本發明涉及一種生物醫用材料技術領域的方法，具體是一種絲素蛋白改性的磷酸鈣類骨水泥多孔支架及制備方法和應用，以自制的α-TCP為粉末主體，使用鹽粒為致孔劑制備多孔支架后浸泡在絲素蛋白溶液中，取出后干燥使支架表面附著一層絲素蛋白，制備得到絲素蛋白表面改性的骨水泥多孔支架。

背景技術：

磷酸鈣類骨水泥由于其具備良好的生物相容性以及骨誘導性，在骨損傷修復方面具有廣闊的應用前景。磷酸鈣類骨水泥通常由兩種或以上磷酸鈣鹽的粉末混合后與固化液在一定的固液比例下調勻，發生水化反應，能在室溫或人體環境中自固化，具有自由塑形、固化溫和的特點。α-TCP [α相-磷酸三鈣]常應用于磷酸鈣類骨水泥的粉體，能與中性固化液在室溫發生水化反應，生成主要成分為羥基磷灰石的磷酸鈣骨水泥，與人體骨的無機成分相似。目前市場上對于磷酸鈣類骨水泥的使用，一種是應用于微創手術的注射型骨水泥，一種是經過體外塑形固化后，制備成骨棒、骨塊等骨水泥支架，用于開放式手術的骨損傷修復。其中，磷酸鈣類骨水泥多孔支架由于增加了材料的表面積，一方面可為細胞粘附提供更大的空間，促進骨細胞生長，并允許血管組織在內部生長[Yao Jun, et al, Biomaterials, 2005]，另一方面有利于材料與體液充分接觸，加快材料的降解。

骨損傷修復過程中，受創的毛細血管內皮分裂、增生，向損傷內部延伸，在血管內血液的沖擊下逐漸形成管腔，再經過一系列過程形成相應的血管平滑肌及外膜，完成骨血管再生過程[Ausprunk DH, MicrovascRec, 1997]。血液的供應對骨組織再生有積極促進作用，充足的血供確保了骨折修復需要的血液細胞成分的釋放。絲素蛋白具有良好的生物相容性和生物可降解性，對表皮細胞的生長具有促進作用，以絲素蛋白為支架構建材料的組織工程研究中，常將其作為一種膜修復材料廣泛應用于血管、皮膚、人工韌帶等組織的修復[王宏昕, 中國修復重建外科雜志, 2007]。

在磷酸鈣類骨水泥的研究中，絲素蛋白常用于增強劑使用，通過絲素纖維與骨水泥粉末的復合，增加固化后骨水泥的力學性能，而忽視了絲素蛋白在血管修復方面的優勢，大大限制絲素蛋白在骨修復上的應用。本發明針對以上背景，利用磷酸鈣類骨水泥的骨傳導性、骨誘導性的優勢，同時結合絲素蛋白及骨水泥多孔結構在骨血管修復方面的優勢，提出一種絲素蛋白改性的骨水泥多孔支架的制備方法，使骨細胞在材料上粘附生長的同時加速骨血管的修復，進而加速骨組織的愈合。

技術實現要素：

為克服現有技術的不足，本發明提供一種絲素蛋白改性的骨水泥多孔支架及制備和應用，開發出一種滿足臨床需求的新型骨修復材料。

本發明的目的通過以下技術方案來實現：將摩爾比為2:1的磷酸氫鈣與碳酸鈣粉末充分混合；采用固相反應法，通過控制反應條件，制備得到作為骨水泥粉末主體的α-TCP粉末；研磨鹽粒并過篩得到粒徑大小100-300μm的鹽顆粒，與α-TCP充分混合制備出骨水泥粉末；與固化液混合固化，放入37℃水浴浸泡24h使鹽粒溶解得到骨水泥多孔支架；將該支架放入質量分數為5-30%的絲素蛋白溶液中浸泡24h，取出后置于60℃烘箱中干燥，制備得到絲素蛋白表面改性的骨水泥多孔支架。

