本發(fā)明涉及細(xì)胞外基質(zhì)材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

I型糖尿病是一種自身免疫性疾病，它是由于機(jī)體免疫系統(tǒng)功能障礙，導(dǎo)致胰島β-細(xì)胞壞死，從而引起糖代謝功能障礙。盡管據(jù)International Diabetes Federation(IDF)統(tǒng)計(jì)，I型糖尿病患者僅占總糖尿病患者的10％，但I(xiàn)型糖尿病發(fā)病較早，多發(fā)于兒童及青少年，因此患病時(shí)間較長(zhǎng)，如血糖控制不當(dāng)會(huì)引發(fā)包括心臟、腎臟、肝臟、神經(jīng)及眼部等多重器官并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量并對(duì)社會(huì)及家庭造成巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，注射胰島素是主要的治療I型糖尿病的方法，該方法雖可以有效控制患者血糖，卻無(wú)法根治I型糖尿病，也無(wú)法對(duì)患者代謝功能紊亂等做出更為精準(zhǔn)的控制。另外，長(zhǎng)期服用胰島素也會(huì)造成體重增加，不利于進(jìn)行血糖檢測(cè)及對(duì)其他心血管并發(fā)癥的調(diào)控。

胰島移植可被認(rèn)為是治療I型糖尿病手段中最具有潛力的治愈性治療手段。自2000年Edmonton胰島移植方法成功使7名糖尿病患者實(shí)現(xiàn)100％脫離對(duì)胰島素的依賴后，胰島移植這一手段成為有可能完全治愈I型糖尿病最具潛力的途徑。但Edmonton protocol主要通過(guò)直接向肝臟門(mén)靜脈注射胰島的方法進(jìn)行胰島移植，隨后的臨床結(jié)果表明，在接受治療的糖尿病患者中，胰島移植術(shù)后，超過(guò)90％的患者在5年內(nèi)均病情復(fù)發(fā)，重新進(jìn)行胰島素治療。導(dǎo)致病情復(fù)發(fā)的主要原因在于移植后的胰島在患者體內(nèi)，因胰島移植位置、免疫反應(yīng)等諸多原因無(wú)法及時(shí)完成血運(yùn)重建，導(dǎo)致胰島流失加速，從而加大胰島移植手術(shù)在所需胰島數(shù)量上的要求。而胰島移植手術(shù)的另一個(gè)瓶頸恰恰是供體數(shù)量有限，因此造成惡性循環(huán)，使目前胰島移植無(wú)法前行。因此如何完善胰島移植手段，使胰島能夠更好的被納入接受移植患者的循環(huán)系統(tǒng)，從而解決胰島流失問(wèn)題，是現(xiàn)階段針對(duì)胰島移植研究的重點(diǎn)方向。

采用生物材料輔助胰島移植的相關(guān)研究也在近年來(lái)被廣泛關(guān)注。目前胰島移植所采用的生物材料眾多且各有優(yōu)缺，可大體分為包裹型材料和半包裹型材料兩大類。半包裹材料中的多孔支架類生物材料，能夠?yàn)橐葝u移植創(chuàng)造除傳統(tǒng)移植點(diǎn)之外的新移植部位，但無(wú)法從根本解決接受胰島移植患者免疫排斥等基本問(wèn)題。包裹型材料包括水凝膠、微膠囊等，因?yàn)檫@類材料可以將胰島完全包裹，因此能夠解決移植手術(shù)后患者機(jī)體對(duì)移植胰島的免疫排斥反應(yīng)，但也由于這類材料對(duì)胰島的完全包裹，不利于毛細(xì)血管的形成，因此在胰島移植后血運(yùn)重建等方面有所欠缺。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明目的在于提供一種磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜及其制備方法與應(yīng)用，以在模擬細(xì)胞外環(huán)境的同時(shí)，提高仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜的生物相容性；使其在包裹胰島細(xì)胞團(tuán)時(shí)，提高胰島細(xì)胞的活性，增強(qiáng)胰島細(xì)胞釋放胰島素的功能；而且，該制備方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)便。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

