本發(fā)明涉及一種碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架及其制備方法，可用于軟組織、硬組織修復(fù)及藥物緩釋等再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

蠶絲蛋白是來源于自然界的天然高分子生物材料，具有優(yōu)異的力學(xué)性質(zhì)、可控的生物降解性、易加工性而成為理想的再生醫(yī)學(xué)支架的原材料。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和外科手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，通過組織或器官移植來修復(fù)功能損失已經(jīng)被廣泛接受，然而卻面臨著巨大的供體缺口。通過再生醫(yī)學(xué)手段體在體內(nèi)或體外形成組織或器官為受損功能的修復(fù)提供了新的治療方案。其中，組織工程支架材料的選擇及構(gòu)建成為該治療方法的關(guān)鍵之一。

目前，制備絲素蛋白多孔支架的方法有很多，包括冷凍干燥、鹽析法、氣體發(fā)泡法、三維打印等，然而這些方法都依然存在一些難以克服的不足。例如，冷凍干燥法易形成片層結(jié)構(gòu)，不利于細(xì)胞與組織生長，盡管現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道了一種反復(fù)進(jìn)行膜溶解控制絲素蛋白自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)，進(jìn)而形成多孔支架，但效率低，重復(fù)性差，并且孔壁結(jié)構(gòu)的存在直接限制細(xì)胞的遷移與相互作用，組織生長也因此受限。

為此，克服現(xiàn)有加工技術(shù)與絲蛋白支架結(jié)構(gòu)的上述問題，開發(fā)一種制備方法，并構(gòu)建出有利于細(xì)胞與組織生長的絲素支架對絲素蛋白在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的應(yīng)用及再生醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用都具有非常重大的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架的制備方法，及由該方法制備的碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架，具有多孔支架的大孔徑高空隙率優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有纖維狀的內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征，特別是通過碳酸鈣納米線增強(qiáng)，能夠在極大促進(jìn)細(xì)胞生長，如細(xì)胞增殖與遷移、和組織生長的同時(shí)具有良好的力學(xué)性能，對組織工程技術(shù)臨床應(yīng)用非常有利。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架的制備方法，包括以下步驟，

（1）對蠶絲進(jìn)行脫膠處理，獲得絲素蛋白纖維；

（2）將絲素蛋白纖維分散于鈣鹽/甲酸混合液中，得到絲素纖維分散液；

（3）將步驟（2）的絲素纖維分散液滴加入碳酸鹽溶液中，得到反應(yīng)液；然后過濾反應(yīng)液，濾餅經(jīng)過洗滌、干燥后得到碳酸鈣納米線；

（4）將氯化鈉加入步驟（2）的絲素纖維分散液中，攪拌均勻，然后加入步驟（3）的碳酸鈣納米線；攪拌后揮發(fā)去除甲酸得到絲素纖維-氯化鈉-碳酸鈣固體；

（5）將絲素纖維-氯化鈉-碳酸鈣固體置于流動(dòng)的水中處理，得到濕態(tài)絲素纖維支架；

（6）將濕態(tài)絲素纖維支架進(jìn)行冷凍處理得到冷凍體，然后對冷凍體進(jìn)行冷凍干燥即得到碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架。

上述技術(shù)方案中，所述蠶絲為桑蠶絲、柞蠶絲、蓖麻蠶絲或者天蠶絲，優(yōu)選桑蠶絲。

上述技術(shù)方案中，所述甲酸的質(zhì)量濃度為50-99%，優(yōu)選80-98%；所述鈣鹽/甲酸混合液中，鈣鹽的質(zhì)量濃度為1.1-1.8%，鈣鹽為氯化鈣等。本發(fā)明以鹽/甲酸分散絲素蛋白纖維，而不溶解，制備的天然絲素纖維支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)以纖維為主，具有高孔隙率、高貫通率、優(yōu)良的力學(xué)性能。

上述技術(shù)方案中，所述絲素纖維分散液中，絲素纖維的質(zhì)量濃度為2-30%，優(yōu)選5-10%。

上述技術(shù)方案中，所述氯化鈉的粒徑為1-20μm，優(yōu)選10-15μm。由此得到的多孔結(jié)構(gòu)更有利于細(xì)胞的黏附與生長，及組織長入，同時(shí)力學(xué)性能良好。

上述技術(shù)方案中，所述絲素纖維與氯化鈉的質(zhì)量比為1∶（80-100），優(yōu)選1∶（88-92）。由此得到的支架具有更為均勻的多孔結(jié)構(gòu)、適宜的孔隙率，更適合細(xì)胞與組織生長。

