本發明涉及一種體內止血敷料的制備方法，特別涉及一種以谷氨酰胺轉移酶為交聯劑的體內止血敷料的制備方法，屬于生物醫用材料領域。

背景技術：

膠原蛋白是一種高分子蛋白，一般呈白色、不透明的纖維狀。它是生物體組成結構的主要成分之一，廣泛地分布于動物的皮膚、骨骼和肌肉組織內。膠原具有止血性能，一方面可加強血小板的黏附和聚集形成血栓，阻止血液流出。另一方面，通過激活和誘導各種凝血因子還可啟動內源性的凝血途徑。但是膠原蛋白多來源于動物皮、筋腱等，可加工性差，在提取過程中會使蛋白部分生物活性喪失，而且其對人體而言屬于一種異源物，可引起過敏等不良反應，應用于人體非常容易產生排異反應。因此需要尋找一種制備簡單、安全性高的膠原蛋白作為原料。

谷氨酰胺轉移酶是人體組織中本來就含有的一種酶，可與膠原蛋白發生交聯反應，谷氨酰胺轉移酶以肽鍵中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基作為?；墓w，以多肽鏈中賴氨酰殘基于氨基作為酰基的受體，形成蛋白質分子內和分子間的ε-γ（-谷氨酰）賴氨酸異肽鍵。熱交聯是在真空條件下加熱，使膠原分子嚴重脫水，自由羧基和羥基發生酯化反應以及羧基與氨基之間發生酰胺反應，從而改善止血敷料的機械性能，而且還可以保持止血敷料的內部孔狀結構不變，使孔隙均勻完整。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種使用安全、可吸收、止血效果好的體內止血敷料的制備方法。

本發明的實現過程如下：

一種體內止血敷料的制備方法：以類人膠原蛋白為原料，加入注射用水攪拌溶解后，向類人膠原蛋白溶液中加入谷氨酰胺轉氨酶進行交聯后，通過控制降溫速率為4-8 ℃/min進行降溫預凍，真空冷凍干燥，Co60照射滅菌后得到體內止血敷料。

上述的類人膠原蛋白為使用基因重組大腸桿菌高密度發酵生產的一種人源型膠原蛋白。

上述的類人膠原蛋白加入注射用水后的質量濃度為1%-5%；谷氨酰胺轉氨酶與類人膠原蛋白的比例為4-8U/g。

具體來說，上述的體內止血敷料的制備方法，包括如下步驟：

（1）將類人膠原蛋白溶解于注射用水中，使溶液中類人膠原蛋白的質量濃度為1%-5%；

（2）將溶液移入一次性無菌培養皿或模具中，每皿或每模具7-15 mL；

（3）加入谷氨酰胺轉氨酶，谷氨酰胺轉氨酶與類人膠原蛋白的比例為4-8U/g，反應溫度為-4-0℃，交聯時間為24-48小時；

（4）預凍過程中，降溫速率控制為4-8 ℃/min；

（5）樣品凍干處理24-72 h，凍干好的樣品Co60照射滅菌10-30 h。

本發明具有以下優點：

（1）本發明所涉及的膠原蛋白為基因工程菌高密度發酵的人源性膠原蛋白，它從根本上解決了動物提取膠原蛋白的水不溶性和病毒隱患等問題，具有生物相容性好、促細胞生長、無病毒隱患和免疫排異反應低等優點，提高了體內止血敷料的安全性；

（2）本發明采用酶法交聯，具體使用谷氨酰胺轉氨酶交聯膠原蛋白制備體內止血敷料，可以改善止血敷料的機械強度，提高止血效果，而且谷氨酰胺轉移酶是人體組織中本身就含有的一種酶，其安全無毒，制備的止血敷料應用于臨床時保證了其良好的生物安全性；

（3）本發明所制備的體內止血敷料合成工藝簡單易實現，產品質量穩定、安全性高，工藝易放大且重現性能好，在醫用生物材料與組織工程等相關領域有著良好的應用前景。

附圖說明

圖1為體內止血敷料的外觀圖；

圖2為體內止血敷料的SEM圖；

圖3為體內止血敷料兔耳止血效果圖；

圖4為體內止血敷料兔肝臟止血效果圖；

圖5為體內止血敷料細胞毒性實驗圖；

圖6 為體內止血敷料皮下植入圖。

具體實施方式

本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合，本領域普通技術人員通過閱讀本發明說明書而對本發明技術方案采取的任何等效的變換，均為本發明的權利要求所涵蓋。

