本發(fā)明涉及一種用于口服蛋白免疫載體的制備方法，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

疫苗作為人類對(duì)抗疾病的有效防御武器，在抵抗傳染性疾病中起著重要的作用。很多傳染性疾病是由于微生物病原體入侵呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道而引起的，而粘膜免疫系統(tǒng)分泌的IgA能有效地阻止微生物病原體的入侵。在口服給藥后，由腸相關(guān)淋巴組織(GALT)分泌IgA能轉(zhuǎn)移到呼吸道，泌尿生殖道等較遠(yuǎn)的黏膜位點(diǎn)，從而抵御病毒和微生物病原體的入侵。但是目前市場(chǎng)上的大多數(shù)疫苗是通過皮下注射或是肌肉注射來(lái)進(jìn)行接種的，這種接種方式僅僅能誘導(dǎo)全身性免疫，而不能引發(fā)粘膜免疫系統(tǒng)。

與注射疫苗相比，粘膜疫苗有著諸多優(yōu)勢(shì)。它不僅能引發(fā)全身性免疫系統(tǒng)還能引發(fā)粘膜免疫系統(tǒng)，使得機(jī)體產(chǎn)生黏膜IgA和血清IgG抗體，還能避免注射疫苗帶來(lái)的疼痛，降低注射感染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，當(dāng)抗原在機(jī)體的某一黏膜部位給藥后，不僅能在給藥部位誘導(dǎo)產(chǎn)生局部粘膜免疫反應(yīng)，還能在距離給藥部位較遠(yuǎn)的黏膜部位產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這使得黏膜成為口服疫苗免疫的理想位點(diǎn)。雖然鼻腔、直腸及陰道等部位給藥后，都能誘導(dǎo)機(jī)體的粘膜免疫反應(yīng)，但是這些部位不足以對(duì)抗腸道感染，并且給藥不方便。

而當(dāng)疫苗口服給藥后，在機(jī)體內(nèi)能產(chǎn)生有效的局部粘膜免疫，也增加了病人的順應(yīng)性，而且不需要專業(yè)訓(xùn)練。研究表明當(dāng)顆粒進(jìn)入體內(nèi)后，濾泡相關(guān)上皮細(xì)胞能將其轉(zhuǎn)移到派爾式(PPs)結(jié)上，位于PPs結(jié)上的M細(xì)胞再將抗原攝取，從而引發(fā)機(jī)體的粘膜免疫作用。而當(dāng)?shù)鞍滓呙缰苯颖┞对谖改c道內(nèi)時(shí)，胃腸道內(nèi)的環(huán)境和各種酶的作用會(huì)影響蛋白疫苗的完整性，導(dǎo)致蛋白疫苗不能被有效攝取，進(jìn)而無(wú)法引發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)。

研究人員在口服生物降解載體的研究中已經(jīng)取得了重大突破，但這類不穩(wěn)定的材料，如脂質(zhì)體，聚合物納米粒等，在水中會(huì)造成疫苗的泄露，這會(huì)使得疫苗直接暴露在胃內(nèi)的酸性環(huán)境中，導(dǎo)致疫苗失效，從而達(dá)不到預(yù)防或治療的效果。

自2006年，多孔硅材料SBA-15首次作為免疫佐劑的研究后，無(wú)機(jī)多孔材料成為口服疫苗載體的研究熱點(diǎn)。介孔二氧化硅納米粒子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，生物相容性好，毒性低，表面孔隙多，在體內(nèi)胃腸道內(nèi)穩(wěn)定，還可以通過改善合成條件來(lái)控制粒子的粒徑和孔徑大小。

研究表明在無(wú)機(jī)載體表面包裹一層有機(jī)材料，不僅可以調(diào)節(jié)藥物在機(jī)體內(nèi)的釋放，還能有效保護(hù)藥物進(jìn)入體內(nèi)后免受胃腸道環(huán)境的破壞。

