本發明屬于納米醫學技術領域，涉及一種對超低頻磁場敏感的功能磁性納米材料及其制備方法。

背景技術：

近年來，磁性納米材料因其自身特有的磁力性能和較好的生物相容性而被應用于各個領域，例如核磁共振成像、基因或藥物的載體等，磁性納米材料在腫瘤治療領域被視為最有前景的納米藥物。尤其是在腦腫瘤治療方面，通過多肽修飾的磁性納米材料，具有跨越血腦屏障的能力，并可通過外加磁場來增強其跨越血腦屏障的效率。

目前，磁性納米材料在腫瘤治療方面的應用主要有兩種方式：一是作為抗癌藥物或基因的載體，在外加磁場作用下靶向到腫瘤部位；二是作為磁熱療法中的媒介。這兩種治療方法分別存在如下缺陷：磁性納米材料作為抗癌藥物載體，雖然在外加磁場的作用下能夠提高靶向治療效果，但是抗癌治療價格昂貴且副作用大，藥物在體內循環的過程中仍會作用到正常細胞，從而影響人體健康；磁熱療法就是利用外部磁場直接加熱，其治療原理是在腫瘤外部施加高頻交變磁場，同時利用渦流效應使腫瘤組織吸收磁場能量產熱升溫，磁場工作頻率從數兆赫至上千兆赫，功耗通常在300瓦至500瓦之間，因此，腫瘤周圍的健康組織同樣會吸收電磁波能量而受損傷，并且該方法對體內深層腫瘤的療效仍不理想。此外，研究發現高頻磁場對人體還存在一定的危害性。

隨著磁性納米材料治療腫瘤時代的開啟，磁誘導機械力破壞成為新興的物理治療方法。它以磁性納米材料為“磁力刀”，通過交變磁場控制“磁力刀”運動，產生機械力破壞腫瘤細胞的生理功能，從而殺死腫瘤細胞。與其它兩種治療方法相比，機械力破壞殺死腫瘤細胞的治療方法具有特有的優勢，如毒副作用小、治療效果好等。然而已有的研究都是采用微米級“磁力刀”在交變磁場中對腫瘤細胞產生機械力破壞，從而導致癌細胞死亡。由于微米級“磁力刀”尺寸較大，不容易被細胞內吞，且體內循環過程中容易堵塞血管，尤其是在腦腫瘤治療過程中，因其尺寸過大而不易跨過血腦屏障，嚴重影響了治療效果。

技術實現要素：

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種能夠安全有效地殺死腫瘤細胞的對超低頻磁場敏感的功能磁性納米材料及其制備方法。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

一種對超低頻磁場敏感的功能磁性納米材料的制備方法，該方法具體包括以下步驟：

(1)磁性納米材料的制備：

(1-1)分別將乙酰丙酮鋅及乙酰丙酮鐵加入至有機溶劑A中，并混合均勻；

(1-2)在280-300℃下反應25-35min，冷卻后加入有機溶劑B；

(1-3)靜置后得到固體沉淀，將該固體沉淀洗滌后，分散于有機溶劑C中，即得到所述的磁性納米材料；

(2)功能磁性納米材料的制備：

(2-1)將活化羧基后的聚丙烯酸與多巴胺混合后，攪拌使其充分反應；

(2-2)加入氨基化聚乙二醇，攪拌使其充分反應，后經透析、干燥，得到多巴胺-聚丙烯酸-聚乙二醇；

(2-3)分別將磁性納米材料及多巴胺-聚丙烯酸-聚乙二醇溶于有機溶劑D中，超聲40-60min后，攪拌使其充分反應，得到水溶性磁性納米材料；

(2-4)將水溶性磁性納米材料溶于MES緩沖液中，活化羧基后，加入PBS緩沖液，之后加入靶向基團，攪拌使其充分反應，即得到所述的功能磁性納米材料。

將功能磁性納米材料水洗后，分散于PBS緩沖液中，待需要時取用。

本發明通過對磁性納米材料進行表面改性，制得功能磁性納米材料。

MES緩沖液為2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液，PBS緩沖液為磷酸鹽緩沖液，EDC為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，NHS為N-羥基琥珀酰亞胺。