第一方面，本發(fā)明提供了一種仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜的制備方法，包括如下步驟：S1：將糖胺聚糖溶于磷酸鹽緩沖溶液中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和添加劑，得到混合液，再將混合液去除氧氣后活化；其中，添加劑為1-羥基苯并三氮唑或N-羥基丁二酰亞胺；S2：將磷脂溶于復(fù)配乳液中，然后加入到S1得到的產(chǎn)物中進(jìn)行反應(yīng)；其中，復(fù)配乳液包括水和有機(jī)溶劑；S3：將S2得到的產(chǎn)物干燥，得到仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜。需要說(shuō)明的是，S1中，將糖胺聚糖溶于磷酸鹽緩沖溶液，優(yōu)選將盛放糖胺聚糖和磷酸鹽緩沖溶液的反應(yīng)器中的氧氣去除，得到混合液后，也需要去除氧氣，因?yàn)榛旌弦褐械奈镔|(zhì)需要在無(wú)氧的條件下進(jìn)行活化。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，S1中，糖胺聚糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和添加劑的物質(zhì)的量比為1:1:(1～10)；S2中，磷脂和復(fù)配乳液的質(zhì)量比為1:(10～100)，復(fù)配乳液中，有機(jī)溶劑和水的體積比為1:(1～100)；糖胺聚糖和磷脂的質(zhì)量比為1:(1～100)。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，S1中：糖胺聚糖包括肝素、透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素中的一種或幾種，糖胺聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量為8000～14000；S2中：磷脂包括1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、L-磷脂酰乙醇胺、1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、1,2-二棕櫚酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇氨、1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺、膽固醇甲酰胺和花生四烯酰胺中的一種或幾種。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，S2中：有機(jī)溶劑包括乙醇、異丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲亞砜和二甲基甲酰胺中的一種或幾種；水為雙蒸水。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，S1中，將糖胺聚糖溶于磷酸鹽緩沖溶液中具體包括：將糖胺聚糖加入磷酸鹽緩沖溶液中，得到糖胺聚糖與磷酸鹽緩沖溶液的混合物，然后在0～37℃的條件下超聲10～30min；其中，超聲的功率為20～400W，磷酸鹽緩沖溶液的pH值為6.0～6.8，在糖胺聚糖與磷酸鹽緩沖溶液的混合物中，糖胺聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％～50％。需要說(shuō)明的是，超聲是為了使糖胺聚糖和磷酸鹽緩沖溶液充分溶解。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，S1中，活化的溫度為0～37℃，活化的時(shí)間為15～45min；S2中，反應(yīng)的溫度為0～100℃，反應(yīng)的時(shí)間為0.5～72h；S3中，干燥為冷凍干燥，冷凍干燥的溫度為-60℃～-80℃，冷凍干燥的時(shí)間為2～48h。需要說(shuō)明的是，冷凍干燥時(shí)，可以將S2得到的產(chǎn)物置于48孔板或96孔板，然后進(jìn)行冷凍干燥。

第二方面，本發(fā)明提供了上述的方法制備得到的仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜。

第三方面，本發(fā)明提供了一種熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜的制備方法，包括上述仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜的制備方法的所有步驟，并在S2中的反應(yīng)后，還包括步驟：在反應(yīng)后的產(chǎn)物中加入熒光物質(zhì)進(jìn)行避光反應(yīng)；其中，糖胺聚糖和熒光物質(zhì)的物質(zhì)的量比為1:1000，熒光物質(zhì)為5-FAM-乙二胺或AF488-N-羥基琥珀酰亞胺(即Alexa 488-N-羥基琥珀酰亞胺酯)，避光反應(yīng)的溫度為15～30℃，避光反應(yīng)的時(shí)間為15～60min。

第四方面，本發(fā)明提供了上述的方法制備得到的熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜。

