本發明涉及一種麥藍菜提取物在促進奶牛泌乳中的應用。

背景技術：

麥藍菜[Vaccaria segetalis(Neck.)Garcke]為石竹科麥藍菜屬一年生或二年生草本植物，別名叫禁宮花、煎金花等。廣泛分布于亞洲、歐洲、北美及世界其他地區。麥藍菜在日本被作為園林植物種植已有幾百年的歷史。

麥藍菜的成熟干燥種子是我國的傳統常用中藥——王不留行(Semen vaccariae，Saponaria vaccaria，Vaccariae Semen)，又名王不留、麥藍子、奶米、留行子、王母牛、大麥牛、金剪刀草等。據《本草》記載，麥藍菜的藥用部位多系根、莖、葉、花與種子并用，而目前則多用種子。

奶牛是我國畜牧養殖業中重要的經濟動物之一，我國奶牛業普遍存在產奶量低、乳脂率和乳蛋白含量不高等問題，這些問題制約了我國奶牛業發展。目前國內外都積極探索提高奶牛泌乳量的有效方案。傳統方法采用添加抗生素及一些化學合成物質作為飼料添加劑來提高奶牛產奶性能或防治泌乳期奶牛疾病，但這些添加劑具有毒副作用大、殘留高、易產生抗、耐藥性和致癌、致突變等缺陷。2006年，歐盟全面禁止使用促生長抗生素類飼料添加劑。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種麥藍菜種子提取物在促進奶牛泌乳中的應用。