所述的有機溶劑A為油酸與二芐醚的混合物，并且油酸與二芐醚的體積比為1-2:10；所述的有機溶劑B為無水乙醇，所述的有機溶劑C為甲苯，所述的有機溶劑D為N,N-二甲基甲酰胺。

步驟(1-1)所述的混合過程中，通入氬氣作為保護氣。

步驟(1-3)中，靜置時間為4-12h，所述的洗滌過程中，洗滌劑包括乙醇或甲苯中的一種或兩種。

步驟(2-1)中，聚丙烯酸的活化羧基工藝為：將聚丙烯酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中，之后分別加入EDC及三乙胺，攪拌10-20min即可，每1mL N,N-二甲基甲酰胺中加入3-4mg所述的聚丙烯酸，所述的聚丙烯酸、EDC及三乙胺的質量比為18:92-98:0.5-1。

步驟(2-2)中，加入氨基化聚乙二醇后，攪拌4-12h使其充分反應。所述的干燥為冷凍干燥，該冷凍干燥過程中，溫度為-55℃至-45℃，壓力為0.1-0.12atm。

步驟(2-3)中，超聲后，攪拌4-12h使其充分反應。

步驟(2-4)中，所述的MES緩沖液的pH值為4-4.5，所述的PBS緩沖液的pH值為8.5-9.5，活化羧基工藝為：分別加入EDC及NHS，攪拌10-20min即可，所述的水溶性磁性納米材料、EDC及NHS的質量比為8:45-50:65-70。

步驟(2-4)中，所述的靶向基團為表皮生長因子、HER2抗體或PSMA抗體。

步驟(1-1)中，所述的乙酰丙酮鋅及乙酰丙酮鐵的摩爾比為3:1-3，每1mL有機溶劑A中，加入20-30mg所述的乙酰丙酮鋅；

步驟(1-2)中，所述的有機溶劑B與步驟(1-1)中所述的有機溶劑A的體積比為1:4-6；

步驟(1-3)中，每1mL有機溶劑C中，加入8-12mg固體沉淀。

步驟(2-1)中，所述的聚丙烯酸與多巴胺的質量比為3:7-10；

步驟(2-2)中，所述的氨基化聚乙二醇與步驟(2-1)中所述的多巴胺的質量比為125:21-27；

步驟(2-3)中，所述的磁性納米材料與多巴胺-聚丙烯酸-聚乙二醇的質量比為1:0.8-1.5，每1mL有機溶劑D中，加入0.8-1.1mg所述的磁性納米材料；

步驟(2-4)中，每1mL MES緩沖液中，加入2-4mg所述的水溶性磁性納米材料，所述的MES緩沖液與PBS緩沖液的體積比為1:1-3，所述的靶向基團與水溶性磁性納米材料的質量比為1:17-23。

一種采用所述的方法制備而成的對超低頻磁場敏感的功能磁性納米材料。

所述的超低頻磁場為超低頻旋轉磁場，該超低頻旋轉磁場的頻率范圍為0.5-20Hz。

本發明中，多巴胺的作用為：提供酚羥基，與磁性納米材料中的Fe原子形成鐵氧鍵，從而將多巴胺-聚丙烯酸-聚乙二醇成功地修飾在磁性納米材料表面；氨基化聚乙二醇的作用主要是改善磁性納米材料的生物相容性；通過將靶向基團修飾在水溶性磁性納米材料上，能夠使制得的功能磁性納米材料具有靶向腫瘤細胞的功能，其中，表皮生長因子能夠靶向腦腫瘤細胞，HER2抗體能夠靶向乳腺腫瘤細胞，PSMA抗體能夠靶向前列腺腫瘤細胞。

本發明中，磁性納米材料通過表面特異性修飾后，成為功能磁性納米材料，具有腫瘤細胞靶向功能，可以明顯增強細胞內吞效率；在超低頻旋轉磁場作用下發生自組裝，隨著磁場旋轉在細胞內部擾動，從而對癌細胞產生機械力破壞。這種機械力物理治療的方法能夠代替昂貴的藥物治療和副作用極大的放射療法。