第五方面，本發(fā)明提供了上述的仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜或熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜在制備胰島培養(yǎng)或胰島移植產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用的磷脂，在動(dòng)植物、細(xì)菌等微生物中是構(gòu)成其生物膜、核膜以及類脂膜的重要組成部分，能參與到各種生理活動(dòng)中。磷脂具有兩親分子結(jié)構(gòu)，含有磷酸根的極性端具有親水作用，而長(zhǎng)長(zhǎng)的碳?xì)浞菢O性鏈具有很強(qiáng)親脂性，在體液環(huán)境下，上述特性使得磷脂分子傾向于定向排列、組裝成為磷脂雙分子層，構(gòu)成熱力學(xué)穩(wěn)定的片層或組裝體結(jié)構(gòu)。這種生物膜骨架既能保持蛋白質(zhì)的鑲嵌和附著，也能夠幫助細(xì)胞通過(guò)磷脂雙分子層和外界進(jìn)行物質(zhì)和能量的交換。本發(fā)明采用的糖胺聚糖是細(xì)胞外基質(zhì)中的重要成分，帶有大量的負(fù)電荷從而具有很強(qiáng)的親水性，對(duì)保持疏松結(jié)締組織中的水分有重要意義；糖胺聚糖是多價(jià)陰離子，對(duì)K、Na、Ca、Mg等離子有較大的親和力，因此能調(diào)節(jié)這些離子在組織中的分布；糖胺聚糖有很大的粘滯性，附在關(guān)節(jié)面上具有潤(rùn)滑和保護(hù)作用，有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的作用。并且，糖胺聚糖具有較高的抗凝血活性，將抗凝生物活性物質(zhì)通過(guò)適當(dāng)方式固定于材料表面，制備負(fù)載生物活性物質(zhì)的抗凝血材料，可以利用材料表面生物活性物質(zhì)和血液的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)所需的抗凝血功能，從而可以作為植入型生物醫(yī)用材料。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案，具有以下的優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明利用磷脂的生理活性以及對(duì)細(xì)胞膜具有熱力學(xué)親和作用，且利用糖胺聚糖(天然聚陰離子的多糖)具有的抗凝血活性，采用磷脂修飾糖胺聚糖，制備出磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜。在磷脂和糖胺聚糖的親疏水相互作用力的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行層層組裝，利用不同磷脂疏水分子鏈的長(zhǎng)度能夠?qū)崿F(xiàn)在分子水平上控制膜的組成，從而控制納米膜結(jié)構(gòu)，由于磷脂在細(xì)胞膜的滯留能力，在細(xì)胞膜表面能夠形成類似磷脂雙分子層的結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞膜表面組裝的厚度以及與細(xì)胞膜融合速度、滯留時(shí)間的精確控制。(2)本發(fā)明所用的材料均為FDA已經(jīng)認(rèn)證的醫(yī)用材料，提供的磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜具有很強(qiáng)的細(xì)胞親和性和生物相容性，能夠促進(jìn)細(xì)胞的附著和保證細(xì)胞活力，能夠?yàn)橐葝u細(xì)胞提供更接近活體細(xì)胞外基質(zhì)的生存環(huán)境，緊密結(jié)合胰島細(xì)胞的表面，微創(chuàng)即可注入活體，并能提供微量元素的攝取；該磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜與細(xì)胞外基質(zhì)成分類似，仿生效果大大優(yōu)于現(xiàn)有胰島移植材料，從而能夠成為最為理想的細(xì)胞和組織培養(yǎng)生物材料。(3)將胰島細(xì)胞團(tuán)包裹在本發(fā)明提供的熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜中，通過(guò)在膜表面連接的小分子熒光基團(tuán)，可清晰看到該納米膜在胰島細(xì)胞表面的組裝結(jié)構(gòu)。(4)通過(guò)死活染色的測(cè)定方法，可以發(fā)現(xiàn)，胰島細(xì)胞包裹在本發(fā)明提供的磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜中，14天后存活率接近100％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中的培養(yǎng)支架，通過(guò)倒置熒光顯微鏡可以看見(jiàn)胰島細(xì)胞呈現(xiàn)周?chē)芑M織；胰島素釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胰島細(xì)胞釋放胰島素功能明顯增強(qiáng)，細(xì)胞活力大幅提高。(5)本發(fā)明提供的磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜通過(guò)結(jié)合糖胺聚糖等具有生物活性的因子，生物化學(xué)性能穩(wěn)定，可以促進(jìn)移植后胰島在體內(nèi)的血管化，改善胰島移植后胰島的功能及存活性，有效降低炎癥環(huán)境中胰島細(xì)胞死亡率，并緩解血液介導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)，可提高臨床胰島移植效率。(6)本發(fā)明提供的磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜的制備方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)便，易于工業(yè)化，制備得到的磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜可以應(yīng)用于制備胰島培養(yǎng)支架或胰島細(xì)胞培養(yǎng)基的添加劑等。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中的熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜的反應(yīng)過(guò)程示意圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中的經(jīng)熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜包裹的胰島和未被包裹的胰島的熒光顯微鏡圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中的經(jīng)熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜包裹的胰島和未被包裹的胰島的細(xì)胞死亡率比較圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例中的經(jīng)熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜包裹的胰島和未被包裹的胰島在高糖刺激下胰島素釋放能力比較圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例中的經(jīng)熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜包裹的胰島和未被包裹的胰島的凝血時(shí)間比較圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例中的經(jīng)熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜包裹的胰島和未被包裹的胰島在炎癥環(huán)境下細(xì)胞死亡率比較圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。

以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值或平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

本發(fā)明提供一種仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜的制備方法，包括如下步驟：

S1：將糖胺聚糖溶于磷酸鹽緩沖溶液中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和添加劑，得到混合液，再將混合液去除氧氣后活化；其中，添加劑為1-羥基苯并三氮唑或N-羥基丁二酰亞胺；

優(yōu)選地，糖胺聚糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和添加劑的物質(zhì)的量比為1:1:(1～10)；糖胺聚糖包括肝素、透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素中的一種或幾種，糖胺聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量為8000～14000；將糖胺聚糖溶于磷酸鹽緩沖溶液中具體包括：將糖胺聚糖加入磷酸鹽緩沖溶液中，得到糖胺聚糖與磷酸鹽緩沖溶液的混合物，然后在0～37℃的條件下超聲10～30min；其中，超聲的功率為20～400W，磷酸鹽緩沖溶液的pH值為6.0～6.8，在糖胺聚糖與磷酸鹽緩沖溶液的混合物中，糖胺聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％～50％；活化的溫度為0～37℃，活化的時(shí)間為15～45min。

