本發明涉及生物與醫藥新劑型、制劑技術領域，更具體涉及一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，同時還涉及一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的制備方法，方法便捷高效，同步實現細胞源性微囊泡表面葉酸和磁雙重標記；還涉及一種基于細胞源性微囊泡的靶向遞送載體在制備治療或預防腫瘤的局部化療藥物和基因治療載體中的應用，適用于科研及臨床實踐中利用這一腫瘤靶向遞送載體用于藥物或治療基因的特異性靶向輸送，用以預防或治療以下疾?。?、宮頸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、睪丸癌、胃癌、腎癌、肺腺癌、腦瘤等高表達葉酸受體的惡性腫瘤；2、位于淺表部位的惡性腫瘤，如皮膚癌、口腔癌；3、位于淺表部位的脈管性疾病，如皮膚或黏膜血管瘤、靜脈畸形、淋巴管畸形。

背景技術：

化學療法是目前治療惡性腫瘤最廣泛采用的臨床選擇之一，然而過低的藥物靶向遞送效率嚴重限制了其治療效果。不僅如此，傳統的化學療法中，藥物在全身的非特異性分布還損害機體正常細胞和組織器官的功能，導致不可避免的副作用和嚴重的全身毒性。另一方面，近年來蓬勃發展的基因治療正成為未來腫瘤治療最具潛力的前進方向。針對腫瘤發生的遺傳學背景，將外源性目的基因引入腫瘤細胞或其他體細胞內以糾正過度活化或補償缺陷的基因功能，從而達到治療腫瘤的目的，即為腫瘤的基因治療。雖然RNA干擾(RNAi)現象的發現與研究為基因治療帶來了新的契機，但是當前的基因治療策略與化學治療一樣，仍然極大受限于過低的靶向性，從而限制了臨床療效，并造成了諸多難以避免的全身副作用。綜上，臨床急需更安全可靠、更生物友好、更具有靶向性的藥物或治療基因遞送載體，以降低全身的副反應，增強治療效果。近年來，基于納米載體的藥物遞送系統得到了迅猛的發展，這一方面得益于腫瘤病變部位因紊亂的脈管系統增強了局部的“滲透和保留效果”，導致納米載體被動聚集于實體瘤部位，另一方面也是因為不同的修飾方法賦予了納米載體主動地腫瘤靶向性。這些基于納米載體的藥物遞送系統可以保護荷載藥物在遞送過程中免于生物降解，表現為更優良的活體穩定性和更長的藥物半衰期，從而大極大增加藥物在腫瘤病變部位的作用時間，改善臨床療效。

細胞源性的微囊泡，作為一種生物源性納米級別的膜性結構(直徑約100-1000nm)，幾乎所有細胞均可分泌，可以實現在細胞間傳遞多種生物活性分子(包括蛋白質、RNAs、DNAs等)。它作為一種天然的生物信息傳遞平臺，已受到廣泛關注，并且其作為治療載體的應用價值也逐漸被認識和開發。相比于傳統的人工合成的納米載體，細胞源性微囊泡作為藥物或基因遞送載體具備以下優點：

1、微囊泡的磷脂雙分子層外膜不僅可以作為天然的屏障，保護內容物在循環過程中不被降解，還可以通過與受體細胞膜的相互作用或直接融合增強內容物被受體細胞內吞的效率；

2、得益于其來源和結構特點，微囊泡具備穿透體內生物屏障，將藥物直接遞送至顱內等深在部位的潛能；

3、即使不經過任何人工修飾，細胞源性微囊泡也具備固有的天然腫瘤靶向性；

4、微囊泡在體內循環過程中具備良好的生物穩定性；

5、微囊泡具備優異的生物安全性，多項臨床試驗已經證實自體同源的微囊泡幾乎不存在免疫原性。

然而，伴隨著細胞源性微囊泡迅速轉化為實踐應用的納米載體，面臨的問題不斷涌現，諸如缺乏方便快速的用于分離富集細胞源性微囊泡的技術和方法，缺乏可擴展的高效裝載內容物的方法，以及受限的腫瘤特異靶向性等，這些缺陷嚴重阻礙了這一新技術新領域的發展和應用。

葉酸受體(folate receptor，FR)是一類糖基磷脂酰肌醇錨定的膜蛋白，對葉酸(folate，FA)具有極高的親和性，并且通過受體介導的胞吞作用攝取葉酸。研究發現，葉酸受體選擇性高表達于卵巢腫瘤以及許多上皮來源惡性腫瘤，諸如子宮內膜癌、腎癌、肺癌、乳腺癌、腦瘤等，而其在正常組織中呈現為極低甚至可忽略的表達水平。上述結果提示葉酸/葉酸受體(FA/FR)系統具備極大的腫瘤靶向性研究價值，一方面可以實現對腫瘤細胞的特異高選擇性，降低對正常組織的毒副作用，另一方面又可以利用這一受體介導的胞吞作用促進腫瘤細胞對治療藥物的攝取，改善臨床療效。

磁性納米顆粒結合外源性磁場(magnetic field，MF)已經被用于改善藥物載體的靶向性，這一技術被稱為磁性藥物靶向。通過將磁性材料與細胞共培養，可以獲取內部裝載有超順磁性納米顆粒的微囊泡，結合外源性磁場可以實現這些微囊泡在特定部位的富集。并且，裝載有磁性納米顆粒的微囊泡還可以作為造影劑用于核磁共振成像檢查以及熱溫治療。此外，利用外源性磁場促進此種微囊泡在腫瘤部位的大量富集可以有效降低受體介導的靶向定位過程中發生的脫靶效應。然而，此種修飾策略中細胞對磁性納米顆粒的吞噬以及微囊泡對內吞磁性顆粒的包裹完全是非選擇性和不可控的。因此，這一“間接包裝”策略仍然存在效率不高，產量過低以及產物不均勻的弊病，這些都嚴重限制了它的臨床應用。通過與膜上特異受體結合的免疫磁性分離方法已經廣泛用于分離天然囊泡，并且相較于超速離心方法，其展現出了諸多優勢(例如便捷，高效等)。然而，這種策略也極大的受限于因微囊泡特征性表面標志物的缺乏而造成的產量過低。綜上，當前急需一種生物友好的、高效的、通用的標記策略以克服上述弊端，尤其是實現已改造微囊泡的可擴展的生產。