一種體內止血敷料的制備方法，包括如下步驟：

（1）將類人膠原蛋白溶解于注射用水中，攪拌使其完全溶解，使溶液中類人膠原蛋白的質量濃度為1%-5%，所述的類人膠原蛋白為使用基因重組大腸桿菌高密度發酵生產的一種人源型膠原蛋白；

（2）將溶液移入一次性無菌培養皿或模具中，每皿或每模具7-15 mL；

（3）加入谷氨酰胺轉氨酶，加入谷氨酰胺轉氨酶與類人膠原蛋白的比例為4-8U/g，反應溫度為-4-0℃，交聯時間為24-48小時；

（4）使用程序冷凍儀預凍過程中控制降溫速率為4—8℃/min進行精確降溫，一直降至-40—-80℃；

（5）在真空冷凍干燥機中凍干樣品24-72 h；

（6）凍干好的樣品通過輻照滅菌10-30 h。

本發明采用類人膠原蛋白為主要原料制備體內止血敷料，現有方法多采用超低溫冰箱直接預凍，蛋白溶液直接置于低溫，其中的液滴來不及反應而導致形成的冰晶雜亂無章，大小不一，在凍干時，冰晶升華而形成眾多不均勻的孔，得到的體內止血敷料表面凹凸不平，邊緣不整，機械強度差，止血功效低。而本發明中的預凍方法為按照設定的降溫規律進行程序冷凍，冰晶的形成比較規律，當溫度下降到一定程度時，首先形成許多晶核，隨著溫度繼續下降，周圍小液滴吸附到這些晶核表面后結晶，由于溫度下降的速度恒定且一致，所有晶核的生長速率非常接近，最終形成形狀大小接近的冰晶，凍干后得到大小接近的孔徑，得到的體內止血敷料表面平整，孔徑均一，機械強度大，在止血過程中不易被血流沖破而導致二次出血，大大提高了海綿的止血效果。

此外，對程序冷凍儀的降溫速率進行深入的研究，如果降溫速率大于10oC/min，溫度跳躍就會比較大，其冰晶的形成必然受到一定的影響，如果降溫速率小于3oC/min，富集在晶核上的液滴不能被快速的冷凍而有流動的可能，這樣所有的晶體大小形狀也都不規則。本發明的研究降溫速率控制在4-8℃/min，得到的材料物化性能和止血效果最佳。

實施例1

將類人膠原蛋白溶解于注射用水中，溶解后，加入谷氨酰胺轉移酶，攪拌使其完全溶解，使混合溶液中的類人膠原蛋白的質量濃度為2.0%，谷氨酰胺轉移酶的質量為4U每克蛋白，置于-4℃冰箱交聯反應24 h，于程序冷凍儀中以-4℃/min的速度凍至-80℃，并保持2 h，迅速轉移至真空冷凍干燥機中凍干24 h，取出封裝進行Co60輻照滅菌24 h，獲得體內止血敷料。制備的海綿孔隙率為92%，吸水率為1500%。

實施例2

將類人膠原蛋白溶解于注射用水中，溶解后，加入谷氨酰胺轉移酶，攪拌使其完全溶解，使混合溶液中的類人膠原蛋白的質量濃度為2.5%，谷氨酰胺轉移酶的質量為4U每克蛋白，置于-4℃冰箱交聯反應30 h，于程序冷凍儀中以-4℃/min的速度凍至-80℃，并保持2 h，迅速轉移至真空冷凍干燥機中凍干30 h，取出封裝進行Co60輻照滅菌24 h，獲得體內止血敷料。

實施例3

將類人膠原蛋白溶解于注射用水中，溶解后，加入谷氨酰胺轉移酶，攪拌使其完全溶解，使混合溶液中的類人膠原蛋白的質量濃度為4.0%，谷氨酰胺轉移酶的質量為6U每克蛋白，置于-4℃冰箱交聯反應40 h，于程序冷凍儀中以-6℃/min的速度凍至-80℃，并保持2 h，迅速轉移至真空冷凍干燥機中凍干48 h，取出封裝進行Co60輻照滅菌24 h，獲得體內止血敷料。