殼聚糖(chitosan，CS)是一種陽(yáng)離子聚合物，作為藥物載體具有良好的生物相容性、生物可降解性，無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，還具有打開腸上皮細(xì)胞間緊密連接的能力。殼聚糖通過靜電作用吸附在介孔二氧化硅納米粒表面，這樣不僅可以保護(hù)疫苗不受胃腸道環(huán)境的破壞，還能促進(jìn)介孔二氧化硅納米粒子滲透進(jìn)入粘液層，增加M細(xì)胞的攝取，并通過激活樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)蛋白疫苗經(jīng)口服后，在胃腸道會(huì)因各種酶和環(huán)境PH值的影響，導(dǎo)致蛋白疫苗失活，從而無(wú)法達(dá)到預(yù)防或治療的效果，此外，肌肉或皮下注射疫苗只能誘導(dǎo)機(jī)體的全身性免疫而不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生粘膜免疫等問題，設(shè)計(jì)了一種用于口服蛋白疫苗的載體，通過黏膜濾泡相關(guān)細(xì)胞對(duì)載體的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，將含有蛋白抗原的載體粒子運(yùn)輸至巨噬細(xì)胞，樹突細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞將其攝取，再處理和呈遞給B、T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生機(jī)體的免疫應(yīng)答。

本發(fā)明以十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)為模板劑，以正硅酸四乙酯(TEOS)為硅源，以乙醇和乙醚為助溶劑，當(dāng)TEOS水解時(shí)放熱會(huì)使助溶劑乙醚揮發(fā)，從而在介孔二氧化硅的表面形成大孔結(jié)構(gòu)，制得具有大孔結(jié)構(gòu)的介孔二氧化硅納米粒載體。

本發(fā)明提供了一種用于口服蛋白免疫載體的制備方法，具體制備過程是：

(1)將模板劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶于去離子水中，依次加入氨水，乙醇，乙醚在室溫下劇烈攪拌至溶液澄清，快速滴加正硅酸四乙酯(TEOS)，劇烈攪拌反應(yīng)，得到白色固體沉淀；

(2)將步驟(1)中所得的沉淀進(jìn)行抽濾，用乙醇和水洗滌，將所得沉淀物置于烘箱中干燥；

(3)將步驟(2)干燥后的固體粉末置于硝酸銨/乙醇溶液中加熱攪拌回流，除去介孔二氧化硅中的模板劑(CTAB)；

(4)將模型藥物牛血清蛋白(BSA)溶于磷酸鹽緩沖液中，溶脹過夜；

(5)將BSA溶液與處理過的介孔二氧化硅按一定的質(zhì)量比例，置于磷酸鹽緩沖液中，4度下攪拌24小時(shí)，離心，凍干沉淀物；

(6)殼聚糖(CS)溶于1％醋酸溶液中，磁力攪拌至其完全溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)殼聚糖溶液PH至5.5左右；

(7)將載有BSA的介孔二氧化硅凍干粉加入到殼聚糖溶液中，在4度下攪拌10小時(shí)，離心，凍干沉淀物。

本發(fā)明制備過程(1)中，模板劑十六烷基三甲基溴化銨的質(zhì)量在0.2g～0.5g，優(yōu)選0.5g；正硅酸四乙酯，去離子水，氨水，乙醇，乙醚的體積比為2.5∶70∶0.8∶(5～25)∶20，優(yōu)選2.5∶70∶0.8∶20∶20。

本發(fā)明制備過程(4)中，所選擇的藥物僅為模型藥物BSA，但不局限于此，藥物還可以是用于預(yù)防小兒麻痹癥、流感等疾病的蛋白疫苗，BSA的濃度在0.2～6mg/ml，優(yōu)選2mg/ml。