技術實現要素：

本發明的目的是在于提供了一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，微囊泡的磷脂雙分子層外膜不僅可以作為天然的屏障，保護內容物在循環過程中不被降解，還可以通過受體細胞膜的相互作用或直接融合增強內容物被受體細胞內吞的效率；得益于其來源和結構特點，微囊泡具備穿透體內生物屏障，將藥物直接遞送至顱內等深在部位的潛能；即使不經過任何人工修飾，細胞源性微囊泡也具備固有的天然腫瘤靶向性；此外本發明制備的細胞源性囊泡還具有受體/配體、磁雙重靶向，其靶向性得到進一步提升；微囊泡在體內循環過程中具備良好的生物穩定性；微囊泡具備優異的生物安全性，多項臨床試驗已經證實自體同源的微囊泡幾乎不存在免疫原性。本發明制備的一種基于細胞源性微囊泡的藥物和治療基因靶向遞送載體可以有效增強荷載藥物或治療基因在腫瘤部位的富集，適用于多種腫瘤的治療；增強抗腫瘤療效。

本發明的另一個目的是在于提供了一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的制備方法，該方法一次性實現細胞源性微囊泡表面的葉酸和磁的雙重標記；方法易行，操作簡便，適用性廣，可用于獲得各種細胞源性功能化微囊泡；制備方法不依賴于復雜實驗設備，適合廣泛推廣；制備效率高，節省人力物力財力，在微囊泡收集前的培養過程中同步實現雙重修飾改造過程；利用前期修飾過程簡化了微囊泡載體的分離步驟，同時避免了潛在的蛋白聚合物、凋亡小體等雜質的污染，極大改善了產物純度；制備產物均一性好，且產量具備擴展性；實現了快速方便、經濟高效的制備一種具備葉酸和磁雙靶向性的藥物遞送載體。

本發明的另一個目的是在于提供一種基于細胞源性微囊泡的藥物和治療基因靶向遞送載體在制備治療或預防腫瘤的局部治療藥物中的應用。通過電穿孔方法向改造后的微囊泡載體中載入不同的敏感性化療藥物或治療基因，針對不同的腫瘤，配合外源性磁場的應用，可以有效增強荷載藥物或治療基因在腫瘤部位的富集，適用于多種腫瘤的治療；增強抗腫瘤療效，改善了當前化學治療或基因治療的臨床效果；在維持腫瘤局部有效治療濃度的同時可以降低血藥濃度，從而有效降低了藥物的全身副作用。這一應用具備的優勢為腫瘤的臨床治療帶來了新的希望。

為了達到上述的目的，本發明采用以下技術措施：

其技術構思是：一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，由細胞源性微囊泡、磷脂-聚乙二醇-生物素(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]，DSPE-PEG-Biotin)(Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)、磷脂-聚乙二醇-葉酸(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[folate(polyethylene glycol)-2000]，DSPE-PEG-FA)(Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)和鏈霉親和素修飾氧化鐵納米顆粒(Streptavidin-conjugated iron oxide nanoparticles，SA-IONPs)(Enriching Biotechnology，Shanghai，China)四部分組成，修飾過程為：利用磷脂替換策略將DSPE-PEG-Biotin和DSPE-PEG-FA修飾在細胞膜表面，然后饑餓處理所得的細胞，使細胞分泌細胞源性囊泡至培養上清中，最后將SA-IONPs加入到上清中，使SA-IONPs與上清中的細胞源性囊泡結合，最后利用磁性分離的方法收集FA/IONP-MVs。

各部分結構式如下：

細胞源性微囊泡(MVs)：(結構示意圖見圖1)。

DSPE-PEG-Biotin：

DSPE-PEG-FA：SA-IONPs：

一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs-DOX/siRNA/miRNA)：(結構示意圖見圖2)。一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的制備方法，其步驟是：

1、配置條件培養基：基礎培養基(HyClone，Waltham，MA，USA)中補充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(HyClone，Waltham，MA，USA)和1％(v/v)抗生素，同時添加DSPE-PEG-Biotin,(50ug/mL)和DSPE-PEG-Folate(5ug/mL)，4℃保存，獲得條件培養基；

2、將步驟1中獲得的條件培養基用于細胞的培養，在標準條件下培養約46－50h，待細胞生長至融合度達到80％左右時更換培養基，用不含血清的基礎培養基繼續培養46－50h，以促進細胞釋放微囊泡，收集培養上清，用于后續分離獲得功能化的微囊泡。

3、將步驟2中獲得的培養上清在4℃條件下用2000g離心20min，然后取上清，在4℃條件下繼續50000g離心60min，將獲取的沉淀用無菌PBS重懸，重懸后液體在4℃條件下繼續50000g離心60min，獲取的修飾后微囊泡用適宜體積無菌PBS重懸，凍存于-80℃。

4、將步驟3中制備的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體與抗生物素和抗葉酸的抗體在37℃條件下孵育28－32min，通過蔗糖密度梯度離心法去除游離抗體后，進行流式細胞學檢測和熒光顯微鏡觀察，確定上述制備的種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體上葉酸和生物素雙重標記的效率為92％左右。獲得膜表面經葉酸及氧化鐵納米顆粒雙重修飾效率達到約92％的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。

5、將步驟2中獲得的培養上清在3－5℃條件下用1800－2200g離心18－22min，然后取上清，每100mL培養上清中添加400μLSA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育28－32min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標記成功的微囊泡分離出來，用PBS重懸并洗脫數次(3－7次)，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。

6、將步驟5中制備的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體進行透射電鏡觀察、動態光散射分析和分子生物學分析，發現相較于對照組未修飾微囊泡，以及經常規超速離心分離的已修飾微囊泡，此種改造方法對微囊泡的水流動力學直徑、界面電動勢等物理性質，以及內部包裹的蛋白質、核酸等特征性分子的表達無明顯影響。上述結果證明這一基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的制備過程具備良好的生物友好性。獲得理化特性及生物學特征未見明顯改變的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體。

7、將正常未修飾微囊泡和步驟5中制備的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體與腫瘤細胞共培養，檢測不同濃度上述微囊泡載體對細胞增殖和活力等功能的影響。將正常未修飾微囊泡和上述制備的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體分別經尾靜脈注射入裸鼠體內，三周后對裸鼠進行肝腎功能分析、血液學分析，以及腫瘤組織學分析，相較于性別、年齡和體重配對的對照組裸鼠，上述制備的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體對裸鼠的肝腎功能，血液成分等指標均無明顯的影響，并且未發現潛在的免疫毒性，證明這一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體具備優良的活體生物安全性，不存在明顯的副反應。獲得無明顯活體毒副作用的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體。

