來不良刺激時(shí)可分泌大量白色狀粘液，粘液起初呈漿狀，后漸變?yōu)檎吵砟z狀物，并伴有特殊性氣味。大鯢幾乎在全國(guó)各地均有分布，主要遍布在長(zhǎng)江流域中上游和中南部山區(qū)，以陜西、湖北、湖南、江西、貴州等省分布較為集中。陜南作為大鯢生長(zhǎng)的最佳適宜生活區(qū)域之一，有“大鯢之鄉(xiāng)”之稱。在漢中地區(qū)的城固、南鄭、勉縣、洋縣、留壩、西鄉(xiāng)、略陽(yáng)等縣廣泛分布。目前，漢中地區(qū)大鯢養(yǎng)殖有200萬尾左右，年孵化幼鯢突破50萬尾以上，養(yǎng)殖戶達(dá)1500多戶，為大鯢向商品化、規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。
中國(guó)獨(dú)有、世界首創(chuàng)的大鯢粘液這種生物材料，顛覆傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)傷口縫合技術(shù)，更將是顛覆傳統(tǒng)大鯢養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的新機(jī)遇。目前國(guó)內(nèi)常用的醫(yī)用粘合劑主要有血纖維蛋白、氰基丙烯酸酯以及貽貝足絲蛋白等。血纖維蛋白粘合力弱，固化緩慢，機(jī)械強(qiáng)度差。氰基丙烯酸酯毒性強(qiáng)，聚合物膜易碎。來源于海洋貽貝足絲的足絲蛋白，相比前兩種具有高強(qiáng)度高韌性和防水性，但是一萬個(gè)貽貝中才能制取1克粘附蛋白，導(dǎo)致貽貝足絲蛋白成本十分高昂。與貽貝足絲相比，大鯢體表粘液產(chǎn)量非常充足，每條一次可采50克，可重復(fù)循環(huán)大量采集實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。大鯢的生活環(huán)境較為獨(dú)特，一般在水流湍急，水質(zhì)清涼，水草茂盛，石縫和巖洞多的山間溪流、河流和湖泊之中。大鯢粘液的應(yīng)用目前在國(guó)際上完全是空白，公司建議軍科院抓緊實(shí)施大鯢粘液的醫(yī)用研發(fā)進(jìn)度，盡快研制出粉末、噴霧、貼片、液體等系列產(chǎn)品，用于部隊(duì)?wèi)?zhàn)場(chǎng)急救和醫(yī)療護(hù)理。
針對(duì)大鯢粘液傷口愈合作用進(jìn)行深入的研究，具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
基于上述原因，我們研究得到一種新的大鯢粘液提取物，用于傷口愈合藥物、傷口愈合醫(yī)療器械中，本發(fā)明的大鯢粘液的提取是通過大鯢粘液乙醇低溫沉淀，沉淀物調(diào)pH值、酶解，超濾的方法，得到大鯢粘液的提取物；藥理試驗(yàn)表明，本發(fā)明得到大鯢粘液的提取物，具有很好的傷口愈合作用。
本發(fā)明所述的大鯢為：經(jīng)過人工仿生態(tài)環(huán)境飼養(yǎng)得到的子二代或子三代的大鯢。
本發(fā)明所述的大鯢粘液又名：大鯢黏液。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
一種大鯢粘液的提取物用于傷口愈合藥物、傷口愈合醫(yī)療器械中的應(yīng)用；
其中傷口愈合藥物用于外傷愈合、燒傷愈合、燙傷愈合、外科手術(shù)愈合。
其中傷口愈合醫(yī)療器械用于外傷愈合、燒傷愈合、燙傷愈合、外科手術(shù)愈合。
大鯢粘液的制備方法包括：大鯢通過電刺激法、真空法、刮擦法獲得大鯢粘液，其中電刺激法中電壓為5-10V，真空法中真空度1kPa-10kPa；大鯢粘液的提取物制備方法為：步驟(1)：取大鯢粘液，加入大鯢粘液1-3倍的注射用水，水浴加熱至30℃-45℃，保持體系溫度30℃-45℃，攪拌10-30min，加入大鯢粘液0.5-1.5倍的乙醇，攪拌5min-10min，從水浴中取出，放置0℃-5℃環(huán)境下靜置8-12小時(shí)，過濾，得到沉淀A，濾液備用；