本發明中，功能磁性納米材料對超低頻磁場的敏感度高，生物安全性好；具有靶向腫瘤細胞的功能，可以提高其在腫瘤部位富集的效率。所使用的超低頻旋轉磁場，對人體不存在負面影響。通過改變功能磁性納米材料表面的靶向基團，使其可應用于其它腫瘤的治療。

與現有技術相比，本發明具有以下特點：

1)本發明制得的功能磁性納米材料對超低頻旋轉磁場敏感，能夠避免高頻磁場對人體的不利影響，且超低頻旋轉磁場裝置具有體積小、結構簡單、成本低、操作簡便等特點；通過靶向基團的修飾，使功能磁性納米材料具有靶向腫瘤細胞的功能，在超低頻磁場作用下，能夠安全有效地殺死腫瘤細胞，且納米級的功能磁性納米材料更有利于被細胞內吞，在體內循環過程中不會堵塞血管，能夠跨過血腦屏障，大大提高了對腫瘤的治療效果；

2)通過選擇不同的靶向基團，實現對不同癌細胞、腫瘤組織的精準治療，且治療過程安全有效，不會影響到正常細胞的功能。

附圖說明

圖1為實施例1中制備得到的功能磁性納米材料的TEM圖譜；

圖2為實施例1中制備得到的功能磁性納米材料的磁化曲線圖譜；

圖3為實施例1中制備得到的功能磁性納米材料的水力學直徑分布圖譜；

圖4為實施例1中制備得到的功能磁性納米材料用于腦腫瘤細胞治療的細胞TEM圖譜；

圖中標記說明：

1—功能磁性納米材料、2—腦腫瘤細胞。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。本實施例以本發明技術方案為前提進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。

實施例1：

一種對超低頻磁場敏感的功能磁性納米材料，其制備方法如下：

(一)磁性納米材料的制備：

(1)將乙酰丙酮鋅與乙酰丙酮鐵按3:2的摩爾比加入到50mL三口燒瓶中；

(2)加入油酸和二芐醚；

(3)通入保護氣，并攪拌至固體完全分散在油酸和二芐醚中；

(4)加熱到290℃，反應30min；

(5)反應結束后，待溫度降至室溫，向反應體系中加入無水乙醇；

(6)靜置過夜，出現黑色固體沉淀，用乙醇和甲苯清洗固體沉淀數次，之后分散在甲苯中，得到磁性納米材料。

(二)功能磁性納米材料的制備：

(1)將聚丙烯酸(PAA)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入EDC和三乙胺攪拌15min活化羧基；

(2)加入多巴胺(DA)繼續攪拌過夜，反應完全后加入EDC/NHS活化羧基15min，接著加入氨基化聚乙二醇(PEG-NH₂)繼續攪拌過夜；

(3)將步驟(2)的產物透析、冷凍干燥后得到粉末產物DA-PAA-PEG；

(4)稱量等質量的磁性納米材料和DA-PAA-PEG均勻分散在的DMF中，超聲50min，磁攪拌過夜，得到水溶性磁性納米材料；

(5)將水溶性磁性納米材料溶解在pH值為4.2的MES緩沖液中，加入EDC/NHS活化15min后，加入2倍體積的堿性PBS緩沖液，接著迅速加入表皮生長因子(EGF)室溫攪拌過夜，即制得功能磁性納米材料。

對制得的功能磁性納米材料進行表征測試，具體步驟如下：

(1)將功能磁性納米材料水洗后，分散在PBS緩沖液中；

(2)進行滅菌處理后，與腦腫瘤細胞共培養24h，并用培養基洗去多余的功能磁性納米材料；

(3)將細胞暴露在超低頻磁場中，30min后觀察細胞的形貌和結構。

圖1為功能磁性納米材料的TEM圖譜，由圖1可以看出，功能磁性納米材料呈立方體狀，尺寸均一且大都分布在65nm左右，表明制備出了納米級的功能磁性納米材料。

圖2為功能磁性納米材料的磁化曲線圖譜，由圖2可以看出，功能磁性納米材料有較高的飽和磁化強度(98emu/g)。

圖3為實施例1中制備得到的功能磁性納米材料的水力學直徑分布圖譜，由圖3可以看出，功能磁性納米材料的粒徑分布均勻，且達到了納米級別。

圖4為功能磁性納米材料用于腦腫瘤細胞治療的細胞TEM圖譜，由圖4可以看出，經過功能磁性納米材料1的作用之后，腦腫瘤細胞2內的溶酶體膜結構明顯受到破壞，細胞呈現凋亡狀態。