8、將步驟5中制備的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體與細胞共培養，發現該遞送載體可有效被細胞攝取，并且其攝取效率受到培養基中游離葉酸的競爭性抑制，而在外源性磁場的作用下，又可削弱培養基中游離葉酸的競爭性抑制，促進細胞攝取該遞送載體。獲得可有效被腫瘤細胞經葉酸受體介導的胞吞作用攝取的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體。

9、將步驟5中制備的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體用近紅外熒光探針DiR標記后經尾靜脈注射于移植瘤模型的裸鼠體內，相較于對照組未修飾的微囊泡，上述基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體更顯著地聚集于腫瘤部位，并且在腫瘤部位施加外源磁場的作用下，此種聚集效率可明顯增強，通過對總熒光信號的分析，在注射后4h，對照組未修飾微囊泡在腫瘤部位的聚集效率為5.31％，單純修飾氧化鐵納米顆粒的微囊泡輔助外源性磁場約為13.23％，而靶向遞送載體輔助外源性磁場為25.89％，證明這一基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體具備優異的活體內腫瘤靶向性。獲得具備良好活體內主動及外源磁場介導的被動腫瘤靶向性的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體(其結構示意圖見附圖圖3)。該載體的外膜是類似于細胞膜的磷脂雙分子層，葉酸及生物素通過DSPE-PEG嵌合于磷脂雙分子層中，SA-IONPs與生物素結合，包繞于載體外側；載體的內部為各種來源于母細胞的生物信息分子，如DNA、mRNA、microRNA和蛋白質。

一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體在制備治療或預防腫瘤的局部化療藥物中的應用，步驟如下：

1、配置條件培養基：基礎培養基中補充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和1％(v/v)抗生素，同時添加DSPE-PEG-Biotin(50ug/mL)和DSPE-PEG-Folate(5ug/mL)，4℃保存，獲得條件培養基；

2、將步驟1中獲得的條件培養基用于細胞的培養，在標準條件下培養約46－50h，待細胞生長至融合度達到80％左右時更換培養基，用不含血清的基礎培養基(DMEM，Hyclone)繼續培養46－50h，以促進細胞釋放微囊泡，收集培養上清，用于后續分離獲得功能化的微囊泡。

3、將步驟2中獲得的收集的上清在3－5℃條件下用1800－2200g離心18－22min，然后取上清，每100mL培養上清中添加400μLSA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育28－32min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標記成功的微囊泡分離出來，用PBS重懸并洗脫數次，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的微囊泡載體。

4、將步驟3中收集的腫瘤靶向遞送載體與水溶性抗腫瘤藥物，如阿霉素(Doxorubicin，DOX)(40μg/mL)混合，利用電穿孔方式載入抗腫瘤藥物，在37℃溫箱中孵育28－32min，在外源性磁場作用下分離腫瘤靶向遞送載體，去除游離藥物，用PBS重懸并洗脫數次(4－8次)，最后將沉淀用PBS重懸。獲得載有抗腫瘤藥物阿霉素的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。

5、將步驟4中獲得的載有抗腫瘤藥物阿霉素的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體利用熒光顯微鏡、流式細胞學、小動物活體成像等多種技術手段檢驗藥物載入效率以及載藥后腫瘤靶向遞送載體的保存穩定性和活體穩定性。

6、將步驟4中獲得的載有抗腫瘤藥物阿霉素的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體與腫瘤細胞共培養，發現其可有效的被腫瘤細胞內吞，并且其內吞效率受到培養基中游離葉酸的競爭性抑制以及外源性磁場的正向促進。

7、將正常未修飾微囊泡、游離DOX、載有DOX的正常未修飾微囊泡、未載藥的靶向遞送載體以及步驟4中獲得的載有抗腫瘤藥物阿霉素的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體分別經尾靜脈注射于移植瘤裸鼠模型體內，每三天監測裸鼠體重及腫瘤大小變化，結果發現上述載藥后腫瘤靶向遞送載體發揮了最優異的抗腫瘤生長效果，并且在輔助外源性磁場的條件下，上述載藥后腫瘤靶向遞送載體幾乎完全抑制了腫瘤的生長，而對裸鼠體重無明顯影響。安樂處死裸鼠，收獲腫瘤行組織學分析，結果發現上述載藥后腫瘤靶向遞送載體有效促進腫瘤細胞的凋亡，抑制其增殖。

所述的腫瘤為宮頸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、睪丸癌、胃癌、腎癌、肺腺癌、腦瘤等高

表達葉酸受體的惡性腫瘤；

所述的腫瘤位于淺表部位的惡性腫瘤，具體為皮膚癌、口腔癌；

所述的位于淺表部位的脈管性疾病，具體為皮膚或黏膜血管瘤、靜脈畸形、淋巴管畸形。

一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體在制備治療或預防腫瘤的基因治療藥物中的應用，步驟如下：

1、配置條件培養基：基礎培養基中補充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和1％(v/v)抗生素，同時添加DSPE-PEG-Biotin(50ug/mL)和DSPE-PEG-Folate(5ug/mL)，4℃保存，獲得條件培養基；

2、將步驟1中獲得的條件培養基用于細胞的培養，在標準條件下培養約46－50h，待細胞生長至融合度達到80％左右時更換培養基，用不含血清的基礎培養基(DMEM，Hyclone)繼續培養46－50h，以促進細胞釋放微囊泡，收集培養上清，用于后續分離獲得功能化的微囊泡。

3、將步驟2中獲得的收集的上清在3－5℃條件下用1800－2200g離心18－22min，然后取上清，每100mL培養上清中添加400μL SA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育28－32min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標記成功的微囊泡分離出來，用PBS重懸并洗脫數次，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的微囊泡載體。

4、將步驟3中收集的腫瘤靶向遞送載體與治療基因(例如siRNA、miRNA等)混合，利用電穿孔方式載入抗腫瘤藥物，在37℃溫箱中孵育28－32min，在外源性磁場作用下分離腫瘤靶向遞送載體，去除游離治療基因，用PBS重懸并洗脫數次(4－8次)，最后將沉淀用PBS重懸。獲得載有抗腫瘤治療基因的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。