上述技術(shù)方案中，所述絲素纖維與碳酸鹽的質(zhì)量比為1∶（0.1-0.8）；所述碳酸鹽為碳酸鈉或者碳酸氫鈉。碳酸鹽滴入絲素纖維分散液中，可以形成碳酸鈣納米線，具有良好的生物相容性，與絲素纖維復(fù)合不但可以提高多孔支架的力學(xué)性能，增加可加工性，而且可以保持支架用作組織結(jié)構(gòu)制作需要的生物特性；尤其是本發(fā)明方法制備的碳酸鈣納米線具有高的長徑比，可以與絲素纖維形成良好的界面效應(yīng)，避免現(xiàn)有無機(jī)材料導(dǎo)致的界面缺陷。

本發(fā)明首先溶脹制備絲素纖維分散液，以此為基礎(chǔ)，用于碳酸鈣納米線以及絲素纖維多孔支架的制備，根據(jù)限定的質(zhì)量比以及實(shí)際需要，選擇所需要的絲素纖維分散液；所述絲素纖維與碳酸鈣納米線的質(zhì)量比為1∶（0.01-0.05）。

上述技術(shù)方案中，冷凍處理的溫度為-10～-196℃，冷凍干燥的溫度為-10～-80℃，冷凍處理的時(shí)間少于冷凍干燥的時(shí)間；這樣處理的優(yōu)點(diǎn)是兼顧能源節(jié)約與多孔結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定獲取。

本發(fā)明還公開了根據(jù)上述制備方法制備的碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架，其內(nèi)部主要由絲素纖維構(gòu)成，纖維直徑為50nm-50μm，同時(shí)纖維之間還存在碳酸鈣納米線；支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為80-180μm，壓縮模量為5kPa-100MPa。

本發(fā)明還公開了上述碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架在制備組織工程支架中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明直接以天然絲素纖維構(gòu)建纖維多孔材料，該制備方法利用酸對蠶絲的良好分散性以及少量鹽存在的微溶作用，結(jié)合處理工藝，所制備的碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)以纖維為主，同時(shí)存在碳酸鈣納米線，具有高孔隙率、高貫通率、優(yōu)良的力學(xué)性能，非常有利于營養(yǎng)物質(zhì)的輸送、細(xì)胞的遷移、組織的生長，是理想的組織工程支架。

附圖說明

圖1為實(shí)施例一制備的碳酸鈣納米線的掃描電鏡圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

實(shí)施例一

（1）桑蠶絲用0.5%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素蛋白纖維；

（2）絲素蛋白纖維溶于1.1%氯化鈣-98%甲酸溶液，絲素纖維分散液濃度5%；

（3）將絲素纖維分散液緩慢滴入碳酸鈉溶液進(jìn)行礦化反應(yīng)，滴加時(shí)間0.5h；絲素纖維與碳酸鈉的質(zhì)量比為1∶0.1；將反應(yīng)后的溶液過濾、洗滌、干燥得到外觀白色、粉末狀的碳酸鈣納米線；附圖1是上述碳酸鈣納米線的掃描電鏡圖片；由圖可見碳酸鈣線直徑在80-160nm，長度約650nm，具有高的長徑比；

（4）通過分篩獲得直徑10-15μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入碳酸鈣納米線，去除甲酸后浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-20℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架，壓縮模量約29kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為880nm-50μm，纖維之間還存在碳酸鈣納米線，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為90-100μm，絲素纖維與氯化鈉、碳酸鈣納米線的質(zhì)量比為1∶100∶0.01。

實(shí)施例二

（1）桑蠶絲用0.5%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素蛋白纖維；

（2）絲素蛋白纖維溶于1.6%氯化鈣-90%甲酸溶液，絲素纖維分散液濃度5%；

（3）將絲素纖維分散液緩慢滴入碳酸鈉溶液進(jìn)行礦化反應(yīng)，滴加時(shí)間0.5h；絲素纖維與碳酸鈉的質(zhì)量比為1∶0.1；將反應(yīng)后的溶液過濾、洗滌、干燥得到外觀白色、粉末狀的碳酸鈣納米線；碳酸鈣線直徑在90-150nm，長度約630nm，具有高的長徑比；