處方中BSA與介孔二氧化硅的質(zhì)量比在5∶1～1∶20，優(yōu)選1∶1。

本發(fā)明制備過程(6)中，殼聚糖的分子量為50kDa，脫乙酰基度＞95％，濃度為2～6mg/ml，優(yōu)選2mg/ml。

本發(fā)明制備過程(7)中，載藥凍干粉的質(zhì)量為10mg，殼聚糖溶液的體積為2mL。

本發(fā)明制備過程(4)、(5)中，磷酸鹽緩沖液的PH值均為7.4。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)、合成的無(wú)機(jī)介孔二氧化硅材料結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，生物相容性好，毒性低，表面孔隙多，在體內(nèi)胃腸道內(nèi)穩(wěn)定。

(2)、殼聚糖具有打開腸上皮細(xì)胞間緊密連接的能力，通過靜電作用吸附在介孔二氧化硅表面，不僅能保護(hù)蛋白藥物在胃腸道中的穩(wěn)定性，還能延長(zhǎng)載體粒子在腸道內(nèi)的滯留時(shí)間。此外，表面帶正電的載體粒子易于被上皮細(xì)胞攝取，能有效地激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全身性免疫和粘膜免疫。

(3)、本發(fā)明的制備方法對(duì)設(shè)備的要求不高，工藝過程簡(jiǎn)單，可進(jìn)行放大化工藝生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為根據(jù)BJH模型計(jì)算得到的實(shí)施例1制備的介孔二氧化硅納米材料的孔徑分布曲線。

圖2為實(shí)施例1～3制備的載體材料、模型藥物和載藥粒子的紅外光譜圖。圖中a為模型藥物BSA，b為介孔二氧化硅納米材料，c為介孔二氧化硅載模型藥物BSA，d為殼聚糖，e為殼聚糖包裹介孔二氧化硅載模型藥物BSA。

圖3～圖5為實(shí)施例1制備的介孔二氧化硅納米材料的掃描電鏡圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

介孔二氧化硅載體的制備：

(1)精密稱取十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)500mg，溶于70ml去離子水中，然后依次加入氨水溶液0.8ml，無(wú)水乙醇20ml，乙醚20ml，室溫下劇烈攪拌30分鐘至溶液澄清，再向其中快速滴加2.5ml正硅酸四乙酯，劇烈攪拌4小時(shí)，得到白色固體沉淀。

(2)將得到白色固體沉淀抽濾，用乙醇和去離子水洗滌沉淀數(shù)次，再置于60度烘箱中干燥24h。

(3)精密稱取干燥后的固體粉末0.5g，于100ml濃度為6g/L的硝酸銨/95％的乙醇中，在60度下攪拌回流5h，抽濾，洗滌沉淀，置于烘箱中干燥，得到介孔二氧化硅。

實(shí)施例2：

介孔二氧化硅載藥粒子的制備：

(1)精密稱取牛血清蛋白(BSA)500mg，于250mL容量瓶中，用PH為7.4的磷酸鹽緩沖液定容至刻度線，得濃度為2mg/mL的BSA溶液作為儲(chǔ)備液。

(2)精密稱取介孔二氧化硅60mg，加入儲(chǔ)備液30ml，在4度下攪拌24h，離心溶液，凍干沉淀物，得到介孔二氧化硅載BSA的凍干粉。

實(shí)施例3：

殼聚糖介孔二氧化硅載藥粒子的制備：

(1)精密量取1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為≥99％的醋酸于100mL容量瓶中，定容，得到1％的醋酸溶液。

(2)精密稱取50mg殼聚糖，溶于10mL1％的醋酸溶液中，完全溶解后，再用2M氫氧化鈉溶液將其pH調(diào)至5.5左右，加去離子水定容至25mL，得到濃度為2mg/mL的殼聚糖溶液。

(3)精密稱取介孔二氧化硅載藥凍干粉10mg，加入濃度為2mg/mL的殼聚糖溶液1mL，在4度下攪拌10h，離心溶液，凍干沉淀物，得到殼聚糖包裹介孔二氧化硅載藥粒子。