實施例2：

一種對超低頻磁場敏感的功能磁性納米材料，其制備方法具體包括以下步驟：

(1)磁性納米材料的制備：

(1-1)分別將按摩爾比3:1稱量的乙酰丙酮鋅及乙酰丙酮鐵加入至油酸與二芐醚的混合物中，使每1mL油酸與二芐醚混合物中，加入20mg乙酰丙酮鋅，之后通入氬氣作為保護氣，攪拌至混合均勻，其中，油酸與二芐醚的體積比為1:10；

(1-2)在280℃下反應35min，冷卻后加入無水乙醇，其中，無水乙醇與步驟(1-1)中油酸與二芐醚混合物的體積比為1:4；

(1-3)靜置4h后得到固體沉淀，將該固體沉淀用乙醇洗滌后，分散于甲苯中，使每1mL甲苯中，加入8mg固體沉淀，即得到磁性納米材料；

(2)功能磁性納米材料的制備：

(2-1)將聚丙烯酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中，之后分別加入EDC及三乙胺，攪拌10min以活化聚丙烯酸的羧基，再加入多巴胺，使聚丙烯酸與多巴胺的質量比為3:7，攪拌使其充分反應，其中，每1mL N,N-二甲基甲酰胺中加入4mg聚丙烯酸，聚丙烯酸、EDC及三乙胺的質量比為18:92:1；

(2-2)加入氨基化聚乙二醇，使氨基化聚乙二醇與步驟(2-1)中多巴胺的質量比為125:21，攪拌使其充分反應，后經透析、干燥，得到多巴胺-聚丙烯酸-聚乙二醇；

(2-3)分別將按質量比1:0.8稱取的磁性納米材料及多巴胺-聚丙烯酸-聚乙二醇溶于N,N-二甲基甲酰胺中，使每1mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入1.1mg磁性納米材料，超聲40min后，攪拌使其充分反應，得到水溶性磁性納米材料；

(2-4)將水溶性磁性納米材料溶于pH值為4的MES緩沖液中，使每1mL MES緩沖液中，加入4mg水溶性磁性納米材料，之后分別加入EDC及NHS，攪拌10min以活化羧基，其中，水溶性磁性納米材料、EDC及NHS的質量比為8:45:70，之后再加入pH值為8.5的PBS緩沖液，使MES緩沖液與PBS緩沖液的體積比為1:1，之后加入表皮生長因子作為靶向基團，使靶向基團與水溶性磁性納米材料的質量比為1:17，攪拌使其充分反應，即得到功能磁性納米材料。

實施例3：

一種對超低頻磁場敏感的功能磁性納米材料，其制備方法具體包括以下步驟：

(1)磁性納米材料的制備：

(1-1)分別將按摩爾比3:3稱量的乙酰丙酮鋅及乙酰丙酮鐵加入至油酸與二芐醚的混合物中，使每1mL油酸與二芐醚混合物中，加入30mg乙酰丙酮鋅，之后通入氬氣作為保護氣，攪拌至混合均勻，其中，油酸與二芐醚的體積比為2:10；

(1-2)在300℃下反應25min，冷卻后加入無水乙醇，其中，無水乙醇與步驟(1-1)中油酸與二芐醚混合物的體積比為1:6；

(1-3)靜置12h后得到固體沉淀，將該固體沉淀用甲苯洗滌后，分散于甲苯中，使每1mL甲苯中，加入12mg固體沉淀，即得到磁性納米材料；

(2)功能磁性納米材料的制備：

(2-1)將聚丙烯酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中，之后分別加入EDC及三乙胺，攪拌20min以活化聚丙烯酸的羧基，再加入多巴胺，使聚丙烯酸與多巴胺的質量比為3:10，攪拌使其充分反應，其中，每1mL N,N-二甲基甲酰胺中加入3mg聚丙烯酸，聚丙烯酸、EDC及三乙胺的質量比為18:98:0.5；