本發明提供了麥藍菜種子提取物的應用，為如下(1)-(6)中的至少一種：

(1)促進奶牛泌乳；

(2)促進奶牛乳腺上皮細胞分泌乳糖；

(3)促進奶牛乳腺上皮細胞分泌β-酪蛋白；

(4)促進奶牛乳腺上皮細胞分泌甘油三酯；

(5)促進奶牛乳腺上皮細胞中Stat5基因表達；

(6)提高奶牛乳腺上皮細胞中Stat5蛋白的表達量和/或活性。

本發明還保護麥藍菜種子提取物在制備產品中的應用；所述產品的用途為促進奶牛泌乳。

本發明還保護麥藍菜種子提取物在制備產品中的應用；所述產品的用途為如下(a1)-(a3)中的至少一種：

(a1)促進奶牛乳腺上皮細胞分泌乳糖；

(a2)促進奶牛乳腺上皮細胞分泌β-酪蛋白；

(a3)促進奶牛乳腺上皮細胞分泌甘油三酯。

本發明還保護麥藍菜種子提取物在制備產品中的應用；所述產品的用途為如下(b1)和/或(b2)：

(b1)促進奶牛乳腺上皮細胞中Stat5基因表達；

(b2)提高奶牛乳腺上皮細胞中Stat5蛋白的表達量和/或活性。

本發明還保護一種產品，活性成分為麥藍菜種子提取物，所述產品的用途為促進奶牛泌乳。

本發明還保護一種產品，活性成分為麥藍菜種子提取物，所述產品的用途為如下(a1)-(a3)中的至少一種：

(a1)促進奶牛乳腺上皮細胞分泌乳糖；

(a2)促進奶牛乳腺上皮細胞分泌β-酪蛋白；

(a3)促進奶牛乳腺上皮細胞分泌甘油三酯。

本發明還保護一種產品，活性成分為麥藍菜種子提取物，所述產品的用途為如下(b1)和/或(b2)：

(b1)促進奶牛乳腺上皮細胞中Stat5基因表達；

(b2)提高奶牛乳腺上皮細胞中Stat5蛋白的表達量和/或活性。

以上任一所述麥藍菜種子提取物為提取物I、提取物II、提取物III、提取物IV或提取物V或提取物VI；

所述提取物I的制備方法包括如下步驟：

①取麥藍菜種子或麥藍菜種子粉末，采用溶液甲進行提取，得到提取液；所述溶液甲為57體積份甲醇與43體積份水的混合液；

②取步驟①得到的提取液，進行高效液相色譜純化，收集洗脫液；

③將步驟②得到的洗脫液冷凍干燥，得到提取物I；

所述提取物II的制備方法包括如下步驟：

①取麥藍菜種子或麥藍菜種子粉末，采用所述溶液甲進行提取，得到提取液；

②取步驟①得到的提取液，進行高效液相色譜純化，收集洗脫液，得到提取物II；

所述提取物III的制備方法包括如下步驟：

①取麥藍菜種子或麥藍菜種子粉末，采用溶液乙進行提取，得到提取液；所述溶液乙為甲醇與水的混合液；

②取步驟①得到的提取液，進行高效液相色譜純化，收集洗脫液；

③將步驟②得到的洗脫液冷凍干燥，得到提取物III；

所述提取物IV的制備方法包括如下步驟：

①取麥藍菜種子或麥藍菜種子粉末，采用所述溶液乙進行提取，得到提取液；

②取步驟①得到的提取液，進行高效液相色譜純化，收集洗脫液，得到提取物IV；

所述提取物V的制備方法包括如下步驟：

取麥藍菜種子或麥藍菜種子粉末，采用所述溶液甲進行提取，得到提取物V；

所述提取物VI的制備方法包括如下步驟：

取麥藍菜種子或麥藍菜種子粉末，采用所述溶液乙進行提取，得到提取物VI。

所述提取物I的制備方法中，步驟①中，溶液甲與麥藍菜種子的配比具體可為50mL∶1g。

所述提取物I的制備方法中，步驟①中，所述提取的時間為15min。

所述提取物I的制備方法中，步驟①中，所述提取具體可為微波輔助提取。

所述微波輔助提取的參數具體可為：溫度65℃，微波功率400W。

所述麥藍菜種子粉末的制備方法具體如下：取干燥的麥藍菜種子，粉碎后過60目篩。

所述提取物I的制備方法中，步驟②中，所述高效液相色譜純化的參數如下：色譜柱為HIQ sil C18W柱；流動相由3體積份溶液A和7體積份溶液B組成；溶液A為甲醇；溶液B為0.6體積份磷酸和99.4體積份水的混合液；流動相流速為1mL/min；收集保留時間為19min出現的色譜峰對應的洗脫液。進樣體積具體可為10μL。檢測波長具體可為332nm。所述HIQ sil C18W柱具體型號可為：5μm。

所述提取物II的制備方法中，步驟①中，溶液甲與麥藍菜種子的配比具體可為50mL∶1g。

所述提取物II的制備方法中，步驟①中，所述提取的時間為15min。

所述提取物II的制備方法中，步驟①中，所述提取具體可為微波輔助提取。

所述微波輔助提取的參數具體可為：溫度65℃，微波功率400W。

所述麥藍菜種子粉末的制備方法具體如下：取干燥的麥藍菜種子，粉碎后過60目篩。

所述提取物II的制備方法中，步驟②中，所述高效液相色譜純化的參數如下：色譜柱為HIQ sil C18W柱；流動相由3體積份溶液A和7體積份溶液B組成；溶液A為甲醇；溶液B為0.6體積份磷酸和99.4體積份水的混合液；流動相流速為1mL/min；收集保留時間為19min出現的色譜峰對應的洗脫液。進樣體積具體可為10μL。檢測波長具體可為332nm。所述HIQ sil C18W柱具體型號可為：5μm。

所述提取物III的制備方法中，步驟①中，溶液乙與麥藍菜種子的配比具體可為50mL∶1g。

所述提取物III的制備方法中，步驟①中，所述提取的時間為15min。

所述提取物III的制備方法中，步驟①中，所述提取具體可為微波輔助提取。

所述微波輔助提取的參數具體可為：溫度65℃，微波功率400W。

所述麥藍菜種子粉末的制備方法具體如下：取干燥的麥藍菜種子，粉碎后過60目篩。

所述提取物III的制備方法中，步驟②中，所述高效液相色譜純化的參數如下：色譜柱為HIQ sil C18W柱；流動相由3體積份溶液A和7體積份溶液B組成；溶液A為甲醇；溶液B為0.6體積份磷酸和99.4體積份水的混合液；流動相流速為1mL/min；收集保留時間為19min出現的色譜峰對應的洗脫液。進樣體積具體可為10μL。檢測波長具體可為332nm。所述HIQ sil C18W柱具體型號可為：5μm。