S2：將磷脂溶于復(fù)配乳液中，然后加入到S1得到的產(chǎn)物中進(jìn)行反應(yīng)；其中，復(fù)配乳液包括水和有機(jī)溶劑；

優(yōu)選地，磷脂和復(fù)配乳液的質(zhì)量比為1:(10～100)，復(fù)配乳液中，有機(jī)溶劑和水的體積比為1:(1～100)；糖胺聚糖和磷脂的質(zhì)量比為1:(1～100)；磷脂包括1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、L-磷脂酰乙醇胺、1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、1,2-二棕櫚酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇氨、1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺、膽固醇甲酰胺和花生四烯酰胺中的一種或幾種。有機(jī)溶劑包括乙醇、異丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲亞砜和二甲基甲酰胺中的一種或幾種；水為雙蒸水；反應(yīng)的溫度為0～100℃，反應(yīng)的時(shí)間為0.5～72h。

S3：將S2得到的產(chǎn)物干燥，得到仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜。

優(yōu)選地，干燥為冷凍干燥，冷凍干燥的溫度為-60℃～-80℃，冷凍干燥的時(shí)間為2～48h。

另外，本發(fā)明提供一種熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜的制備方法，包括如下步驟：

S1：將糖胺聚糖溶于磷酸鹽緩沖溶液中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和添加劑，得到混合液，再將混合液去除氧氣后活化；其中，添加劑為1-羥基苯并三氮唑或N-羥基丁二酰亞胺；

優(yōu)選地，糖胺聚糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和添加劑的物質(zhì)的量比為1:1:(1～10)；糖胺聚糖包括肝素、透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素中的一種或幾種，糖胺聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量為8000～14000；將糖胺聚糖溶于磷酸鹽緩沖溶液中具體包括：將糖胺聚糖加入磷酸鹽緩沖溶液中，得到糖胺聚糖與磷酸鹽緩沖溶液的混合物，然后在0～37℃的條件下超聲10～30min；其中，超聲的功率為20～400W，磷酸鹽緩沖溶液的pH值為6.0～6.8，在糖胺聚糖與磷酸鹽緩沖溶液的混合物中，糖胺聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％～50％；活化的溫度為0～37℃，活化的時(shí)間為15～45min。

S2：將磷脂溶于復(fù)配乳液中，然后加入到S1得到的產(chǎn)物中進(jìn)行反應(yīng)；在反應(yīng)后的產(chǎn)物中加入熒光物質(zhì)進(jìn)行避光反應(yīng)；其中，復(fù)配乳液包括水和有機(jī)溶劑；糖胺聚糖和熒光物質(zhì)的物質(zhì)的量比為1:1000，熒光物質(zhì)為5-FAM-乙二胺或AF488-N-羥基琥珀酰亞胺，避光反應(yīng)的溫度為15～30℃，避光反應(yīng)的時(shí)間為15～60min。

優(yōu)選地，磷脂和復(fù)配乳液的質(zhì)量比為1:(10～100)，復(fù)配乳液中，有機(jī)溶劑和水的體積比為1:(1～100)；糖胺聚糖和磷脂的質(zhì)量比為1:(1～100)；磷脂包括1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、L-磷脂酰乙醇胺、1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、1,2-二棕櫚酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇氨、1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺、膽固醇甲酰胺和花生四烯酰胺中的一種或幾種。有機(jī)溶劑包括乙醇、異丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲亞砜和二甲基甲酰胺中的一種或幾種；水為雙蒸水；反應(yīng)的溫度為0～100℃，反應(yīng)的時(shí)間為0.5～72h。

S3：將S2得到的產(chǎn)物干燥，得到熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜。

優(yōu)選地，干燥為冷凍干燥，冷凍干燥的溫度為-60℃～-80℃，冷凍干燥的時(shí)間為2～48h。

需要說(shuō)明的是，5-FAM-乙二胺和AF488-N-羥基琥珀酰亞胺的分子結(jié)構(gòu)式分別為：具體的熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜的反應(yīng)過(guò)程示意圖如圖1所示。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜及其制備方法和熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜及其制備方法作進(jìn)一步說(shuō)明。需要說(shuō)明的是，實(shí)施一至實(shí)施例四中的肝素的質(zhì)量，可以是微克級(jí)別，也可以是千克級(jí)別，實(shí)施例的效果相同。

實(shí)施例一

本實(shí)施例提供的是仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜及其制備方法，制備過(guò)程包括：

S1：將相對(duì)分子質(zhì)量為12000的肝素溶于pH值為6.4的磷酸鹽緩沖溶液中，得到肝素與磷酸鹽緩沖溶液的混合物，其中，在肝素與磷酸鹽緩沖溶液的混合物中，肝素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％。將肝素與磷酸鹽緩沖溶液的混合物在25℃的條件下超聲20min，超聲的功率為200W，并去除反應(yīng)容器內(nèi)的氧氣，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和1-羥基苯并三氮唑，得到混合液，將混合液去除氧氣，在25℃條件下活化30min，其中，肝素、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和1-羥基苯并三氮唑的物質(zhì)的量比為1:1:5。