（4）通過分篩獲得直徑10-15μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入碳酸鈣納米線，去除甲酸后浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-10℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架，壓縮模量約82kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為500nm-25μm，纖維之間還存在碳酸鈣納米線，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為110-180μm，絲素纖維與氯化鈉、碳酸鈣納米線的質(zhì)量比為1∶100∶0.02。

實(shí)施例三

（1）桑蠶絲用0.5%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素蛋白纖維；

（2）絲素蛋白纖維溶于1.5%氯化鈣-98%甲酸溶液，絲素纖維分散液濃度10%；

（3）將絲素纖維分散液緩慢滴入碳酸鈉溶液進(jìn)行礦化反應(yīng)，滴加時(shí)間0.5h；絲素纖維與碳酸鈉的質(zhì)量比為1∶0.5；將反應(yīng)后的溶液過濾、洗滌、干燥得到外觀白色、粉末狀的碳酸鈣納米線；碳酸鈣線直徑在100-160nm，長度約670nm，具有高的長徑比；

（4）通過分篩獲得直徑1-15μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入碳酸鈣納米線，去除甲酸后浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-196℃冷凍，然后-30℃冷凍干燥，得到碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架，壓縮模量約122kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為500nm-25μm，纖維之間還存在碳酸鈣納米線，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為80-90μm，絲素纖維與氯化鈉、碳酸鈣納米線的質(zhì)量比為1∶100∶0.03。

實(shí)施例四

（1）天蠶絲用0.5%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素蛋白纖維；

（2）絲素蛋白纖維溶于1.6%氯化鈣-980%甲酸溶液，絲素纖維分散液濃度5%；

（3）將絲素纖維分散液緩慢滴入碳酸鈉溶液進(jìn)行礦化反應(yīng)，滴加時(shí)間0.5h；絲素纖維與碳酸鈉的質(zhì)量比為1∶0.1；將反應(yīng)后的溶液過濾、洗滌、干燥得到外觀白色、粉末狀的碳酸鈣納米線；碳酸鈣線直徑在90-150nm，長度約600nm，具有高的長徑比；

（4）通過分篩獲得直徑10-15μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入碳酸鈣納米線，去除甲酸后浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-90℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架，壓縮模量約10MPa，支架內(nèi)部纖維直徑為500nm-15μm，纖維之間還存在碳酸鈣納米線，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為120-180μm，絲素纖維與氯化鈉、碳酸鈣納米線的質(zhì)量比為1∶90∶0.02。

實(shí)施例五

（1）桑蠶絲用0.5%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素蛋白纖維；

（2）絲素蛋白纖維溶于1.8%氯化鈣-50%甲酸溶液，絲素纖維分散液濃度5%；

（3）將絲素纖維分散液緩慢滴入碳酸鈉溶液進(jìn)行礦化反應(yīng)，滴加時(shí)間0.5h；絲素纖維與碳酸鈉的質(zhì)量比為1∶0.8；將反應(yīng)后的溶液過濾、洗滌、干燥得到外觀白色、粉末狀的碳酸鈣納米線；碳酸鈣線直徑在90-110nm，長度約600nm，具有高的長徑比；

（4）通過分篩獲得直徑10-20μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入碳酸鈣納米線，去除甲酸后浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-150℃冷凍，然后-80℃冷凍干燥，得到碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架，壓縮模量約982kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為50nm-5μm，纖維之間還存在碳酸鈣納米線，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為80-110μm，絲素纖維與氯化鈉、碳酸鈣納米線的質(zhì)量比為1∶100∶0.04。

實(shí)施例六

（1）蓖麻蠶絲用0.5%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素蛋白纖維；

（2）絲素蛋白纖維溶于1.6%氯化鈣-90%甲酸溶液，絲素纖維分散液濃度30%；

（3）將絲素纖維分散液緩慢滴入碳酸鈉溶液進(jìn)行礦化反應(yīng)，滴加時(shí)間0.5h；絲素纖維與碳酸鈉的質(zhì)量比為1∶0.1；將反應(yīng)后的溶液過濾、洗滌、干燥得到外觀白色、粉末狀的碳酸鈣納米線；碳酸鈣線直徑在140-160nm，長度約680nm，具有高的長徑比；

（4）通過分篩獲得直徑10-15μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入碳酸鈣納米線，去除甲酸后浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-10℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架，壓縮模量約812kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為500nm-0.8μm，纖維之間還存在碳酸鈣納米線，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為80-140μm，絲素纖維與氯化鈉、碳酸鈣納米線的質(zhì)量比為1∶100∶0.01。