所述提取物IV的制備方法中，步驟①中，溶液乙與麥藍菜種子的配比具體可為50mL∶1g。

所述提取物IV的制備方法中，步驟①中，所述提取的時間為15min。

所述提取物IV的制備方法中，步驟①中，所述提取具體可為微波輔助提取。

所述微波輔助提取的參數具體可為：溫度65℃，微波功率400W。

所述麥藍菜種子粉末的制備方法具體如下：取干燥的麥藍菜種子，粉碎后過60目篩。

所述提取物IV的制備方法中，步驟②中，所述高效液相色譜純化的參數如下：色譜柱為HIQ sil C18W柱；流動相由3體積份溶液A和7體積份溶液B組成；溶液A為甲醇；溶液B為0.6體積份磷酸和99.4體積份水的混合液；流動相流速為1mL/min；收集保留時間為19min出現的色譜峰對應的洗脫液。進樣體積具體可為10μL。檢測波長具體可為332nm。所述HIQ sil C18W柱具體型號可為：5μm。

所述提取物V的制備方法中，溶液甲與麥藍菜種子的配比具體可為50mL∶1g。

所述提取物V的制備方法中，所述提取的時間為15min。

所述提取物V的制備方法中，所述提取具體可為微波輔助提取。

所述微波輔助提取的參數具體可為：溫度65℃，微波功率400W。

所述麥藍菜種子粉末的制備方法具體如下：取干燥的麥藍菜種子，粉碎后過60目篩。

所述提取物VI的制備方法中，溶液乙與麥藍菜種子的配比具體可為50mL∶1g。

所述提取物VI的制備方法中，所述提取的時間為15min。

所述提取物VI的制備方法中，所述提取具體可為微波輔助提取。

所述微波輔助提取的參數具體可為：溫度65℃，微波功率400W。

所述麥藍菜種子粉末的制備方法具體如下：取干燥的麥藍菜種子，粉碎后過60目篩。

以上任一所述產品具體可為飼料添加劑。

本發明通過實驗證明，本發明的麥藍菜種子提取物能夠提高奶牛乳腺上皮細胞(具有泌乳功能)活力及增殖能力，促進奶牛乳腺上皮細胞中乳糖、β-酪蛋白和甘油三酯的分泌，增強奶牛乳腺上皮細胞的泌乳功能。麥藍菜種子提取物促泌乳活性的確定將為其天然藥物的開發提供有益啟示，為深度開發麥藍菜種子在制備飼料添加劑中的應用打下基礎。

附圖說明

圖1為奶牛乳腺上皮細胞形態學觀察結果。

圖2為奶牛乳腺上皮細胞激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察結果。

圖3為乳糖標準品的液相色譜圖。

圖4為乳糖含量檢測結果。

圖5為β-酪蛋白標準品的液相色譜圖。

圖6為β-酪蛋白含量檢測結果。

圖7為甘油三酯含量檢測結果。

圖8為奶牛乳腺上皮細胞泌乳相關信號分子的RT-PCR檢測統計結果。

圖9為奶牛乳腺上皮細胞泌乳相關信號分子的Western blot結果圖。

圖10為奶牛乳腺上皮細胞泌乳相關信號分子的Western blot檢測統計結果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。以下實施例中的雙抗為青鏈霉素。

麥藍菜種子：購于河北省安國市藥材公司。

MAS-II微波反應罐：新儀微波化學科技有限公司。

高效液相色譜儀(PU-980控制泵，UV-975紫外檢測器)：日本Jasco公司。

DMEM/F12培養液：將DMEM/F12干粉1袋倒于1000mL三角瓶中，先加入800mL放置于室溫的新鮮滅菌去離子水，輕搖溶解后，加入1.2g NaHCO₃，溶解后調整pH值至7.2，定容至1000mL。無菌條件下，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，4℃保存備用。

DMEM/F12干粉：Gibco公司。

Anti-Cytokeration 18：德國Acris公司。

乳糖標準品：德國Dr公司。

β-酪蛋白標準品：Sigma公司。

TG試劑盒：南京建成生物工程研究所。

實時熒光定量試劑盒 Primx ExTaqTM：TaKaRa公司。

實施例1、奶牛乳腺上皮細胞的獲得

1、取得健康的泌乳中期荷斯坦奶牛(飼養于東北農業大學畜牧高新技術園區)的乳腺組織，培育奶牛乳腺上皮細胞(方法參照文獻：陳建暉.奶牛乳腺上皮細胞系的建立[D].東北農業大學，2008.)。培育得到的乳腺細胞均為上皮樣細胞，呈短梭形或多角形，形態均一，細胞之間排列緊密(如圖1所示，200×)。