5、將步驟4中獲得的載有抗腫瘤治療基因的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體利用熒光顯微鏡、流式細胞學、小動物活體成像等多種技術手段檢驗治療基因載入效率以及載藥后腫瘤靶向遞送載體的保存穩定性和活體穩定性。

6、將步驟4中獲得的載有抗腫瘤治療基因的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體與腫瘤細胞共培養，發現其可有效的被腫瘤細胞內吞，并且相應治療基因在腫瘤細胞內高度富集，而其內吞效率受到培養基中游離葉酸的競爭性抑制以及外源性磁場的正向促進。最后檢測腫瘤細胞內相應靶基因的調節變化，以及對腫瘤增殖等功能活動的影響。

7、將正常未修飾微囊泡、游離治療基因、裝載有治療基因的正常未修飾微囊泡、未載入治療基因的靶向遞送載體以及步驟4中獲得的載有治療基因的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體分別經尾靜脈注射于移植瘤裸鼠模型體內，每三天監測裸鼠體重及腫瘤大小變化，結果發現上述載藥后腫瘤靶向遞送載體發揮了最優異的抗腫瘤生長效果，并且在輔助外源性磁場的條件下，上述載藥后腫瘤靶向遞送載體幾乎完全抑制了腫瘤的生長，而對裸鼠體重無明顯影響。安樂處死裸鼠，收獲腫瘤行組織學分析，結果發現上述載藥后腫瘤靶向遞送載體有效促進腫瘤細胞的凋亡，抑制其增殖。

所述的腫瘤為宮頸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、睪丸癌、胃癌、腎癌、肺腺癌、腦瘤等高表達葉酸受體的惡性腫瘤；

所述的腫瘤位于淺表部位的惡性腫瘤，具體為皮膚癌、口腔癌；

所述的位于淺表部位的脈管性疾病，具體為皮膚或黏膜血管瘤、靜脈畸形、淋巴管畸形。

本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果：

1、本發明選擇細胞源性微囊泡構建腫瘤靶向遞送載體，利用微囊泡的天然屬性，相較于人工合成的納米載體，在體內具備良好的生物穩定性和生物安全性，幾乎無免疫原性和細胞毒性，同時天然的磷脂雙分子膜結構可以保護載入內容物的循環穩定性，并且可以直接穿透體內的生物屏障，將荷載藥物遞送至顱內等特殊臟器，發揮優良的抗腫瘤效果；

2、利用膜修飾的方式一次性實現微囊泡表面葉酸和氧化鐵納米顆粒的雙重標記，快捷高效；

3、利用膜修飾方式實現微囊泡表面氧化鐵納米顆粒標記，相較于之前通過培養細胞實現微囊泡非選擇性隨機包裹氧化鐵納米顆粒的方式，本發明的標記操作更高效、方便，標記效率更高，標記密度完全可控，且在胞膜上標記，節省了微囊泡內部的空間，為腫瘤治療藥物的荷載預留了場所；

4、利用膜修飾的方式實現微囊泡表面氧化鐵納米顆粒的標記，繼而利用磁特性實現微囊泡載體的分離富集，相較于之前通過超速離心的方式或者免疫磁性方式分離微囊泡，本發明操作簡潔高效，只需一步，分離用時少于1小時，可實現高達92％的微囊泡的分離富集，不再受限于表面標志物的缺乏，提高了產量，可以滿足臨床用量的需求；避免了蛋白聚集物或諸如凋亡小體等其他顆粒的污染，保證產物的純度和均一性，有助于降低副反應；溫和的分離操作環境避免了微囊泡的聚集或者破損，有助于保持其功能活性；

5、本發明利用膜修飾的方式實現微囊泡表面氧化鐵納米顆粒標記，為該腫瘤靶向遞送載體賦予了磁特性，有助于后續應用擴展，例如后續可利用外源性磁場增強藥物的腫瘤靶向性創造了條件；

6、本發明利用膜修飾的方式實現微囊泡表面葉酸的標記，操作簡潔高效，標記效率高，且標記密度穩定可控。由于大多數上皮來源腫瘤及卵巢腫瘤高表達葉酸受體，而正常組織則低表達葉酸受體，經葉酸修飾的腫瘤靶向遞送載體可以經由受體介導的途徑被腫瘤細胞迅速高效內吞，有效增強該腫瘤靶向遞送載體的腫瘤靶向性，同時減少被正常組織的攝取，降低全身副反應。

7、本發明利用電穿孔的方式實現抗腫瘤藥物或治療基因的載入，操作簡潔高效，相較于直接給藥，微囊泡的天然膜結構可有效增強荷載物在體內循環過程中的穩定性，減少給藥濃度，降低副反應。

8、本發明具備良好的可擴展性，可根據病人選擇自體同源的微囊泡構建腫瘤靶向遞送載體，同時根據腫瘤對藥物或治療基因的敏感性選擇合適的載入藥物，實現腫瘤的個體化治療。

附圖說明

圖1為一種細胞源性微囊泡(MVs)的結構示意圖。

圖2為一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載(FA/IONP-MVs-DOX/siRNA/ miRNA)的結構示意圖。其中：O代表氧原子，HO代表羥基，N代表氮原子，NH代表亞氨基，NH₂代表氨基，NH₄⁺代表銨根，C代表碳原子，P代表磷原子，S代表硫原子。

圖3為一種具備良好活體內主動及外源磁場介導的被動腫瘤靶向性的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的結構示意圖。該載體的外膜是類似于細胞膜的磷脂雙分子層，葉酸及生物素通過DSPE-PEG嵌合于磷脂雙分子層中，SA-IONPs與生物素結合，包繞于載體外側；載體的內部為各種來源于母細胞的生物信息分子，如DNA、mRNA、microRNA和蛋白質。

圖4為一種膜表面經插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的結構示意圖。該載體的外膜是類似于細胞膜的磷脂雙分子層，葉酸及生物素通過DSPE-PEG嵌合于磷脂雙分子層中，SA-IONPs與生物素結合，包繞于載體外側；載體的內部為來源于母細胞的生物信息分子，如DNA、mRNA、microRNA和蛋白質。

圖5為一種載有化療藥物的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的結構示意圖。該載體外膜是類似于細胞膜的磷脂雙分子層，葉酸及生物素通過DSPE-PEG嵌合于磷脂雙分子層中，SA-IONPs與生物素結合，包繞于載體外側；載體內部為來源于母細胞的生物信息分子，如DNA、mRNA、micro-RNA和蛋白質；此外，載體內部還裝載有抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)。