一種絲素蛋白改性的骨水泥多孔支架的制備方法，其特征在于，包含以下步驟：

（1）采用固相反應法將原料磷酸氫鈣與碳酸鈣按摩爾比2:1充分混合后，在1250-1400℃煅燒2-4h并急速冷卻至室溫，制備α-TCP粉末，產物經濕法球磨控制粒徑在2-4μm；

（2）以上述α-TCP粉末為主體，以粒徑為100-300μm鹽粒為致孔劑，質量分數為0.5-5%的磷酸氫二鈉溶液作為骨水泥固化液，將粉末充分混合之后與固化液按一定比例調和并固化，于37℃水浴中浸泡除去致孔劑，制備骨水泥多孔支架；

（3）將上述多孔支架浸泡于質量分數為5-30%的絲素蛋白溶液中24h，取出后置于60℃烘箱中干燥，制備得到絲素蛋白表面改性的骨水泥多孔支架。

步驟（1）所述的固相反應法的原料混合方式為使用無水乙醇為介質的濕法球磨，轉速為400rpm，球磨時間為1-4h，球料比為質量比3:1。

步驟（1）所述的產物球磨方式為使用無水乙醇為介質的濕法球磨，轉速為400rpm，球磨時間為6h，球料比為質量比4:1。

步驟（2）所述的致孔劑是經研磨后過篩所得，混合比例為質量分數10-50%，混合方式為使用研缽混合或干法球磨。

步驟（2）所述的骨水泥粉末與固化液的比例為1.0g/mL-2.0g/mL。

一種絲素蛋白改性的骨水泥多孔支架，其特征在于，根據上述任一所述方法制備得到。

一種絲素蛋白改性的骨水泥多孔支架的應用。

本發明包括以下步驟：

1、將磷酸氫鈣與碳酸鈣混合均勻，其為摩爾比2:1。所述混合方式為使用無水乙醇為混合介質的球磨混合，轉速400rpm，球磨時間為1-4h，混合后的懸濁液通過旋轉蒸發除去乙醇后放入60℃烘箱中干燥。

2、將干燥后的磷酸氫鈣與碳酸鈣混合物在1250-1400℃爐中鍛燒2-4h后取出，在鼓風環境下急速冷卻，得到α-TCP粉末，之后采用濕法球磨的方式得到粒徑均一的α-TCP粉末，其粒徑范圍在2-4μm。干燥后備用。

3、將粗鹽粒研磨后過篩，篩分出粒徑大小在100-300μm范圍內的鹽顆粒。所述研磨方式可為使用研缽研磨或干法球磨。

4、配制質量分數為0.5-5%的磷酸氫二鈉溶液作為骨水泥固化液。所述配制方法為室溫下的攪拌溶解或超聲助溶。

5、將α-TCP粉末與鹽粒按質量比10-50%充分混合，與固化液按一定比例混合后填入模具，充分固化后放入37℃水浴浸泡24h，得到磷酸鈣骨水泥多孔支架。所述粉末的混合方式可為使用研缽研磨或干法球磨；所述粉末與固化液的比例為1.0g/mL-2.0g/mL。

6、將骨水泥多孔支架放入質量分數為5-30%的絲素蛋白溶液中浸泡24h，取出后置于60℃烘箱中干燥，制備得到絲素蛋白表面改性的骨水泥多孔支架。

使用羥基磷灰石骨水泥作為骨架，表面使用絲素蛋白改性，與人體骨結構更為相似；在骨修復過程中，材料多孔內部的絲素蛋白表面有利于血管細胞的粘附生長，加速骨血管的修復，同時骨細胞也利于在孔道中生長，進而促進骨組織的愈合。

本發明提供的骨水泥多孔支架的制備方法，其所用原料簡單，制備過程簡易，可大規模生產。該絲素蛋白改性的骨水泥多孔支架符合臨床應用對綜合性能的要求，且具備促進細胞生長的能力，在臨床骨組織修復領域有廣闊的應用前景。