2、對步驟1得到的乳腺上皮細胞進行鑒定，依次按照如下步驟操作：

(1)制作細胞鋪片：將一塊潔凈的蓋玻片放入6孔細胞板中，待細胞融合80％單層時，吸去培養液，PBS緩沖液沖洗細胞兩次，每次5min；

(2)預冷甲醇固定10min，PBS沖洗細胞3次，每次5min，用干凈濾紙擦掉邊緣殘液；

(3)用含5％BSA的TBST封閉液，37℃，輕搖封閉1h；

(4)棄去封閉液，滴加Anti-Cytokeration 18(封閉液1∶10稀釋)，37℃，孵育細胞1h，TBST沖洗后滴加FITC標記二抗(封閉液1∶50稀釋)，37℃，孵育細胞1h；

(5)TBST沖洗細胞后用干凈濾紙吸去邊緣殘液；

(6)滴加1μg/mL的PI溶液，室溫作用10min；

(7)將抗熒光淬滅劑滴于1片潔凈載玻片上；

(8)封片：TBST再次沖洗鋪片后，小心將其從培養孔中取出，將附著細胞的一面輕貼在載玻片上，避免產生氣泡；

(9)激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。

鑒定結果如圖2所示(200×)。如圖所示，在細胞質中有綠色熒光的角蛋白18表達，紅色部分是經PI染色的細胞核，角蛋白18的表達呈陽性證明了培養的細胞是乳腺上皮細胞。

本實施例中制備的奶牛乳腺上皮細胞可傳30代左右，后續實驗采用傳代1-2次的細胞作為研究材料。

實施例2、麥藍菜種子提取物的獲得

1、取干燥的麥藍菜種子，粉碎后過60目篩。

2、取步驟1得到的麥藍菜種子粉末(1g)放入MAS-II微波反應罐，進行微波輔助提取。提取條件為：溶劑：57％(體積分數)甲醇水溶液；溫度65℃；液固比50mL/g；微波功率400W；提取時間15min。

3、將步驟2得到的提取液過0.45μm濾膜過濾，得到濾液。

4、將步驟3得到的濾液采用高效液相色譜儀純化，收集第19min時出現的色譜峰對應的洗脫液。

高效液相色譜檢測條件如下所示：

色譜柱：HIQ sil C18W柱(5μm)；

流動相由溶液A(30％)和溶液B(70％)組成；溶液A為甲醇；溶液B為0.6％(體積分數)磷酸水溶液；

體積流量：1mL/min；

進樣體積：10μL；

檢測波長：332nm。

5、將步驟4得到的洗脫液進行冷凍干燥，得到麥藍菜種子提取物A。將麥藍菜種子提取物A溶解于DMSO中，得到提取物母液A，后續實驗時將母液用DMEM/F12培養液稀釋為各實驗所需濃度。

6、取步驟1得到的麥藍菜種子粉末(25g)，加水250ml浸泡半個小時后煎煮，煮沸后文火30min，用四層紗布過濾藥液，藥渣加水125ml煮沸后文火煎30min，過濾藥液，合并兩次藥液，用文火濃縮至25ml，0.22μm濾膜過濾，得到濃縮液。將濃縮液冷凍干燥，得到麥藍菜種子提取物B。將麥藍菜種子提取物B溶解于DMSO中，得到提取物母液B，后續實驗時將母液用DMEM/F12培養液稀釋為各實驗所需濃度。

7、將步驟1得到的麥藍菜種子粉末溶解于DMSO中，得到麥藍菜種子粉末溶液，后續實驗時將麥藍菜種子粉末溶液用DMEM/F12培養液稀釋為各實驗所需濃度。

實施例3、麥藍菜種子提取物對奶牛乳腺上皮細胞增殖能力及活力影響

1、將實施例1制備的對數生長期的乳腺上皮細胞接種至12孔板(每孔1×10⁶個細胞)，采用DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)37℃靜置培養直至細胞長至70％-80％。