S2：將雙蒸水和有機(jī)溶劑配制成復(fù)配乳液，其中有機(jī)溶劑和水的體積比為1:50，有機(jī)溶劑為乙醇、異丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲亞砜和二甲基甲酰胺的混合液體。將1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺溶解于復(fù)配乳液中，然后加入到S1得到的產(chǎn)物中，在50℃條件下反應(yīng)36h，其中，1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺和復(fù)配乳液的質(zhì)量比為1:55，并且肝素和1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺的質(zhì)量比為1:50。

S3：將S2得到的產(chǎn)物在-80℃冷凍干燥48h，得到仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜，其化學(xué)分子結(jié)構(gòu)式如分子結(jié)構(gòu)式一所示：

分子結(jié)構(gòu)式一：1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-肝素

實(shí)施例二

本實(shí)施例提供的是仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜及其制備方法，制備過(guò)程包括：

S1：將相對(duì)分子質(zhì)量為8000的透明質(zhì)酸溶于pH值為6.0的磷酸鹽緩沖溶液中，得到透明質(zhì)酸與磷酸鹽緩沖溶液的混合物，其中，在透明質(zhì)酸與磷酸鹽緩沖溶液的混合物中，透明質(zhì)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％。將透明質(zhì)酸與磷酸鹽緩沖溶液的混合物在5℃的條件下超聲10min，超聲的功率為400W，并去除反應(yīng)容器內(nèi)的氧氣，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和1-羥基苯并三氮唑，得到混合液，將混合液去除氧氣，在5℃條件下活化15min，其中，透明質(zhì)酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和1-羥基苯并三氮唑的物質(zhì)的量比為1:1:1。

S2：將雙蒸水和有機(jī)溶劑配制成復(fù)配乳液，其中有機(jī)溶劑和水的體積比為1:1，有機(jī)溶劑為乙醇、異丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲亞砜和二甲基甲酰胺的混合液體。將1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺溶解于復(fù)配乳液中，然后加入到S1得到的產(chǎn)物中，在5℃條件下反應(yīng)0.5h，其中，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺和復(fù)配乳液的質(zhì)量比為1:10，并且透明質(zhì)酸和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺的質(zhì)量比為1:1。

S3：將S2得到的產(chǎn)物在-80℃冷凍干燥48h，得到仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜，其化學(xué)分子結(jié)構(gòu)式如分子結(jié)構(gòu)式二所示：

分子結(jié)構(gòu)式二：1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-透明質(zhì)酸

實(shí)施例三

本實(shí)施例提供的是仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜及其制備方法，制備過(guò)程包括：

S1：將相對(duì)分子質(zhì)量為14000的硫酸軟骨素溶于pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液中，得到硫酸軟骨素與磷酸鹽緩沖溶液的混合物，其中，在硫酸軟骨素與磷酸鹽緩沖溶液的混合物中，硫酸軟骨素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％。將硫酸軟骨素與磷酸鹽緩沖溶液的混合物在37℃的條件下超聲30min，超聲的功率為20W，并去除反應(yīng)容器內(nèi)的氧氣，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和1-羥基苯并三氮唑，得到混合液，將混合液去除氧氣，在37℃條件下活化45min，其中，硫酸軟骨素、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和1-羥基苯并三氮唑的物質(zhì)的量比為1:1:10。

S2：將雙蒸水和有機(jī)溶劑配制成復(fù)配乳液，其中有機(jī)溶劑和水的體積比為1:100，有機(jī)溶劑為乙醇、異丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲亞砜和二甲基甲酰胺的混合液體。將1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺溶解于復(fù)配乳液中，然后加入到S1得到的產(chǎn)物中，在100℃條件下反應(yīng)72h，其中，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺和復(fù)配乳液的質(zhì)量比為1:100，并且硫酸軟骨素和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺的質(zhì)量比為1:100。

S3：將S2得到的產(chǎn)物在-80℃冷凍干燥48h，得到仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜，其化學(xué)分子結(jié)構(gòu)式如分子結(jié)構(gòu)式三所示：

分子結(jié)構(gòu)式三：1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-硫酸軟骨素

實(shí)施例四

本實(shí)施例提供的是熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜(1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-肝素)及其制備方法，制備過(guò)程包括：

S1：將相對(duì)分子質(zhì)量為12000的肝素溶于pH值為6.4的磷酸鹽緩沖溶液中，得到肝素與磷酸鹽緩沖溶液的混合物，其中，在肝素與磷酸鹽緩沖溶液的混合物中，肝素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％。將肝素與磷酸鹽緩沖溶液的混合物在25℃的條件下超聲20min，超聲的功率為200W，并去除反應(yīng)容器內(nèi)的氧氣，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和1-羥基苯并三氮唑，得到混合液，將混合液去除氧氣，在0～37℃條件下活化30min，其中，肝素、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和1-羥基苯并三氮唑的物質(zhì)的量比為1:1:5。