圖6為一種載有針對survivin的抗腫瘤siRNA的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的結構示意圖。該載體外膜是類似于細胞膜的磷脂雙分子層，葉酸及生物素通過DSPE-PEG嵌合于磷脂雙分子層中，SA-IONPs與生物素結合，包繞于載體外側；載體內部為來源于母細胞的生物信息分子，如DNA、mRNA、micro-RNA和蛋白質；此外，載體內部還裝載有具備抗腫瘤作用的siRNA。

圖7為一種本發明內容模式圖。

圖8為一種細胞源性微囊泡表面DSPE-PEG-Biotin和DSPE-PEG-Folate同步標記效率。

將經條件培養基培養48h，再饑餓48h后收獲的細胞上清經常規高速離心后收獲修飾后細胞微囊泡，將其與抗生物素和抗葉酸熒光抗體孵育，通過蔗糖密度梯度離心法去除游離抗體后利用流式細胞術檢測雙陽性微囊泡的比例，結果提示微囊泡表面DSPE-PEG-Biotin和DSPE-PEG-Folate同步標記效率約為92％。

圖9為一種利用外源性磁場快速分離該腫瘤靶向遞送載體的操作圖。

圖10為一種腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)在雙重標記及磁介導的分離過程中對微囊泡固有生物學特性無明顯影響。

將常規超速離心的正常未修飾細胞微囊泡[MVs(DC)]，常規超速離心的葉酸和生物素雙修飾微囊泡[FA/Biotin-MVs(DC)]、經常規超速離心的腫瘤靶向遞送載體[FA/IONP-MVs(DC)]和磁介導分離的腫瘤靶向遞送載體[FA/IONP-MVs(MS)]分別提取核酸和蛋白質進行RT-qPCR和Westernblot實驗，檢驗不同組微粒所攜帶的標志性核酸及蛋白質的差異。結果表明這一腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)在雙重標記及磁介導的分離過程中對微囊泡固有生物學特性無明顯影響。

圖11為一種腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)在不載入藥物的狀態下對腫瘤細胞增殖或活力等功能影響相較于正常未修飾細胞微囊泡(MVs)無明顯差異，提示該腫瘤靶向遞送載體具備良好的生物安全性。

圖12為一種靜脈注射該腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)對移植瘤裸鼠模型的體重無明顯影響。

將PBS(Control)、正常未修飾微囊泡(MVs)和該腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)分別經尾靜脈注射進入移植瘤裸鼠模型體內，每三天一次，同時監測裸鼠體重，結果表明三組無顯著差異。

圖13為一種相較于PBS(Control)或正常未處修飾細胞微囊泡(MVs)，尾靜脈注射該腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)對移植瘤裸鼠的肝腎功能及血液學指標影響無顯著差異。

圖14為一種腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)能更高效的被細胞攝取，并且其攝取效率受共培養體系中游離葉酸(Free FA)的競爭性抑制和外源性磁場(MF)的正向促進。

將正常未修飾細胞微囊泡(MVs)和制備的腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)用近紅外熒光探針DiR進行標記染色，然后將他們分別與腫瘤細胞HeLa共培養，在共聚焦顯微鏡下觀察細胞攝取效率以及當在共培養體系中添加游離葉酸(FA)前后，或施加外源性磁場(MF)前后的攝取效率變化。

圖15為一種腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)在移植瘤裸鼠體內具備良好的腫瘤靶向性。

將正常微囊泡(MVs)，該腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)和單純氧化鐵納米顆粒標記的微囊泡(IONP-MVs)分別用近紅外熒光探針DiR染色標記后經尾靜脈注射進移植瘤裸鼠體內，然后在活體熒光成像系統中觀察注射前以及注射后1h、注射后2h、注射后4h裸鼠體內熒光信號的分布，最后將裸鼠麻醉處死后單獨觀察每組裸鼠內臟及腫瘤中熒光信號的分布。結果表明，在外源性磁場(MF)的輔助下，該腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs)具備最優異的腫瘤靶向性。

圖16為一種腫瘤靶向遞送載體載入腫瘤化療藥物的效率。

利用電穿孔的方式向該腫瘤靶向遞送載體內載入化療藥物DOX，然后采用流式細胞學技術分析在電穿孔操作時不同藥物濃度(1μg/mL、5μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL)對載入效率的影響，結果發現載入效率與藥物濃度成正相關；將載入藥物后的腫瘤靶向遞送載體用CFSE進行染色，然后在熒光顯微鏡下可以觀察到化療藥物DOX熒光信號和微囊泡信號的共定位。

圖17為一種載入化療藥物DOX后該腫瘤靶向遞送載體可有效地抗宮頸癌腫瘤生長作用及低生物毒性。

將PBS、游離DOX(Free DOX)、載有DOX的正常未處理細胞微囊泡(MVs-DOX)、載有DOX的單純氧化鐵納米顆粒標記的微囊泡(IONP-MVs-DOX)以及載入DOX后的腫瘤靶向遞送載體(FA/IONP-MVs-DOX)分別經尾靜脈注射入宮頸癌移植瘤裸鼠模型體內，每3天一次，同時監測腫瘤體積變化(寬*寬*長/2)和裸鼠體重變化。結果發現配合腫瘤局部外源性磁場作用，載入化療藥物DOX后該腫瘤靶向遞送載體具備良好的抗腫瘤生長作用，并且對裸鼠體重無明顯影響。

具體實施方式

實施例1:

一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的制備方法，其步驟是：

1、條件培養基：基礎培養基(HyClone，Waltham，MA，USA)中補充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(HyClone，Waltham，MA，USA)和1％(v/v)抗生素，同時添加DSPE-PEG-Biotin(50ug/mL)和DSPE-PEG-Folate(5ug/mL)，4℃保存，獲得條件培養基。

2、將步驟1中獲得的條件培養基用于細胞的培養，在標準條件下培養約48h，待細胞生長至融合度達到80％左右時更換培養基，用不含血清的基礎培養基繼續培養細胞，以促進細胞釋放微囊泡，培養46-50h后收集細胞培養上清，用于后續分離獲得功能化的微囊泡。