2、完成步驟2后，取所述12孔板，進行如下分組處理：

藥物組1：吸棄培養上清，加入含0.1μg/mL提取物A的DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)，37℃靜置24小時；提取物A的加入形式為提取物母液A；

藥物組2：吸棄培養上清，加入含1μg/mL提取物A的DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)，37℃靜置24小時；提取物A的加入形式為提取物母液A；

藥物組3：吸棄培養上清，加入含10μg/mL提取物A的DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)，37℃靜置24小時；提取物A的加入形式為提取物母液A；

藥物組4：吸棄培養上清，加入含100μg/mL提取物A的DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)，37℃靜置24小時；提取物A的加入形式為提取物母液A；

藥物組5：吸棄培養上清，加入含1000μg/mL提取物A的DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)，37℃靜置24小時；提取物A的加入形式為提取物母液A；

對照組：吸棄培養上清，加入DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)。

每組設置三個重復。

完成培養后，收集細胞，檢測細胞活力(檢測時總細胞中活細胞所占的百分比)及細胞增殖能力(檢測時的活細胞數目減去加藥處理前的活細胞數目)。

結果如表1所示。

表1細胞活力及細胞增殖情況檢測結果

注：同列實驗數據分別與對照組相比，^*表示差異顯著(P＜0.05)，^**表示差異顯著(P＜0.01)。

結果表明，提取物A濃度為0.1、1、10、100μg·mL^-1時，作用于奶牛乳腺上皮細胞24h后，奶牛乳腺上皮細胞的細胞活力和增殖能力呈逐漸增加的趨勢，各藥物組的細胞活力和細胞增殖能力均顯著高于對照組(P＜0.05)，且具有劑量依賴效應；當藥物濃度達1000μg/mL時，細胞活力和增殖能力下降，這說明提取物濃度過高會對細胞產生細胞毒作用。100μg/mL時提取物A對奶牛乳腺上皮細胞的增殖能力影響最為顯著，以此濃度作為研究提取物促進奶牛乳腺上皮細胞泌乳分子機制研究的最佳劑量。

實施例4、麥藍菜種子提取物在促進奶牛泌乳中的應用

一、麥藍菜種子提取物對奶牛乳腺上皮細胞分泌乳糖的影響

1、將實施例1制備的對數生長期的乳腺上皮細胞接種至12孔板(每孔1×10⁶個細胞)，采用DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)37℃靜置培養直至細胞長至70％-80％。

2、完成步驟2后，取所述12孔板，進行如下分組處理：

藥物組A：吸棄培養上清，加入含100μg/mL提取物A的DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)，37℃靜置24小時；提取物A的加入形式為提取物母液A；

藥物組B：吸棄培養上清，加入含100μg/mL提取物B的DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)，37℃靜置24小時；提取物B的加入形式為提取物母液B；

藥物組C：吸棄培養上清，加入含100μg/mL麥藍菜種子粉末的DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)，37℃靜置24小時；麥藍菜種子粉末的加入形式為麥藍菜種子粉末溶液；

對照組：吸棄培養上清，加入DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)。

將各組分別于培養后的12h、24h、36h、48h及72h收集奶牛乳腺上皮細胞，對細胞的乳糖分泌能力進行HPLC檢測。檢測方法如下：

測樣品的處理：用5％(體積分數)乙腈水溶液溶解不同濃度的乳糖標準樣品，不同處理的細胞用超純水重懸后用勻漿器破碎，然后用0.22μm濾膜過濾，收集濾液進行乳糖的檢測。

色譜柱：HIQ sil C18W柱(5μm)；

流動相：5％(體積分數)乙腈水溶液，經過0.22μm濾膜過濾，超聲脫氣；

流速：恒流0.6mL/min；

進樣體積：10μL；

檢測波長：195nm。

乳糖標準品的液相色譜圖如圖3所示。圖3中，橫坐標為保留時間(min)，縱坐標為峰高，標準品的保留時間為4.5min，在相同條件下出峰位置為±0.5min以內，可以認定為同一物質。