步驟(2)：取步驟(1)濾液，水浴加熱至30℃-45℃，保持體系溫度30℃-45℃，加入大鯢粘液3-4倍的乙醇，攪拌5min-10min，從水浴中取出，放置0℃-5℃環(huán)境下靜置8-12小時(shí)，過濾，得到沉淀B，沉淀A與沉淀B合并，得到沉淀；
步驟(3)：取步驟(2)得到的沉淀，加沉淀重量2-3倍的注射用水，用pH調(diào)節(jié)劑A調(diào)節(jié)pH值4.5-5.5，加入沉淀重量0.20-0.40倍的中性蛋白酶，水解2-4小時(shí)后，加注射用水，用pH調(diào)節(jié)劑B調(diào)節(jié)pH值為6.0-7.0，再加入沉淀重量1-2倍的菠蘿蛋白酶，水解3-6小時(shí)，得到酶解液；
步驟(4)：取步驟(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量達(dá)到50％-60％，靜置12-24小時(shí)，過濾，得到沉淀；
步驟(5)：取步驟(4)沉淀，加入沉淀重量4-8倍的注射用水，用0.22μm濾芯過濾，濾液再用截取分子量10000的超濾膜超濾，保留透過液，透過液冷凍干燥，得到大鯢粘液提取物。
其中pH調(diào)節(jié)劑A為枸櫞酸、蘋果酸或酒石酸。
pH調(diào)節(jié)劑B為枸櫞酸鈉。
本發(fā)明所述的大鯢為：經(jīng)過人工仿生態(tài)環(huán)境飼養(yǎng)得到的子二代或子三代的大鯢。
本發(fā)明所述的大鯢粘液又名：大鯢黏液。
傷口愈合試驗(yàn)研究
試驗(yàn)1體外凝血效果試驗(yàn)
試驗(yàn)藥物：本發(fā)明制備實(shí)施例得到大鯢粘液提取物；
對(duì)照藥：取大鯢1只，真空法(真空度5kpa)，得到大鯢粘液，滅菌，冷凍干燥。
試驗(yàn)方法：取小白鼠的麻醉：取體重為22±2g的小白鼠；250ml三角瓶中放入少量脫脂棉，倒入10ml乙醚，左手帶膠皮手套用無名指與小指將小鼠尾根部夾住，中指、食指與大拇指將小鼠頸部皮膚連同兩只耳朵一起抓起，然后將小鼠頭部塞進(jìn)三角瓶，伸進(jìn)約3cm，頭部周圍不能貼在三角瓶壁上，用手術(shù)刀片在小鼠背部劃一長(zhǎng)形傷口，深達(dá)皮下肌肉，將自制直徑為0.5cm的塑料圓圈染上顏色，印在小鼠背部進(jìn)行定位，用無菌鑷子從圓圈中心將小鼠皮膚夾起，然后用無菌剪刀沿印跡剪除背部皮膚，便能得到大小、深淺基本一致的圓形傷口。取造模后小白鼠，隨機(jī)分組，每組10只。對(duì)照組每天不做處理，給藥組取樣品0.1g加注射用水1ml，然后涂抹至傷口。用藥9天，第一天、第七天、第九天用三角尺測(cè)量傷口大小。
試驗(yàn)結(jié)果見表1。
表1傷口愈合效果對(duì)比結(jié)果
注：與陰性對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較#P<0.05。
試驗(yàn)結(jié)論：上述試驗(yàn)表明，本發(fā)明的促進(jìn)傷口愈合作用要顯著優(yōu)于對(duì)比例，充分說明本發(fā)明大鯢粘液的提取物具有更好的傷口愈合作用
試驗(yàn)2小鼠斷尾傷口愈合效果試驗(yàn)
試驗(yàn)藥物：本發(fā)明制備實(shí)施例得到大鯢粘液提取物；
對(duì)照藥：取大鯢1只，真空法(真空度5kpa)，得到大鯢粘液，滅菌，冷凍干燥。
試驗(yàn)方法：分別稱取0.1g實(shí)施例制得的大鯢粘液的提取物樣品和1g陽(yáng)性對(duì)照藥大鯢粘液凍干粉，分別置于展示瓶中，滅菌備用；取同批次的C57BL/6小鼠，稱重，量尾長(zhǎng)；用手術(shù)剪去小鼠尾長(zhǎng)的三分之一后，立即將斷尾傷口插入展示瓶中，同時(shí)計(jì)時(shí)。計(jì)算血流停止時(shí)的小鼠愈合量。
試驗(yàn)結(jié)果見表2。