本發明的優點在于：

1、使用絲素蛋白進行磷酸鈣類骨水泥的表面改性，使其更利于血管表皮細胞的粘附，結合骨水泥多孔支架的內部結構，加速骨缺損修復過程中的骨血管新生，進而促進骨組織愈合。

2、制備方法簡便，所用原料簡單，適于大量生產。

附圖說明

圖1是本技術所制備骨水泥多孔支架的SEM電鏡掃描結果，孔徑大小為50-300nm。

圖2是本技術所制備骨水泥多孔支架以NIH3T3細胞為對象的細胞增殖試驗結果，測試方法為實施例1所述，其中樣品①-③分別對應實施例2-4的骨水泥配方。

具體實施方式

以下實施例以發明技術方案為前提進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍并不限于下述的實施例。

實施例1

（1）α-TCP粉末制備：

按摩爾比2:1稱量磷酸氫鈣粉末和碳酸鈣粉末，使用適量無水乙醇為介質濕法球磨，轉速400rpm，球磨時間4h，球磨珠與粉末質量比為3:1。原料混合液通過旋轉蒸發除去乙醇，置于60℃烘箱中干燥24h。將干燥后的粉末置于馬弗爐中，1400℃煅燒2h后取出，在鼓風環境下急速冷卻。將冷卻后的粉末以無水乙醇為介質濕法球磨，轉速400rpm，球磨時間為6h，球磨珠與粉末質量比為4:1。粉末懸濁液置于80℃烘箱中充分干燥，制備得到α-TCP粉末。

（2）絲素蛋白的制備：

將蠶絲脫膠處理，溶解在氯化鈣、乙醇和去離子水的混合溶液中，經過透析得到絲素蛋白溶液，在60℃烘箱中自然干燥制備得到水溶性的絲素蛋白粉末。

（3）細胞增殖試驗方法：

制備直徑6mm，高2mm的多孔支架，在75%乙醇溶液中滅菌15min，用培養基浸泡過夜，試驗組樣品干燥后浸泡于不同濃度的絲素蛋白溶液中24h，取出后置于60℃烘箱中干燥；對照組為不含樣品的空白對照，結果如圖2（0）所示。將對照組和試驗組樣品置于96孔板中，每個樣品設置6個平行樣，將含有NIH3T3細胞10000個/mL的細胞培養液100μL滴加于樣品孔中，培養24h、48h、72h。加入含體積分數10%cck-8試劑的培養基孵育2-4h，在450nm波長下測量紫外吸收，得到細胞增殖試驗結果。

實施例2

將實施例1制備的α-TCP與粒徑為100-300μm鹽粒按質量比8：2混合，得到骨水泥粉末，將其與質量分數2%的磷酸氫二鈉溶液按1.5g/mL的固液比進行調和，充分固化后置于37℃水浴浸泡24h除去鹽粒，得到骨水泥多孔支架。將上述支架浸泡于質量分數10%的絲素蛋白溶液中24h，取出后置于60℃烘箱中干燥，得到絲素蛋白改性的骨水泥多孔支架。其SEM電鏡掃描結果如圖1所示，孔隙率為38%，采用實施例1所述方法進行細胞增殖試驗，結果如圖2（①）所示。

實施例3

將實施例1制備的α-TCP與粒徑為100-300μm鹽粒按質量比7：3混合，得到骨水泥粉末，將其與質量分數2%的磷酸氫二鈉溶液按1.5g/mL的固液比進行調和，充分固化后置于37℃水浴浸泡24h除去鹽粒，得到骨水泥多孔支架。將上述支架浸泡于質量分數10%的絲素蛋白溶液中24h，取出后置于60℃烘箱中干燥，得到絲素蛋白改性的骨水泥多孔支架?？紫堵蕿?6%，采用實施例1所述方法進行細胞增殖試驗，結果如圖2（②）所示。

實施例4

將實施例1制備的α-TCP與粒徑為100-300μm鹽粒按質量比7：3混合，得到骨水泥粉末，將其與質量分數2%的磷酸氫二鈉溶液按1.5g/mL的固液比進行調和，充分固化后置于37℃水浴浸泡24h除去鹽粒，得到骨水泥多孔支架。將上述支架浸泡于質量分數20%的絲素蛋白溶液中24h，取出后置于60℃烘箱中干燥，得到絲素蛋白改性的骨水泥多孔支架?？紫堵蕿?5%，采用實施例1所述方法進行細胞增殖試驗，結果如圖2（③）所示。