乳糖含量檢測結果如圖4所示，圖4中，橫坐標為處理時間(h)，縱坐標為乳糖含量(mg/mL)。結果表明，隨著提取物A作用時間的延長，奶牛乳腺上皮細胞乳糖的分泌能力均高于對照組。作用24h、36h、48h時，藥物組A較對照組乳糖的分泌量提高9.1％、8.7％、7.1％，差異顯著(p＜0.05)。藥物組B較對照組乳糖的分泌量提高2.3％、2.1％、1.8％。藥物組C較對照組乳糖的分泌量提高1.3％、1.4％、0.9％。結果表明，麥藍菜種子提取物A可以顯著刺激奶牛乳腺上皮細胞乳糖的分泌，其效果顯著高于麥藍菜種子提取物B和麥藍菜種子粉末。

二、麥藍菜種子提取物對乳腺上皮細胞分泌β-酪蛋白的影響

1、將實施例1制備的對數生長期的乳腺上皮細胞接種至12孔板(每孔1×10⁶個細胞)，采用DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)37℃靜置培養直至細胞長至70％-80％。

2、完成步驟2后，取所述12孔板，進行如下分組處理：

藥物組A：吸棄培養上清，加入含100μg/mL提取物A的DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)，37℃靜置24小時；提取物A的加入形式為提取物母液A；

藥物組B：吸棄培養上清，加入含100μg/mL提取物B的DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)，37℃靜置24小時；提取物B的加入形式為提取物母液B；

藥物組C：吸棄培養上清，加入含100μg/mL麥藍菜種子粉末的DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)，37℃靜置24小時；麥藍菜種子粉末的加入形式為麥藍菜種子粉末溶液；

對照組：吸棄培養上清，加入DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)。

將各組分別于培養后的12h、24h、36h、48h及72h收集奶牛乳腺上皮細胞，對細胞的β-酪蛋白分泌能力進行HPLC檢測。檢測方法如下：

測樣品的處理：用超純水溶解不同濃度的β-酪蛋白標準品，不同處理的細胞用超純水重懸后用勻漿器破碎，然后用0.22μm濾膜過濾，收集濾液進行β-酪蛋白的檢測。

色譜柱：TSK凝膠柱(Φ7.8×300mm)；

流動相：超純水；

流速：恒流0.6mL/min；

進樣體積：10μL；

檢測波長：280nm。

β-酪蛋白標準品的液相色譜圖如圖5所示。圖5中，橫坐標為保留時間(min)，縱坐標為峰高，標準品的保留時間為6min，在相同條件下出峰位置為±1min以內，可以認定為同一物質。

β-酪蛋白含量檢測結果如圖6所示，圖6中，橫坐標為處理時間(h)，縱坐標為β-酪蛋白含量(mg/mL)。結果表明，隨著提取物A作用時間的延長，奶牛乳腺上皮細胞的β-酪蛋白分泌能力均高于對照組。作用24h、36h、48h時，藥物組A較對照組乳糖的分泌量提高32％、24％、23％，差異顯著(p＜0.05)；藥物組B較對照組乳糖的分泌量提高12％、10％、9％；藥物組C較對照組乳糖的分泌量提高5％、7％、7％。結果表明，麥藍菜種子提取物A可以刺激奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白的分泌，其效果顯著高于麥藍菜種子提取物B和麥藍菜種子粉末。

三、麥藍菜種子提取物對乳腺上皮細胞分泌甘油三酯的影響

1、將實施例1制備的對數生長期的乳腺上皮細胞接種至12孔板(每孔1×10⁶個細胞)，采用DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)37℃靜置培養直至細胞長至70％-80％。

2、完成步驟2后，取所述12孔板，進行如下分組處理：

藥物組A：吸棄培養上清，加入含100μg/mL提取物A的DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)，37℃靜置24小時；提取物A的加入形式為提取物母液A；

藥物組B：吸棄培養上清，加入含100μg/mL提取物B的DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)，37℃靜置24小時；提取物B的加入形式為提取物母液B；

藥物組C：吸棄培養上清，加入含100μg/mL麥藍菜種子粉末的DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)，37℃靜置24小時；麥藍菜種子粉末的加入形式為麥藍菜種子粉末溶液；