S2：將雙蒸水和有機(jī)溶劑配制成復(fù)配乳液，其中有機(jī)溶劑和水的體積比為1:50，有機(jī)溶劑為乙醇、異丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲亞砜和二甲基甲酰胺的混合液體。將1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺溶解于復(fù)配乳液中，然后加入到S1得到的產(chǎn)物中，在50℃條件下反應(yīng)36h，其中，1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺和復(fù)配乳液的質(zhì)量比為1:55，并且肝素和1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺的質(zhì)量比為1:50。

在反應(yīng)后的產(chǎn)物中加入5-FAM-乙二胺，肝素和5-FAM-乙二胺的物質(zhì)的量比為1:1000，在20℃的條件下避光反應(yīng)30min。

S3：將S2得到的產(chǎn)物在-80℃冷凍干燥48h，得到熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜。

將本發(fā)明實(shí)施例一制備得到的仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜和實(shí)施例四制備得到的熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜，通過(guò)功能學(xué)試驗(yàn)來(lái)系統(tǒng)評(píng)價(jià)。

1、胰島的形態(tài)變化

試驗(yàn)方法：通過(guò)膽管灌注膠原酶的方法，經(jīng)Histopaque分離獲取成年雄性ICR小鼠胰島(每個(gè)胰島包含3000～5000個(gè)胰島細(xì)胞)，隨機(jī)分為A組和B組，A組的胰島用實(shí)施例四制備得到的熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜進(jìn)行包裹，使熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜均勻附著于胰島表面，B組的胰島不進(jìn)行包裹，作為對(duì)照組。利用倒置熒光顯微鏡分別觀察A組(包裹組)和B組(對(duì)照組)的細(xì)胞形態(tài)。

試驗(yàn)結(jié)果：具體結(jié)果如圖2所示。由于熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜中結(jié)合了熒光分子FAM，因此經(jīng)熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜包裹的胰島圖層(左上)可在熒光顯微鏡下觀察得到(光亮部分)，且包裹后的胰島體積較對(duì)照組未有明顯改變，因此不會(huì)影響胰島的營(yíng)養(yǎng)及氧氣等供應(yīng)，有利于胰島活力保存。

2、胰島細(xì)胞死亡比例測(cè)定

試驗(yàn)方法：通過(guò)膽管灌注膠原酶的方法，經(jīng)Histopaque分離獲取成年雄性ICR小鼠胰島(每個(gè)胰島包含3000～5000個(gè)胰島細(xì)胞)，隨機(jī)分為A1組、A2組和B組，A1組和A2組的胰島用實(shí)施例一制備得到的仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜進(jìn)行包裹，使仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜均勻附著于胰島表面，B組的胰島不進(jìn)行包裹，作為對(duì)照組。將A1組、A2組和B組的胰島在體外培育環(huán)境(37℃，95％氧氣/5％二氧化碳，RPMI1640培養(yǎng)基)中，保存14天后，使用死活熒光染色方法(利用BioVision Life/Dead staining試劑盒)分別對(duì)A1組、A2組和B組的胰島進(jìn)行標(biāo)記，即使用可穿透細(xì)胞膜的小分子綠色熒光染料標(biāo)記活細(xì)胞，同時(shí)使用無(wú)法穿透細(xì)胞膜的紅色熒光染料PI標(biāo)記死亡細(xì)胞，然后通過(guò)對(duì)A1組、A2組和B組的每個(gè)胰島中紅色的細(xì)胞進(jìn)行定量分析，來(lái)確認(rèn)A1組、A2組和B組的每個(gè)胰島內(nèi)的細(xì)胞的存活和死亡比例；其中，A1組中仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜中對(duì)應(yīng)的原料肝素在RPMI1640培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度為5mg/mL，A2組中仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜中對(duì)應(yīng)的原料肝素在RPMI1640培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度為10mg/mL。

試驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果如圖3所示，通過(guò)使用死活熒光染色方法發(fā)現(xiàn)，保存14天后，A1組的被仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜包裹的胰島平均死亡細(xì)胞數(shù)僅為6.5±1.062個(gè)，A2組的被仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜包裹的胰島平均死亡細(xì)胞數(shù)僅為3.273±0.5271個(gè)，而B(niǎo)組不被包裹的胰島平均死亡細(xì)胞數(shù)僅為12.55±1.856個(gè)，A2組的胰島細(xì)胞死亡率大約為B組的胰島細(xì)胞死亡率的26％，由此說(shuō)明了，采用本發(fā)明提供的仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜，可以大大降低胰島細(xì)胞的死亡率，提高其存活率。經(jīng)推測(cè)，可能是由于仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜中的糖胺聚糖成分可促進(jìn)胰島內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)的保存，從而保證胰島內(nèi)部細(xì)胞的養(yǎng)分供給。從我們的試驗(yàn)中也觀察到，隨著仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜中對(duì)應(yīng)的原料肝素在RPMI1640培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度的增加(由5mg/mL到10mg/mL)，胰島細(xì)胞存活也有所提升。說(shuō)明該仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜可用于胰島表面修飾及包裹，并有利于胰島培養(yǎng)及存活。