實施例4

將類人膠原蛋白溶解于注射用水中，溶解后，加入谷氨酰胺轉移酶，攪拌使其完全溶解，使混合溶液中的類人膠原蛋白的質量濃度為5.0%，谷氨酰胺轉移酶的質量為8U每克蛋白，置于-4℃冰箱交聯反應48 h，于程序冷凍儀中以-8℃/min的速度凍至-80℃，并保持2 h，迅速轉移至真空冷凍干燥機中凍干48 h，取出封裝進行Co60輻照滅菌24 h，獲得體內止血敷料。

實施例5

以下為本發明實施例1所制備的體內止血敷料的相關性能測試：

1.體內止血敷料外觀觀察

圖1中，a為控制降溫幅度預凍的酶法交聯類人膠原蛋白止血敷料的樣品外觀圖，b為超低溫冰箱自然預凍的酶法交聯類人膠原蛋白止血敷料的樣品外觀圖。從圖中可以看出相比于超低溫冰箱直接預凍的體內止血敷料，采用程序降溫預凍的體內止血敷料表面更加平整和均勻，褶皺也較少。

2. 體內止血敷料掃描電鏡觀察

圖2中，a為控制降溫幅度預凍的酶法交聯類人膠原蛋白止血敷料的表面掃描電鏡圖，b為超低溫冰箱自然預凍的酶法交聯類人膠原蛋白止血敷料的表面掃描電鏡圖。從圖中可以看出相比于超低溫冰箱直接預凍的體內止血敷料，采用控制降溫幅度預凍的體內止血敷料形成的孔比較完整，而且大小均勻，可以有效的增加敷料與創面的接觸面積，提高止血效果。

3.體內止血敷料止血效果的測定

兔耳止血：以新西蘭大白兔為動物止血模型，預先配好的2.5%戊巴比妥鈉2mL緩慢注射于耳靜脈，待兔子麻醉后將其固定在手術臺上，使用彎剪剪去兔中央動脈出的兔毛，然后用安爾碘消毒液在兔耳部要做創面的地方進行消毒，用75%的酒精反復擦洗而脫掉碘液顏色，然后用手術刀片將耳部中央動脈切斷，并將做的創面表皮撕下。動脈血大量流出時，快速用無菌醫用紗布吸去，然后快速將提前準備好的一定大小海綿敷壓于切好的創面，并用手按壓止血。同時觀察海綿在創面的粘附情況，記錄完全止血時間，并對表面進行拍照。

兔肝臟止血：預先配好的2.5%戊巴比妥鈉2mL緩慢注射于耳靜脈，待麻醉后將其固定在手術臺上，采用手術刀片將兔腹部打開，直到肝臟暴露出來，用刀片在肝葉上做一個同樣大小的創面，大量的血液外流時，先用醫用無菌紗布吸收，然后快速使用準備好的膠原蛋白海綿敷壓創面，并用手按壓止血，同時觀察海綿在創面的粘附情況，記錄完全止血時間，并對肝臟表面進行拍照。

圖3中，a為控制降溫幅度預凍的酶法交聯類人膠原蛋白止血敷料的兔耳止血圖，b為超低溫冰箱自然預凍的熱交聯類人膠原蛋白止血敷料的兔耳止血。圖4中，a為控制降溫幅度預凍的酶法交聯類人膠原蛋白止血敷料的兔子肝臟止血圖， b為超低溫冰箱自然預凍的酶法交聯類人膠原蛋白止血敷料的兔子肝臟止血圖。經測定采用程序降溫預凍的體內止血敷料的兔耳完全止血時間約為56s，肝臟完全止血時間為44s。從圖中可以看出相比于超低溫冰箱直接預凍的體內止血敷料，采用控制降溫幅度預凍的體內止血敷料的兔耳創面止血以及肝臟的止血速度均更快，止血效果更好，這是因為其表面的光滑平整結構有利于其緊緊粘附于創面，內部大小均勻的孔狀結構有利于其與血液中血小板和凝血因子之間的作用，增強了體內止血敷料的止血功效。

