本發明涉及二苯乙烯苷的去除領域，具體涉及一種通過靈芝菌來降解二苯乙烯苷的方法。

背景技術：

何首烏是一種常見的中藥原料，但是直接使用具有一定的肝臟毒性，因此，在何首烏傳統的用藥中常用制首烏。涂燦等通過比較何首烏炮制前后對大鼠肝臟的損傷比較發現炮制能有效得降低何首烏肝毒性；通過對炮制前后化學成分的檢測發現隨著炮制時間的延長，二苯乙烯苷的含量呈下降趨勢，因此提出“何首烏中免疫增強物質如二苯乙烯苷會導致肝臟對潛在的肝損傷成分的易感性增加，從而誘發免疫激肝損傷”。(涂燦,蔣冰倩,趙艷玲,等.何首烏炮制前后對大鼠肝臟的損傷比較及敏感指標篩選[J].中國中藥雜志,2015,40(4):654-660.)傳統的何首烏脫毒方法為九蒸九曬，其操作過程復雜而且對蒸制的時間要求高，蒸制時間不夠則毒性無法脫除，(崔鶴蓉,柏兆方,宋海波,等.從古今炮制方法演變探討何首烏毒性的潛在影響因素[J].中國中藥雜志,2016,41(2):333-339.)而生物轉化法所需時間短，操作也比較簡單，更重要的是該靈芝菌能夠定量地轉化二苯乙烯苷，使二苯乙烯苷降低到一定的含量范圍內，避免因二苯乙烯苷與其他物質不同配比時所致的毒性。(胡錫琴,李敏,楊紅蓮,等.何首烏中鞣質與二苯乙烯苷不同配比對大鼠肝功能指標的影響[J].上海中醫藥雜志,2011,45(4):56-59.)。

目前，二苯乙烯苷生物轉化方法如下：1、菌種：黑曲霉；2、種子發酵培養基：1％葡萄糖，0.1％MgSO₄,0.1％KH₂PO₄,0.2％CON₂H₄。3、發酵條件：138rpm、溫度29℃、接種量20％、轉化時間為36h。(李玲等,何首烏活性成分二苯乙烯苷的黑曲霉轉化的研究，廣東化工，第22-48頁，2014年18期)

黑曲霉是曲霉屬真菌中的一種，在高溫高濕環境下容易大量生長繁殖產酶生熱，可引起環境中其他物質的霉變，甚至是產生致癌性的黃曲霉毒素。因此黑曲霉生物轉化不適于工藝化大生產。

技術實現要素：

本發明首次發現了靈芝菌具有降解二苯乙烯苷的作用，發現了靈芝菌的一種新用途。

本發明所述的靈芝菌購自廣東省微生物菌種保藏中心，其編號為GIM5.250，又稱紅芝、赤芝。

優選的，通過在所述靈芝菌的發酵液中添加二苯乙烯苷來實現對所述二苯乙烯苷的降解。靈芝菌在代謝的過程中可消耗二苯乙烯苷，通過將所述二苯乙烯添加于所述靈芝菌的發酵液中，可實現靈芝菌與二苯乙烯苷的充分混合，有利于充分地轉化。

優選的，所述靈芝菌的發酵液的制備方法為，將所述靈芝菌在固體培養基上進行活化后，接種于液體培養基中，培養至菌懸液的OD₆₀₀值達到0.2～0.4，得一級種子液，將所述一級種子液按0.5～3％的接種量再次接種于所述液體培養基中。

優選的，所述液體培養基中包括馬鈴薯浸粉4.5～5.5.0g/L，葡萄糖15～25g/L。

優選的，所述靈芝菌進行液體發酵的條件為：溫度22～34℃，時間12～36h，搖床轉速120～210r/min，液體培養基的瓶裝量15％～85％。

優選的，所述二苯乙烯在所述靈芝菌發酵液中的添加量為1～2g/L。

進一步優選的，在利用靈芝菌轉化二苯乙烯苷的過程中，包括如下步驟：

1)將靈芝菌在固體培養基上進行活化后，接種于液體培養基中，培養至菌懸液的OD₆₀₀值達到0.2～0.4，得一級種子液，將所述一級種子液按0.5～3％的接種量接種于所述液體培養基中，得靈芝菌發酵液，向所述靈芝菌發酵液中添加濃度為1～2g/L的二苯乙烯苷；所述液體培養基中包括馬鈴薯浸粉4.5～5.5g/L，葡萄糖15～25g/L；

2)將添加有二苯乙烯苷的發酵液在溫度為22～34℃；搖床轉速120～210r/min，液體培養基的瓶裝量15％～85％的條件下培養12～36h，實現對所述二苯乙烯苷的降解。

所述固體培養基為PDA固體培養基；液體培養基中包括馬鈴薯浸粉5.0g/L，葡萄糖20g/L。

本發明具有如下有益效果：

本發明發現了靈芝菌具有分解二苯乙烯苷的作用，發現了靈芝菌的一種新用途。另一方面，靈芝菌是一種藥用菌，對環境污染小，對人的健康無危害，為何首烏中二苯乙烯苷的轉化提供了一種更為安全的方法。

本發明優選的靈芝菌種靈芝菌，采用馬鈴薯葡萄糖水培養基和常規培養條件下發酵降解二苯乙烯苷，與采用黑霉進行轉化相比，轉化率更高，相同轉化時間內二苯乙烯苷的轉化率可達到99％以上，而且培養基的配制比較簡單，只需要馬鈴薯葡萄糖水即可，無需添加其他的物質，可以很大程度地節約成本，同時減少了培養基成分優化步驟，可以節約時間。

附圖說明

圖1為實施例1～11培養液中二苯乙烯苷的濃度圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

實施例中所使用的二苯乙烯苷是從何首烏中提取而來，經純化得到的標準品。

實施例1

本實施例涉及靈芝菌在二苯乙烯苷轉化中的應用，具體包括如下步驟：

1)斜面培養：將靈芝菌在無菌條件下接種于PDA固體培養基上，28℃條件下培養7天。

2)一級種子培養：將步驟1)培養的菌種在無菌條件下接種于液體培養基，28℃條件下搖床培養2天，制得一級種子，結束培養時靈芝菌懸液光密度OD600值達到0.2；液體培養基中包括馬鈴薯浸粉5.0g/L，葡萄糖20g/L；

3)發酵過程：在100mL的錐形瓶中添加50mL與步驟2)相同的液體培養液，再在其中接種步驟2)所述的菌懸液1mL，添加二苯乙烯苷至其濃度為75mg，28℃條件下，轉速為180r/min，培養12h。平行做三份，空白發酵液加液體培養基的體積比為2％的無菌水。

實施例2～11

與實施例1相比，其區別僅在于，培養時間分別為0h、3h、6h、9h、16h、24h、27h、30h、33h、36h。

實驗例

本實驗例涉及對實施例1～11所述發酵液中二苯乙烯苷的檢測，其檢測方法為：

取發酵上清液1mL加500μL甲醇，離心，取上清液，用HPLC測二苯乙烯苷峰面積。

高效液相條件：色譜柱：HC-C18,250×4.6mm

流動相：乙腈：0.1％甲酸水(25：75)

柱溫：20℃

波長：320nm

進樣量：10μL

所得檢測結果見圖1，由圖1可知，最終經過36h，靈芝菌可將二苯乙烯苷基本完全分解，且在12～30h內對二苯乙烯苷的降解量呈良好的線性關系。

雖然，上文中已經用一般性說明、具體實施方式及試驗，對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。