3、將步驟2中獲得的培養上清在4℃條件下用2000g離心20min，然后取上清，在4℃條件下繼續50000g離心60min，將獲取的沉淀用無菌PBS重懸，重懸后液體4℃條件下繼續50000g離心60min，獲取的微囊泡用適宜體積無菌PBS重懸，凍存于-80℃。

4、將步驟3中制備的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體與抗生物素和抗葉酸的抗體在37℃條件下孵育28－32min，通過蔗糖密度梯度離心法去除游離抗體后，進行流式細胞學檢測和熒光顯微鏡觀察，確定上述制備的種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體上葉酸和生物素雙重標記的效率為92％左右。獲得膜表面經葉酸及氧化鐵納米顆粒雙重修飾效率達到約92％的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。(圖2)

5、將步驟2中獲得的收集的上清在4℃條件下用2000g離心20min，然后取上清，每100mL培養上清中添加400μLSA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育30min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標記成功的微囊泡分離出來，棄去上清，用PBS重懸并洗脫數次，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存(該載體的結構示意圖見圖4)。該載體的外膜是類似于細胞膜的磷脂雙分子層，葉酸及生物素通過DSPE-PEG嵌合于磷脂雙分子層中，SA-IONPs與生物素結合，包繞于載體外側；載體的內部為來源于母細胞的生物信息分子，如DNA、mRNA、microRNA和蛋白質。

實施例2:

一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的體內外生物安全性檢測，其步驟如下：

1、條件培養基：基礎培養基(HyClone，Waltham，MA，USA)中補充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(HyClone，Waltham，MA，USA)和1％(v/v)抗生素，同時添加DSPE-PEG-Biotin(50ug/mL)和DSPE-PEG-Folate(5ug/mL)，4℃保存，獲得條件培養基。

2、將步驟1中獲得的條件培養基用于細胞的培養，在標準條件下培養約48h，待細胞生長至融合度達到80％左右時更換培養基，用不含血清的基礎培養基繼續培養細胞，以促進細胞釋放微囊泡，培養46-50h后收集細胞培養上清，用于后續分離獲得功能化的微囊泡。

3、將步驟2中獲得的收集的上清在4℃條件下用2000g離心20min，然后取上清，每100mL培養上清中添加400μLSA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育30min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標記成功的微囊泡分離出來，棄去上清，用PBS重懸并洗脫數次，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。

4、將步驟3中制備的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體進行透射電鏡觀察，動態光散射分析，結果發現相較于對照組正常未修飾微囊泡，以及經常規超速離心分離的已修飾微囊泡，此種制備方法對微囊泡的水流動力學直徑、界面電動勢等物理性質無明顯影響。

5、將步驟3中制備的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體進行分子生物學分析，提取總蛋白質進行Westernblot分析，提取核酸進行RT-qPCR分析，檢測細胞微囊泡攜帶的蛋白質、核酸等特征性分子的表達，結果表明此種制備方法對微囊泡的內容物無明顯影響。上述結果證明這一基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的制備過程是生物友好性的。(圖4)

6、將正常未修飾細胞微囊泡(20μg/mL)和步驟3中制備的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體(20μg/mL)分別與腫瘤細胞HeLa共培養，然后用細胞活力計數儀檢測細胞的增殖和活力變化，發現即使在載體濃度高達40μg/mL的濃度，連續培養70－74h，該腫瘤靶向遞送載體對細胞的增殖和活力的影響均無顯著差異。(圖5)

7、將PBS(100μL，n＝5)，未修飾微囊泡(100μL，1mg/mL，n＝5)和上述制備的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體(100μL，1mg/mL，n＝5)分別經尾靜脈注射入周齡和體重配對的雌性C57BL/6小鼠體內，每三天記錄一次小鼠體重，三周后對小鼠進行肝腎功能分析、血液學分析、以及腫瘤組織學分析。相較于PBS組小鼠，未修飾微囊泡和上述制備的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體對小鼠的體重、肝腎功能、血液成分等指標均無明顯的影響，并且未發現潛在的免疫毒性，證明這一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體具備優良的活體生物安全性，不存在明顯的副反應。(圖6、圖7)

實施例3:

一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的體內外腫瘤靶向性檢測，其步驟如下：

1、條件培養基：基礎培養基(HyClone，Waltham，MA，USA)中補充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(HyClone，Waltham，MA，USA)和1％(v/v)抗生素，同時添加DSPE-PEG-Biotin(50μg/mL)和DSPE-PEG-Folate(5μg/mL)，4℃保存，獲得條件培養基。

2、將步驟1中獲得的條件培養基用于細胞的培養，在標準條件下培養約48h，待細胞生長至融合度達到80％左右時更換培養基，用不含血清的基礎培養基繼續培養細胞，以促進細胞釋放微囊泡，培養46-50h后收集細胞培養上清，用于后續分離獲得功能化的微囊泡。

3、將步驟2中獲得的收集的上清在4℃條件下用2000g離心20min，然后取上清，每100mL培養上清中添加400μLSA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育30min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標記成功的微囊泡分離出來，棄去上清，用PBS重懸并洗脫數次，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。

4、將正常未處理細胞微囊泡(20μg/mL)和步驟3中制備的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體(20μg/mL)分別用CFSE進行熒光染色標記，然后將他們分別與用cellmask進行熒光染色標記的腫瘤細胞HeLa進行共培養，然后在熒光顯微鏡下觀察，發現該遞送載體可有效被細胞攝??；然后在共培養體系中添加游離葉酸(1mM)，結果發現腫瘤細胞對該腫瘤靶向遞送載體的攝取效率受到培養基中游離葉酸的競爭性抑制；如果在培養瓶的底部放置磁鐵(100×50×20mm，0.6T)，結果發現外源性磁場的輔助作用又可削弱培養基中游離葉酸的競爭性抑制，促進細胞攝取該遞送載體。(圖8)

5、將正常未修飾的微囊泡，單純氧化鐵顆粒標記的微囊泡和步驟3中制備的一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體用近紅外熒光探針DiR(300μg/mL)標記后經尾靜脈注射于移植瘤模型的裸鼠體內，然后于注射前、注射后1h、注射后2h和注射后4h分別用活體熒光成像系統檢測裸鼠體內熒光信號分布。相較于對照組正常未修飾的微囊泡，上述基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體更顯著地聚集于腫瘤部位，并且在腫瘤部位施加外源磁場時，該聚集效率可明顯增強，通過對總熒光信號分析，在注射后4h，對照組未修飾微囊泡在腫瘤部位的聚集效率為5.31％，單純修飾氧化鐵納米顆粒的微囊泡輔助外源磁場為13.23％，而靶向遞送載體輔助外源磁場為25.89％，證明這一基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體具備優異的活體內腫瘤靶向性。(圖9)