實(shí)施例七

（1）柞蠶絲用0.5%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素蛋白纖維；

（2）絲素蛋白纖維溶于1.2%氯化鈣-98%甲酸溶液，絲素纖維分散液濃度24%；

（3）將絲素纖維分散液緩慢滴入碳酸鈉溶液進(jìn)行礦化反應(yīng)，滴加時(shí)間0.5h；絲素纖維與碳酸鈉的質(zhì)量比為1∶0.6；將反應(yīng)后的溶液過濾、洗滌、干燥得到外觀白色、粉末狀的碳酸鈣納米線；碳酸鈣線直徑在90-100nm，長度約620nm，具有高的長徑比；

（4）通過分篩獲得直徑10-15μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入碳酸鈣納米線，去除甲酸后浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-10℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架，壓縮模量約98MPa，支架內(nèi)部纖維直徑為500nm-5μm，纖維之間還存在碳酸鈣納米線，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為80-100μm，絲素纖維與氯化鈉、碳酸鈣納米線的質(zhì)量比為1∶100∶0.05。

實(shí)施例八

（1）桑蠶絲用0.5%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素蛋白纖維；

（2）絲素蛋白纖維溶于1.5%氯化鈣-98%甲酸溶液，絲素纖維分散液濃度10%；

（3）將絲素纖維分散液緩慢滴入碳酸鈉溶液進(jìn)行礦化反應(yīng)，滴加時(shí)間0.5h；絲素纖維與碳酸鈉的質(zhì)量比為1∶0.3；將反應(yīng)后的溶液過濾、洗滌、干燥得到外觀白色、粉末狀的碳酸鈣納米線；碳酸鈣線直徑在90-130nm，長度約640nm，具有高的長徑比；

（4）通過分篩獲得直徑10-15μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入碳酸鈣納米線，去除甲酸后浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-10℃冷凍，然后-60℃冷凍干燥，得到碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架，壓縮模量約192kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為800nm-12μm，纖維之間還存在碳酸鈣納米線，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為90-110μm，絲素纖維與氯化鈉、碳酸鈣納米線的質(zhì)量比為1∶100∶0.02。

實(shí)施例九

（1）桑蠶絲用0.5%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素蛋白纖維；

（2）絲素蛋白纖維溶于1.1%氯化鈣-90%甲酸溶液，絲素纖維分散液濃度8%；

（3）將絲素纖維分散液緩慢滴入碳酸鈉溶液進(jìn)行礦化反應(yīng)，滴加時(shí)間0.5h；絲素纖維與碳酸鈉的質(zhì)量比為1∶0.12；將反應(yīng)后的溶液過濾、洗滌、干燥得到外觀白色、粉末狀的碳酸鈣納米線；碳酸鈣線直徑在90-140nm，長度約630nm，具有高的長徑比；

（4）通過分篩獲得直徑10-15μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入碳酸鈣納米線，去除甲酸后浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-90℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架，壓縮模量約782kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為780nm-2μm，纖維之間還存在碳酸鈣納米線，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為80-90μm，絲素纖維與氯化鈉、碳酸鈣納米線的質(zhì)量比為1∶100∶0.02。

實(shí)施例十

（1）桑蠶絲、天蠶絲分別用0.5%的碳酸氫鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得各自絲素蛋白纖維；

（2）絲素蛋白纖維溶于1.6%氯化鈣-98%甲酸溶液，天蠶絲素纖維分散液濃度10%；桑蠶絲素纖維分散液濃度10%；

（3）將桑絲素纖維分散液緩慢滴入碳酸鈉溶液進(jìn)行礦化反應(yīng)，滴加時(shí)間0.5h；絲素纖維與碳酸鈉的質(zhì)量比為1∶0.1；將反應(yīng)后的溶液過濾、洗滌、干燥得到外觀白色、粉末狀的碳酸鈣納米線；碳酸鈣線直徑在110-150nm，長度約650nm，具有高的長徑比；

（4）通過分篩獲得直徑10-15μm的氯化鈉顆粒，然后加入天蠶絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入碳酸鈣納米線，去除甲酸后浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-40℃冷凍，然后-50℃冷凍干燥，得到碳酸鈣增強(qiáng)的絲素纖維支架，壓縮模量約88MPa，支架內(nèi)部纖維直徑為500nm-25μm，纖維之間還存在碳酸鈣納米線，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為80-180μm，絲素纖維與氯化鈉、碳酸鈣納米線的質(zhì)量比為1∶100∶0.02。