4. 體內止血敷料的細胞毒性檢測

浸提液的制備方法：本實驗的所有操作均在生物安全柜內完成。將滅菌過的海綿樣品以0.1g/mL的比例浸入RPMI1640培養液中，用封口膜封住并放置在37oC恒溫條件下浸提72±2 h，取出樣品后用0.2μm的無菌濾器過濾，以除去浸提液中的顆粒物質。

細胞培養：將傳代后的BHK-21細胞經過胰蛋白酶消化后，加入新鮮培養液，反復吹打使細胞均勻分布在培養液中，使用血細胞計數板在倒置顯微鏡下計數，將細胞懸浮液稀釋至10⁴~10⁵個細胞/mL，分別接種在96孔板上，每個孔100μL，并設置一組對照組。然后將接種好的96孔板置于37℃的CO₂培養箱中培養24h，待細胞貼壁后，將原有培養液吸出，加入樣品浸提液，其中對照組和空白組中加入新鮮培養液，再放入生化培養箱中繼續培養。

測定：分別于1, 3, 5和7天時取出一個孔板，每孔加入10μL的CCK-8液，37oC下繼續培養4h，使用酶標儀測在450nm時的吸收值，通過下列計算相對增殖率（relative growth rate，RGR）：

RGR=A1/A2×100%

式中：A1：實驗組吸光度 A2：對照組吸光度

細胞毒性檢測使用CCK-8試劑盒進行。細胞毒性檢測試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）是利用水溶性四唑鹽能夠被細胞內線粒體中的脫氫酶還原成橙黃色的水溶性物質Formazan的原理來檢測細胞的增殖的，生成Formazan的量與細胞的數量成正關系，即活細胞數量越多，顏色就越深，越少顏色就越淺，也就是對細胞的毒性越大，通過酶標儀測定吸收值來間接分析細胞數量的變化。

圖5中顯示的是酶法交聯類人膠原蛋白止血敷料、熱交聯類人膠原蛋白止血敷料、酶法交聯動物膠原蛋白止血敷料和熱交聯動物膠原蛋白止血敷料浸提液對細胞生長的影響，從圖中可以看出酶法交聯動物膠原蛋白止血敷料和熱交聯動物膠原蛋白止血敷料的細胞毒性評價為2級，而酶法交聯類人膠原蛋白止血敷料和熱交聯類人膠原蛋白止血敷料的細胞毒性評價為1級，并且隨著細胞培養時間天數的增加，細胞存活率也隨之升高，這說明本發明制備的體內止血敷料無病毒隱患，安全性高，生物相容性好，有促進細胞生長的作用，符合生物醫用材料的要求。

5. 體內止血敷料的皮下植入

首先使用2.5%的麻醉劑在新西蘭兔耳靜脈注射2mL，然后將其固定在手術臺上，四塊手術布遮住其他地方只露出背部要植入的地方，用安爾碘對兔背部皮膚進行消毒，用75%酒精對手消毒。輕輕的用手夾起背部皮膚，然后用手術刀片輕輕的劃開一個長約10mm的小口，切口時，需要小心觀察兔子背部的毛細血管并避開，然后用鑷子夾起預先準備好的樣品止血材料，放入皮下，注意盡量與切口保持至少5mm，再進行切口縫合，縫合之后用安爾碘再次涂抹手術傷口消毒。一周后，將新西蘭兔處死，觀察兔內側皮膚是否出現紅腫、化膿以及潰爛等現象，來評價止血材料在生物體內的生物相容性。

圖6中，a為1周后酶法交聯類人膠原蛋白止血敷料的皮下植入圖， b為酶法交聯動物膠原蛋白止血敷料的皮下植入圖。從圖中可以看出，動物膠原蛋白體內止血敷料的皮下植入組織周圍有明顯的紅腫及化膿現象，而類人膠原蛋白體內止血敷料的皮下植入組織周圍沒有出現紅腫、化膿和潰爛等現象，說明本發明體內止血敷料無病毒隱患和生物排異性，安全性高，生物相容性好，是一種良好的生物醫用止血材料。

本發明的內容不限于實施例所列舉，本領域普通技術人員通過閱讀本發明說明書而對本發明技術方案采取的任何等效的變換，均為本發明的權利要求所涵蓋。