表2小鼠斷尾傷口愈合效果試驗(yàn)結(jié)果
注：與陽(yáng)性對(duì)照組比較*P<0.05。
試驗(yàn)結(jié)論：上述試驗(yàn)表明，本發(fā)明大鯢粘液提取物具有更加優(yōu)秀的傷口愈合效果。
本發(fā)明所述的大鯢為：經(jīng)過人工仿生態(tài)環(huán)境飼養(yǎng)得到的子二代或子三代的大鯢。
本發(fā)明所述的大鯢粘液又名：大鯢黏液。
一種大鯢粘液的提取物用于傷口愈合藥物、傷口愈合醫(yī)療器械中的應(yīng)用；
其中傷口愈合藥物用于外傷愈合、燒傷愈合、燙傷愈合、外科手術(shù)愈合。其中傷口愈合醫(yī)療器械用于外傷愈合、燒傷愈合、燙傷愈合、外科手術(shù)愈合。
制備實(shí)施例
實(shí)施例1
取大鯢10只，采用真空法(真空度1kPa)，獲得大鯢粘液508g；
步驟(1)：取大鯢粘液，加入大鯢粘液1倍的注射用水，水浴加熱至30℃，保持體系溫度30℃，攪拌10min，加入大鯢粘液0.5倍的乙醇，攪拌5min，從水浴中取出，放置0℃環(huán)境下靜置8小時(shí)，過濾，得到沉淀A，濾液備用；
步驟(2)：取步驟(1)濾液，水浴加熱至30℃，保持體系溫度30℃，加入大鯢粘液3倍的乙醇，攪拌5min，從水浴中取出，放置0℃環(huán)境下靜置8小時(shí)，過濾，得到沉淀B，沉淀A與沉淀B合并，得到沉淀；
步驟(3)：取步驟(2)得到的沉淀，加沉淀重量2倍的注射用水，用枸櫞酸調(diào)節(jié)pH值4.5，加入沉淀重量0.20倍的中性蛋白酶，水解2小時(shí)后，加注射用水，用枸櫞酸鈉調(diào)節(jié)pH值為6.0，再加入沉淀重量1倍的菠蘿蛋白酶，水解6小時(shí)，得到酶解液；
步驟(4)：取步驟(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量達(dá)到50％，靜置24小時(shí)，過濾，得到沉淀；
步驟(5)：取步驟(4)沉淀，加入沉淀重量4倍的注射用水，用0.22μm濾芯過濾，濾液再用截取分子量10000的超濾膜超濾，保留透過液，透過液冷凍干燥，得到大鯢粘液提取物53.9g(總糖含量為61.3％)。
實(shí)施例2
取大鯢10只，采用真空法(真空度10kPa)，獲得大鯢粘液496g；
步驟(1)：取大鯢粘液，加入大鯢粘液3倍的注射用水，水浴加熱至45℃，保持體系溫度45℃，攪拌30min，加入大鯢粘液1.5倍的乙醇，攪拌10min，從水浴中取出，放置5℃環(huán)境下靜置12小時(shí)，過濾，得到沉淀A，濾液備用；
步驟(2)：取步驟(1)濾液，水浴加熱至45℃，保持體系溫度45℃，加入大鯢粘液4倍的乙醇，攪拌10min，從水浴中取出，放置5℃環(huán)境下靜置12小時(shí)，過濾，得到沉淀B，沉淀A與沉淀B合并，得到沉淀；
步驟(3)：取步驟(2)得到的沉淀，加沉淀重量3倍的注射用水，用蘋果酸調(diào)節(jié)pH值5.5，加入沉淀重量0.40倍的中性蛋白酶，水解4小時(shí)后，加注射用水，用枸櫞酸鈉調(diào)節(jié)pH值為7.0，再加入沉淀重量2倍的菠蘿蛋白酶，水解6小時(shí)，得到酶解液；
步驟(4)：取步驟(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量達(dá)到60％，靜置24小時(shí)，過濾，得到沉淀；
步驟(5)：取步驟(4)沉淀，加入沉淀重量8倍的注射用水，用0.22μm濾芯過濾，濾液再用截取分子量10000的超濾膜超濾，保留透過液，透過液冷凍干燥，得到大鯢粘液提取物50.6g(總糖含量為61.3％)。
實(shí)施例3
取大鯢10只，采用真空法(真空度5kPa)，獲得大鯢粘液513g；
步驟(1)：取大鯢粘液，加入大鯢粘液2倍的注射用水，水浴加熱至40℃，保持體系溫度40℃，攪拌20min，加入大鯢粘液1倍的乙醇，攪拌8min，從水浴中取出，放置3℃環(huán)境下靜置10小時(shí)，過濾，得到沉淀A，濾液備用；