3、胰島功能及活性的測(cè)定

試驗(yàn)方法：通過(guò)膽管灌注膠原酶的方法，經(jīng)Histopaque分離獲取成年雄性ICR小鼠胰島(每個(gè)胰島包含3000～5000個(gè)胰島細(xì)胞)，隨機(jī)分為A1組、A2組和B組，A1組和A2組的胰島用實(shí)施例一制備得到的仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜進(jìn)行包裹，使仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜均勻附著于胰島表面，B組的胰島不進(jìn)行包裹，作為對(duì)照組。將A1組、A2組和B組的胰島在體外培育環(huán)境(37℃，95％氧氣/5％二氧化碳，RPMI1640培養(yǎng)基)中，保存14天后，對(duì)A1組、A2組和B組的胰島分別進(jìn)行高糖刺激，即分別在A1組、A2組和B組的胰島中加入2mmol/L或20mmol/L的高濃度葡萄糖溶液，刺激半小時(shí)后收集上清，并分別檢測(cè)上清中胰島素的含量，以測(cè)定不同組的胰島在高糖刺激下胰島素釋放的能力，用于評(píng)價(jià)胰島功能及活性；其中，A1組中仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜中對(duì)應(yīng)的原料肝素在RPMI1640培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度為5mg/mL，A2組中仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜中對(duì)應(yīng)的原料肝素在RPMI1640培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度為10mg/mL。

試驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)胰島細(xì)胞釋放胰島素功能未受影響，表明本發(fā)明提供的仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜有利于對(duì)胰島活力以及功能的保存，且很安全。

4、凝血試驗(yàn)

試驗(yàn)方法：通過(guò)膽管灌注膠原酶的方法，經(jīng)Histopaque分離獲取成年雄性ICR小鼠胰島(每個(gè)胰島包含3000～5000個(gè)胰島細(xì)胞)，隨機(jī)分為A組和B組，A組的胰島用實(shí)施例一制備得到的仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜進(jìn)行包裹，使仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜均勻附著于胰島表面，B組的胰島不進(jìn)行包裹，作為對(duì)照組。將A組和B組的胰島在體外培育環(huán)境(37℃，95％氧氣/5％二氧化碳，RPMI1640培養(yǎng)基)中，保存14天后，將A組(包裹組)和B組(對(duì)照組)的胰島分別置于糖尿病患者的全血樣本中，使用臨床APPT儀器檢測(cè)不同組的胰島注入血液后的凝血時(shí)間。

試驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果如圖5所示，A組的被仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜包裹的胰島的平均凝血時(shí)間為125.5±0.1764秒，而B(niǎo)組不被包裹的胰島的平均凝血時(shí)間為29.33±0.1764秒，A組(包裹組)vs.B組(對(duì)照組)的P<0.001，即對(duì)于A組的被仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜包裹的胰島而言，凝血時(shí)間較B組不被包裹的胰島延長(zhǎng)4倍。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明由于抗凝因子糖胺聚糖的存在，A組的被仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜包裹的胰島還表現(xiàn)出顯著的抗凝功效，可有效降低移植時(shí)常見(jiàn)的瞬間血液引發(fā)的免疫效應(yīng)，從而保護(hù)移植后胰島的存活。

5、炎癥環(huán)境下胰島存活試驗(yàn)

試驗(yàn)方法：通過(guò)膽管灌注膠原酶的方法，經(jīng)Histopaque分離獲取成年雄性ICR小鼠胰島(每個(gè)胰島包含3000～5000個(gè)胰島細(xì)胞)，隨機(jī)分為A組和B組，A組的胰島用實(shí)施例一制備得到的仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜進(jìn)行包裹，使仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜均勻附著于胰島表面，B組的胰島不進(jìn)行包裹，作為對(duì)照組。將A組(肝素化材料組)和B組(對(duì)照組)的胰島在體外培育環(huán)境(37℃，95％氧氣/5％二氧化碳，RPMI1640培養(yǎng)基)中，保存14天后，分別在將A組和B組的胰島的培養(yǎng)基中加入促炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF-alpH值a)和細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)炎癥并引發(fā)細(xì)胞死亡。然后利用Annexin V和PI兩種熒光分子對(duì)凋亡及死亡細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后，使用流式細(xì)胞熒光定量?jī)x對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算出不同組的胰島的細(xì)胞死亡率。

試驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果如圖6所示，在促炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF-alpH值a)和細(xì)菌脂多糖(LPS)環(huán)境中，A組的被仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜包裹的胰島的平均死亡率為52.4±2.4％，而B(niǎo)組不被包裹的胰島的平均死亡率為66.74±1.49％，A組(肝素化材料組)vs.B組(對(duì)照組)的P<0.05。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在炎癥誘導(dǎo)下，被仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜包裹的胰島的細(xì)胞死亡率有所降低，這顯示了仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜對(duì)于機(jī)體或體外炎癥環(huán)境中的胰島的存活具有保護(hù)作用。