所述的腫瘤為宮頸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、睪丸癌、胃癌、腎癌、肺腺癌、腦瘤等高表達葉酸受體的惡性腫瘤。

實施例4:

一種載有化療藥物的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的制備方法，其步驟如下：

1、條件培養基：基礎培養基(HyClone，Waltham，MA，USA)中補充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(HyClone，Waltham，MA，USA)和1％(v/v) 抗生素，同時添加DSPE-PEG-Biotin(50μg/mL)和DSPE-PEG-Folate(5μg/mL)，4℃保存，獲得條件培養基。

2、將步驟1中獲得的條件培養基用于細胞的培養，在標準條件下培養約48h，待細胞生長至融合度達到80％左右時更換培養基，用不含血清的基礎培養基(DMEM，Hyclone)繼續培養細胞，以促進細胞釋放微囊泡，培養46-50h后收集細胞培養上清，用于后續分離獲得功能化的微囊泡。

3、將步驟2中獲得的收集的上清在4℃條件下用2000g離心20min，然后取上清，每100mL培養上清中添加400μLSA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育30min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標記成功的微囊泡分離出來，棄去上清，用PBS重懸并洗脫數次，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的微囊泡載體。

4、將步驟3中收集的腫瘤靶向遞送載體(100μg，50μL)與不同濃度(0-60μg/mL)的水溶性抗腫瘤藥物，如阿霉素(Doxorubicin，DOX)(Actavis Italy S.p.A.)混合，添加電穿孔緩沖液，將體系配成250μL，利用電穿孔方式(條件為250V和350μF，Bio-Rad Gene PulserXcell^TM Electroporation System)載入抗腫瘤藥物，在37℃溫箱中孵育30min，在外源性磁場作用下分離腫瘤靶向遞送載體，去除游離藥物，用PBS重懸并洗脫數次(4－8次)，最后將沉淀用PBS重懸。利用流式細胞學技術分析不同藥物濃度對藥物載入效率的影響，最終確定40μg/mL的DOX濃度為最適宜的選擇，用于后續實驗。獲得載有抗腫瘤藥物阿霉素的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。(圖10)

5、將步驟4中制備的一種載有化療藥物的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體在37℃條件下儲存7天，隨后用流式細胞學技術分析其載入的DOX的熒光信號，結果發現相較于新制備的一種載有化療藥物的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，該條件下長達7天的儲存未明顯改變其內的DOX信號，表明本方法制備的一種載有化療藥物的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體具備極好的穩定性(該載體的結構示意圖見圖5)。該載體外膜是類似于細胞膜的磷脂雙分子層，葉酸及生物素通過DSPE-PEG嵌合于磷脂雙分子層中，SA-IONPs與生物素結合，包繞于載體外側；載體內部為來源于母細胞的生物信息分子，如DNA、mRNA、micro-RNA和蛋白質；此外，載體內部還裝載有抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)。

實施例5：

一種載有化療藥物的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體對腫瘤細胞的靶向性，其步驟如下：

1、配置條件培養基：基礎培養基中補充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和1％(v/v)抗生素，同時添加DSPE-PEG-Biotin(50μg/mL)和DSPE-PEG-Folate(5μg/mL)，4℃保存，獲得條件培養基。

2、將步驟1中獲得的條件培養基用于細胞的培養，在標準條件下培養約48h，待細胞生長至融合度達到80％左右時更換培養基，用不含血清的基礎培養基(DMEM，Hyclone)繼續培養48h，以促進細胞釋放微囊泡，收集培養上清，用于后續分離獲得功能化的微囊泡。

3、將步驟2中獲得的收集的上清在4℃條件下用2000g離心20min，然后取上清，每100mL培養上清中添加400μLSA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育30min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標記成功的微囊泡分離出來，棄去上清，用PBS重懸并洗脫數次，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的微囊泡載體。

4、將步驟3中收集的腫瘤靶向遞送載體(100μg，50μL)與水溶性抗腫瘤藥物，如阿霉素(Doxorubicin，DOX)(Actavis Italy S.p.A.)(40μg/mL)混合，添加電穿孔緩沖液，將體系配成250μL，利用電穿孔方式(條件為250V和350μF，Bio-Rad Gene PulserXcell^TMElectroporation System)載入抗腫瘤藥物，在37℃溫箱中孵育30min，在外源性磁場作用下分離腫瘤靶向遞送載體，去除游離藥物，用PBS重懸并洗脫數次(4－8次)，最后將沉淀用PBS重懸。獲得載有抗腫瘤藥物阿霉素的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存。

5、將游離DOX、載有DOX的正常未修飾的微囊泡(20μg/mL)、載有DOX的單純氧化鐵顆粒標記的微囊泡(20μg/mL)和步驟4中制備的一種載有化療藥物DOX的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體(20μg/mL)與腫瘤細胞HeLa共培養，在共培養的起始一小時，在培養皿底部放置一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)，經過4h的共培養后用PBS洗滌3次，再用4％多聚甲醛固定10min，最后對細胞核進行DAPI染色，隨后在熒光顯微鏡下觀察不同組內細胞中DOX的熒光信號密度。結果發現步驟4中制備的一種載有化療藥物DOX的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體被細胞攝取然后釋放DOX的效率最高，表明其良好的腫瘤靶向性。

6、步驟4中制備的一種載有化療藥物DOX的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體(20μg/mL)與腫瘤細胞HeLa進行共培養，觀察在共培養體系中添加游離葉酸或不添加游離葉酸，以及在培養初期輔助外源性磁場或不適用外源性磁場的條件下，該遞送載體被腫瘤細胞攝取的效率變化。結果發現腫瘤細胞對該腫瘤靶向遞送載體的攝取效率受到培養基中游離葉酸的競爭性抑制，同時外源性磁場的輔助作用又可削弱培養基中游離葉酸的競爭性抑制，促進細胞攝取該遞送載體。

實施例6：

一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體在制備治療或預防宮頸癌的局部化療藥物中的應用，其步驟如下：