步驟(2)：取步驟(1)濾液，水浴加熱至40℃，保持體系溫度40℃，加入大鯢粘液3.5倍的乙醇，攪拌8min，從水浴中取出，放置3℃環(huán)境下靜置10小時(shí)，過濾，得到沉淀B，沉淀A與沉淀B合并，得到沉淀；
步驟(3)：取步驟(2)得到的沉淀，加沉淀重量2.5倍的注射用水，用枸櫞酸調(diào)節(jié)pH值5.0，加入沉淀重量0.30倍的中性蛋白酶，水解3小時(shí)后，加注射用水，用枸櫞酸鈉調(diào)節(jié)pH值為6.5，再加入沉淀重量1.5倍的菠蘿蛋白酶，水解4.5小時(shí)，得到酶解液；
步驟(4)：取步驟(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量達(dá)到55％，靜置18小時(shí)，過濾，得到沉淀；
步驟(5)：取步驟(4)沉淀，加入沉淀重量6倍的注射用水，用0.22μm濾芯過濾，濾液再用截取分子量10000的超濾膜超濾，保留透過液，透過液冷凍干燥，得到大鯢粘液提取物53.7g(總糖含量為65.0％)。
實(shí)施例4
取大鯢10只，采用電擊法，獲得大鯢粘液481g；
步驟(1)：取大鯢粘液，加入大鯢粘液1.5倍的注射用水，水浴加熱至35℃，保持體系溫度35℃，攪拌15min，加入大鯢粘液0.8倍的乙醇，攪拌6min，從水浴中取出，放置2℃環(huán)境下靜置9小時(shí)，過濾，得到沉淀A，濾液備用；
步驟(2)：取步驟(1)濾液，水浴加熱至35℃，保持體系溫度35℃，加入大鯢粘液3.5倍的乙醇，攪拌6min，從水浴中取出，放置2℃環(huán)境下靜置9小時(shí)，過濾，得到沉淀B，沉淀A與沉淀B合并，得到沉淀；
步驟(3)：取步驟(2)得到的沉淀，加沉淀重量3倍的注射用水，用酒石酸調(diào)節(jié)pH值4.5，加入沉淀重量0.25倍的中性蛋白酶，水解3小時(shí)后，加注射用水，用枸櫞酸鈉調(diào)節(jié)pH值為6.0，再加入沉淀重量1.2倍的菠蘿蛋白酶，水解4小時(shí)，得到酶解液；
步驟(4)：取步驟(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量達(dá)到55％，靜置16小時(shí)，過濾，得到沉淀；
步驟(5)：取步驟(4)沉淀，加入沉淀重量5倍的注射用水，用0.22μm濾芯過濾，濾液再用截取分子量10000的超濾膜超濾，保留透過液，透過液冷凍干燥，得到大鯢粘液提取物49.1g(總糖含量為59.4％)。
實(shí)施例5
取大鯢10只，采用電擊法，獲得大鯢粘液482g；
步驟(1)：取大鯢粘液，加入大鯢粘液3倍的注射用水，水浴加熱至45℃，保持體系溫度45℃，攪拌25min，加入大鯢粘液1.4倍的乙醇，攪拌9min，從水浴中取出，放置4℃環(huán)境下靜置11小時(shí)，過濾，得到沉淀A，濾液備用；
步驟(2)：取步驟(1)濾液，水浴加熱至40℃，保持體系溫度40℃，加入大鯢粘液4倍的乙醇，攪拌9min，從水浴中取出，放置5℃環(huán)境下靜置11小時(shí)，過濾，得到沉淀B，沉淀A與沉淀B合并，得到沉淀；
步驟(3)：取步驟(2)得到的沉淀，加沉淀重量3倍的注射用水，用枸櫞酸調(diào)節(jié)pH值5.5，加入沉淀重量0.35倍的中性蛋白酶，水解3.5小時(shí)后，加注射用水，用枸櫞酸鈉調(diào)節(jié)pH值為7.0，再加入沉淀重量2倍的菠蘿蛋白酶，水解5.5小時(shí)，得到酶解液；
步驟(4)：取步驟(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量達(dá)到60％，靜置20小時(shí)，過濾，得到沉淀；
步驟(5)：取步驟(4)沉淀，加入沉淀重量7倍的注射用水，用0.22μm濾芯過濾，濾液再用截取分子量10000的超濾膜超濾，保留透過液，透過液冷凍干燥，得到大鯢粘液提取物48.8g(總糖含量為59.1％)。