對照組：吸棄培養上清，加入DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)。

將各組分別于培養后的12h、24h、36h、48h及72h收集奶牛乳腺上皮細胞，采用TG試劑盒對細胞的甘油三酯分泌能力進行檢測。

結果如圖7所示。圖7中，橫坐標為處理時間(h)，縱坐標為甘油三酯含量(mmol/L)。結果表明隨著提取物A作用時間的延長，奶牛乳腺上皮細胞的甘油三酯分泌能力均高于對照組，作用24h時，藥物組A較對照組甘油三酯的分泌量提高11.5％，差異顯著(p＜0.05)；藥物組B較對照組甘油三酯的分泌量提高4.1％；藥物組C較對照組甘油三酯的分泌量提高2.3％。結果表明，麥藍菜種子提取物A可以刺激體外培養的奶牛乳腺上皮細胞甘油三酯的分泌，其效果顯著高于麥藍菜種子提取物B和麥藍菜種子粉末。

步驟三、四、五的實驗結果表明，麥藍菜種子提取物A可以促進乳腺上皮細胞分泌β-酪蛋白、乳糖及甘油三酯，確實有催乳作用，且催乳效果顯著高于麥藍菜種子提取物B和麥藍菜種子粉末。

實施例5、麥藍菜種子提取物A對奶牛乳腺細胞信號傳導通路的影響

一、奶牛乳腺上皮細胞泌乳相關信號分子的RT-PCR檢測

1、將實施例1制備的對數生長期的乳腺上皮細胞接種至12孔板(每孔1×10⁶個細胞)，采用DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)37℃靜置培養直至細胞長至70％-80％。

2、完成步驟2后，取所述12孔板，進行如下分組處理：

藥物組：吸棄培養上清，加入含100μg/mL提取物A的DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)，37℃靜置24小時；提取物A的加入形式為提取物母液A；

對照組：吸棄培養上清，加入DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)。

將各組分別于培養后的12h、24h、36h、48h及72h收集奶牛乳腺上皮細胞，提取細胞的總RNA，反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，采用實時熒光定量試劑盒 Primx ExTaqTM進行Real-time PCR反應，Real-time PCR反應使用的引物如表2所示。

表2引物序列

Real-time PCR反應體系： Premix Ex Taq^TM12.5μL，引物F 0.5μL，引物R0.5μL，模板2μL，dH₂O 9.5μL。

Real-time PCR反應程序：95℃，10s；95℃，5s，60℃，31s，40個循環。

檢測結果如圖8所示。圖8A為Stat5基因相對表達水平，圖8B為β-酪蛋白基因相對表達水平。圖8中，橫坐標為處理時間(h)，縱坐標為相對表達量。結果表明，轉錄因子STAT5及β-酪蛋白mRNA的表達水平在提取物A作用后的12h至48h較對照組有較顯著的表達水平(P＜0.05)，到72h時其表達恢復為與對照組基本一致的水平。

二、奶牛乳腺上皮細胞泌乳相關信號分子的Western blot檢測

1、將實施例1制備的對數生長期的乳腺上皮細胞接種至12孔板(每孔1×10⁶個細胞)，采用DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)37℃靜置培養直至細胞長至70％-80％。

2、完成步驟2后，取所述12孔板，進行如下分組處理：

藥物組：吸棄培養上清，加入含100μg/mL提取物A的DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)，37℃靜置24小時；提取物A的加入形式為提取物母液A；

對照組：吸棄培養上清，加入DMEM/F12培養液(20％胎牛血清+0.1％雙抗)。

將各組分別于培養后的12h、24h、36h、48h及72h收集奶牛乳腺上皮細胞，提取細胞總蛋白，進行Western blot檢測細胞中Stat5、β-酪蛋白表達。

檢測結果如圖9和圖10所示。圖9中泳道1到10依次對應：12h對照組，12h藥物組，24h對照組，24h藥物組，36h對照組，36h藥物組，48h對照組，48h藥物組，72h對照組，72h藥物組。圖10A為Stat5蛋白相對表達水平，圖10B為β-酪蛋白蛋白相對表達水平。圖10中，橫坐標為處理時間(h)，縱坐標為相對表達量。結果表明在提取物A作用24h之后，其可以顯著誘導奶牛乳腺上皮細胞的Stat5轉錄因子和β-酪蛋白的表達水平(P＜0.05)，這與該分子的熒光定量結果相一致，結合提取物A可以誘導β-酪蛋白mRNA和蛋白表達水平的升高，提示提取物A誘導了乳腺上皮細胞Stat5介導的泌乳信號通路，進而影響其下游β-酪蛋白表達。