血液介導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)(Instant blood-mediated inflammatory response)是臨床中胰島移植/細(xì)胞治療/器官移植的一大難題，具體表現(xiàn)為凝血造成的急性血栓、炎癥引發(fā)的細(xì)胞死亡等，危害患者健康。而本發(fā)明提供的仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜，可用于胰島表面功能修飾，從而提高胰島存活、保存胰島功能并提高臨床胰島移植手術(shù)中，可以減少血液介導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)引發(fā)的胰島流失，從而提高該手術(shù)的成功率和患者生活品質(zhì)。

需要說(shuō)明的是，除了上述實(shí)施例一至實(shí)施例四列舉的情況，選用其他的原料配比和制備方法參數(shù)也是可行的。在S1中：超聲的溫度優(yōu)選為5～30℃，超聲功率優(yōu)選為150～250W，在糖胺聚糖與磷酸鹽緩沖溶液的混合物中，糖胺聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)優(yōu)選為25％～35％；活化的溫度優(yōu)選為5～30℃；在S2中：磷脂和復(fù)配乳液的質(zhì)量比優(yōu)選為1:(45～60)，復(fù)配乳液中，有機(jī)溶劑和水的體積比優(yōu)選為1:(40～60)，糖胺聚糖和磷脂的質(zhì)量比優(yōu)選為1:(40～60)，反應(yīng)的溫度優(yōu)選為40～60℃，反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為30～50h；在S3中：冷凍干燥的溫度優(yōu)選為-70℃～-80℃，冷凍干燥的時(shí)間優(yōu)選為36～48h。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案，具有以下的優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明利用磷脂的生理活性以及對(duì)細(xì)胞膜具有熱力學(xué)親和作用，且利用糖胺聚糖(天然聚陰離子的多糖)具有的抗凝血活性，采用磷脂修飾糖胺聚糖，制備出磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜。在磷脂和糖胺聚糖的親疏水相互作用力的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行層層組裝，能夠?qū)崿F(xiàn)在分子水平上控制膜的組成、結(jié)構(gòu)和厚度的精確控制。(2)本發(fā)明所用的材料均為FDA已經(jīng)認(rèn)證的醫(yī)用材料，提供的磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜具有很強(qiáng)的細(xì)胞親和性和生物相容性，能夠促進(jìn)細(xì)胞的附著和保證細(xì)胞活力，能夠?yàn)橐葝u細(xì)胞提供更接近活體細(xì)胞外基質(zhì)的生存環(huán)境，緊密結(jié)合胰島細(xì)胞的表面，微創(chuàng)即可注入活體，并能提供微量元素的攝取；該磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜與細(xì)胞外基質(zhì)成分類似，仿生效果大大優(yōu)于現(xiàn)有胰島移植材料，從而能夠成為最為理想的細(xì)胞和組織培養(yǎng)生物材料。(3)將胰島細(xì)胞團(tuán)包裹在本發(fā)明提供的熒光仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜中，通過(guò)在膜表面連接的小分子熒光基團(tuán)，可清晰看到該納米膜在胰島細(xì)胞表面的組裝結(jié)構(gòu)。(4)通過(guò)死活染色的測(cè)定方法，可以發(fā)現(xiàn)，胰島細(xì)胞包裹在本發(fā)明提供的磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜中，14天后存活率接近100％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中的培養(yǎng)支架，通過(guò)倒置熒光顯微鏡可以看見(jiàn)胰島細(xì)胞呈現(xiàn)周?chē)芑M織；胰島素釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胰島細(xì)胞釋放胰島素功能明顯增強(qiáng)，細(xì)胞活力大幅提高。(5)本發(fā)明提供的磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜通過(guò)結(jié)合糖胺聚糖等具有生物活性的因子，生物化學(xué)性能穩(wěn)定，可以促進(jìn)移植后胰島在體內(nèi)的血管化，改善胰島移植后胰島的功能及存活性，有效降低炎癥環(huán)境中胰島細(xì)胞死亡率，并緩解血液介導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)，可提高臨床胰島移植效率。(6)本發(fā)明提供的磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜的制備方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)便，易于工業(yè)化，制備得到的磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜可以應(yīng)用于制備胰島培養(yǎng)支架或胰島細(xì)胞培養(yǎng)基的添加劑等；而現(xiàn)有技術(shù)中，胰島移植使用的海藻酸鈉在制備過(guò)程中，由于制備條件及原材料差異，批次間有較大差異，對(duì)胰島移植術(shù)后胰島及接受胰島移植患者體內(nèi)條件均有不同程度的影響；本發(fā)明提供的磷脂-糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)納米膜可以有效克服這些缺點(diǎn)。

在本說(shuō)明書(shū)的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書(shū)中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說(shuō)明書(shū)中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型，而并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求和說(shuō)明書(shū)的范圍當(dāng)中。