實(shí)施例6
取大鯢10只，采用刮擦法，獲得大鯢粘液491g；
步驟(1)：取大鯢粘液，加入大鯢粘液3倍的注射用水，水浴加熱至45℃，保持體系溫度45℃，攪拌25min，加入大鯢粘液1.4倍的乙醇，攪拌9min，從水浴中取出，放置4℃環(huán)境下靜置11小時(shí)，過濾，得到沉淀A，濾液備用；
步驟(2)：取步驟(1)濾液，水浴加熱至40℃，保持體系溫度40℃，加入大鯢粘液4倍的乙醇，攪拌9min，從水浴中取出，放置5℃環(huán)境下靜置11小時(shí)，過濾，得到沉淀B，沉淀A與沉淀B合并，得到沉淀；
步驟(3)：取步驟(2)得到的沉淀，加沉淀重量3倍的注射用水，用酒石酸調(diào)節(jié)pH值5.5，加入沉淀重量0.35倍的中性蛋白酶，水解3.5小時(shí)后，加注射用水，用枸櫞酸鈉調(diào)節(jié)pH值為7.0，再加入沉淀重量2倍的菠蘿蛋白酶，水解5.5小時(shí)，得到酶解液；
步驟(4)：取步驟(3)得到酶解液，加入乙醇，使酶解液中含醇量達(dá)到60％，靜置20小時(shí)，過濾，得到沉淀；
步驟(5)：取步驟(4)沉淀，加入沉淀重量7倍的注射用水，用0.22μm濾芯過濾，濾液再用截取分子量10000的超濾膜超濾，保留透過液，透過液冷凍干燥，得到大鯢粘液提取物48.8g(總糖含量為59.1％)。
總糖檢測(cè)分析方法
樣品處理：取不同試驗(yàn)組得到大鯢粘液提取物，精密稱定0.10g，加去離子水10mL，溶解完全，定溶在50mL容量瓶中；
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確稱取0.10g葡萄糖，用去離子水定容到100mL，配制成標(biāo)準(zhǔn)母液。取不同體積的母液用去離子水定容到50mL，配成濃度分別為20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以去離子水做空白對(duì)照，各取1mL于試管中，再加入4ml蒽酮試劑(2g/L)，浸入100℃沸水中煮沸10min，取出后用流動(dòng)水冷卻。在分光光度計(jì)上，進(jìn)行光譜掃描，檢測(cè)在波長(zhǎng)620nm有最大吸收峰，并選擇620nm處進(jìn)行比色測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到公式為y＝0.0085x-0.092，R2＝0.99。
樣品測(cè)定：取1mL樣品于試管中，采用上述同樣步驟進(jìn)行操作，在620nm處進(jìn)行比色測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。
本發(fā)明所述的大鯢為：經(jīng)過人工仿生態(tài)環(huán)境飼養(yǎng)得到的子二代或子三代的大鯢。
本發(fā)明所述的大鯢粘液又名：大鯢黏液。
上述實(shí)施例大鯢粘液的提取物用于傷口愈合藥物、傷口愈合醫(yī)療器械中的應(yīng)用；
其中傷口愈合藥物用于外傷愈合、燒傷愈合、燙傷愈合、外科手術(shù)愈合。
其中傷口愈合醫(yī)療器械用于外傷愈合、燒傷愈合、燙傷愈合、外科手術(shù)愈合。
本發(fā)明大鯢為：經(jīng)過人工仿生態(tài)環(huán)境飼養(yǎng)得到的子二代或子三代的大鯢。
盡管以下本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但本發(fā)明并不局限于上述的具體實(shí)施方案和應(yīng)用領(lǐng)域，下述的具體實(shí)施方案僅僅是示意性的、指導(dǎo)性的，而不是限制性的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本說明書的啟示下和在不脫離本發(fā)明權(quán)利要求所保護(hù)的范圍的情況下，還可以做出很多種的形式，這些均屬于本發(fā)明保護(hù)之列。