1、將Hela細胞(200μL溶液含10⁷個腫瘤細胞)種植于裸鼠(體重約18～20g)皮下，構建裸鼠移植瘤模型，模型構建成功后每三天記錄腫瘤體積(寬*寬*長/2)，待腫瘤體積達到150mm³后將裸鼠隨機均分為7組，用于后續實驗。

2、將7組裸鼠分別用尾靜脈注射PBS(100μL；G1)，尾靜脈注射游離DOX(100μL、5mg/kg；G2)，尾靜脈注射正常未修飾微囊泡(100μL；G3)，尾靜脈注射載有DOX的正常未修飾微囊泡(100μL；G4)，尾靜脈注射單純氧化鐵顆粒修飾的載藥微囊泡加外源磁場(100μL；G5)，尾靜脈注射葉酸和氧化鐵納米顆粒雙修飾的載藥微囊泡(100μL；G6)，尾靜脈注射葉酸和氧化鐵顆粒雙修飾的載藥微囊泡加外源性磁場(100μL；G7)這7種治療方式處理，以DOX的用量為5mg/kg確定每組載體的具體用量，藥物注射每3天一次，共持續4次，同時每3天記錄裸鼠體重和腫瘤體積(寬*寬*長/2)。

3、最后，將裸鼠麻醉處死，獲取腫瘤組織，拍照并稱量腫瘤重量，并對獲取的腫瘤組織進行組織學分析(TUNEL細胞凋亡檢測)。

4、相較于其他組，上述載藥后腫瘤靶向遞送載體輔助外援磁場發揮了最優異的抗腫瘤生長效果，幾乎完全抑制了腫瘤的生長，而對裸鼠體重無明顯影響。腫瘤組織學分析發現上述載藥后腫瘤靶向遞送載體有效促進腫瘤細胞的凋亡，抑制其增殖。(圖11)

實施例7：

一種載有治療基因的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體的制備方法，其步驟如下：

1、配置條件培養基：基礎培養基(HyClone，Waltham，MA，USA)中補充10％(v/v)胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(HyClone，Waltham，MA，USA)和1％(v/v)抗生素，同時添加DSPE-PEG-Biotin(50μg/mL)和DSPE-PEG-Folate(5μg/mL)，4℃保存，獲得條件培養基。

2、將步驟1中獲得的條件培養基用于細胞的培養，在標準條件下培養約48h，待細胞生長至融合度達到80％左右時更換培養基，用不含血清的基礎培養基(DMEM，Hyclone)繼續培養細胞，以促進細胞釋放微囊泡，培養46-50h后收集細胞培養上清，用于后續分離獲得功能化微囊泡。

3、將步驟2中獲得的收集的上清在4℃條件下用2000g離心20min，然后取上清，每100mL培養上清中添加400μL SA-IONPs溶液(10μg/μL)，用渦旋儀輕柔混勻混合液，然后在37℃溫箱中孵育30min，接著使用一塊磁鐵(100×50×20mm，0.6T)將混合液中SA-IONPs標記成功的微囊泡分離出來，棄去上清，用PBS重懸并洗脫數次，最后將沉淀用PBS重懸，凍存于-80℃。獲得膜表面經插入葉酸及氧化鐵納米顆粒修飾的微囊泡載體。

4、將步驟3中收集的腫瘤靶向遞送載體(100μg)與針對survivin的抗腫瘤siRNA(500nM)混合，添加電穿孔緩沖液，將體系配成250μL，利用電穿孔方式(條件為250V和350μF，Bio-Rad Gene PulserXcellTM Electroporation System)載入抗腫瘤治療基因，在37℃溫箱中孵育30min，在外源性磁場作用下分離腫瘤靶向遞送載體，去除游離治療基因，用PBS重懸并洗脫數次(4－8次)。獲得載有針對survivin的抗腫瘤siRNA的基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體，以溶液形式保存(該載體結構示意圖見圖6)。該載體外膜是類似于細胞膜的磷脂雙分子層，葉酸及生物素通過DSPE-PEG嵌合于磷脂雙分子層中，SA-IONPs與生物素結合，包繞于載體外側；載體內部為來源于母細胞的生物信息分子，如DNA、mRNA、micro-RNA和蛋白質；此外，載體內部還裝載有具備抗腫瘤作用的siRNA。

實施例8：

一種基于細胞源性微囊泡的腫瘤靶向遞送載體在制備治療或預防宮頸癌的局部基因治療藥物中的應用，其步驟如下：

1、將Hela細胞(200μL溶液含10⁷個腫瘤細胞)種植于裸鼠(體重約18～20g)皮下，構建裸鼠移植瘤模型，模型構建成功后每三天記錄腫瘤體積(寬*寬*長/2)，待腫瘤體積達到150mm³后將裸鼠隨機均分為7組，用于后續實驗。

2、將7組裸鼠分別用尾靜脈注射PBS(100μL，n＝6)，尾靜脈注射游離針對survivin的抗腫瘤siRNA(100μL，20μM，n＝6)，尾靜脈注射正常未修飾微囊泡(100μL，1mg/mL，n＝6)，尾靜脈注射載有針對survivin的抗腫瘤siRNA的正常未修飾微囊泡(100μL，1mg/mL，n＝6)，尾靜脈注射單純氧化鐵顆粒修飾的載有針對survivin的抗腫瘤siRNA微囊泡加外源磁場(100μL，1mg/mL，n＝6)，尾靜脈注射葉酸和氧化鐵納米顆粒雙修飾的載有針對survivin的抗腫瘤siRNA微囊泡(100μL，1mg/mL，n＝6)，尾靜脈注射葉酸和氧化鐵顆粒雙修飾的載藥微囊泡加外源性磁場(100μL，1mg/mL，n＝6)這7種治療方式處理，藥物注射每3天一次，共持續4次，同時每3天記錄裸鼠體重和腫瘤體積(寬*寬*長/2)。

3、最后，將裸鼠麻醉處死，獲取腫瘤組織，拍照并稱量腫瘤重量，并對獲取的腫瘤組織進行組織學分析(TUNEL細胞凋亡檢測，survivin、Ki-67等指標表達檢測)。

4、相較于其他組，上述載藥后腫瘤靶向遞送載體輔助外援磁場發揮了最優異的抗腫瘤生長效果，幾乎完全抑制了腫瘤的生長，而對裸鼠體重無明顯影響。腫瘤組織學分析發現上述載藥后腫瘤靶向遞送載體有效促進腫瘤細胞的凋亡，抑制其增殖。