(2-2)加入氨基化聚乙二醇，使氨基化聚乙二醇與步驟(2-1)中多巴胺的質量比為125:27，攪拌使其充分反應，后經透析、干燥，得到多巴胺-聚丙烯酸-聚乙二醇；

(2-3)分別將按質量比1:1.5稱取的磁性納米材料及多巴胺-聚丙烯酸-聚乙二醇溶于N,N-二甲基甲酰胺中，使每1mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入0.8mg磁性納米材料，超聲60min后，攪拌使其充分反應，得到水溶性磁性納米材料；

(2-4)將水溶性磁性納米材料溶于pH值為4.5的MES緩沖液中，使每1mL MES緩沖液中，加入2mg水溶性磁性納米材料，之后分別加入EDC及NHS，攪拌20min以活化羧基，其中，水溶性磁性納米材料、EDC及NHS的質量比為8:50:65，之后再加入pH值為9.5的PBS緩沖液，使MES緩沖液與PBS緩沖液的體積比為1:3，之后加入HER2抗體作為靶向基團，使靶向基團與水溶性磁性納米材料的質量比為1:23，攪拌使其充分反應，即得到功能磁性納米材料。

實施例4：

一種對超低頻磁場敏感的功能磁性納米材料，其制備方法具體包括以下步驟：

(1)磁性納米材料的制備：

(1-1)分別將按摩爾比3:2稱量的乙酰丙酮鋅及乙酰丙酮鐵加入至油酸與二芐醚的混合物中，使每1mL油酸與二芐醚混合物中，加入25mg乙酰丙酮鋅，之后通入氬氣作為保護氣，攪拌至混合均勻，其中，油酸與二芐醚的體積比為1.2:10；

(1-2)在290℃下反應30min，冷卻后加入無水乙醇，其中，無水乙醇與步驟(1-1)中油酸與二芐醚混合物的體積比為1:5；

(1-3)靜置8h后得到固體沉淀，將該固體沉淀分別用乙醇和甲苯洗滌后，分散于甲苯中，使每1mL甲苯中，加入10mg固體沉淀，即得到磁性納米材料；

(2)功能磁性納米材料的制備：

(2-1)將聚丙烯酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中，之后分別加入EDC及三乙胺，攪拌15min以活化聚丙烯酸的羧基，再加入多巴胺，使聚丙烯酸與多巴胺的質量比為3:8，攪拌使其充分反應，其中，每1mL N,N-二甲基甲酰胺中加入3.6mg聚丙烯酸，聚丙烯酸、EDC及三乙胺的質量比為18:95.85:0.76；

(2-2)加入氨基化聚乙二醇，使氨基化聚乙二醇與步驟(2-1)中多巴胺的質量比為125:24，攪拌使其充分反應，后經透析、干燥，得到多巴胺-聚丙烯酸-聚乙二醇；

(2-3)分別將按質量比1:1稱取的磁性納米材料及多巴胺-聚丙烯酸-聚乙二醇溶于N,N-二甲基甲酰胺中，使每1mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入1mg磁性納米材料，超聲50min后，攪拌使其充分反應，得到水溶性磁性納米材料；

(2-4)將水溶性磁性納米材料溶于pH值為4.3的MES緩沖液中，使每1mL MES緩沖液中，加入3mg水溶性磁性納米材料，之后分別加入EDC及NHS，攪拌15min以活化羧基，其中，水溶性磁性納米材料、EDC及NHS的質量比為8:49:69，之后再加入pH值為9的PBS緩沖液，使MES緩沖液與PBS緩沖液的體積比為1:2，之后加入PSMA抗體作為靶向基團，使靶向基團與水溶性磁性納米材料的質量比為1:20，攪拌使其充分反應，即得到功能磁性納米材料。

上述的對實施例的描述是為便于該技術領域的普通技術人員能理解和使用發明。熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經過創造性的勞動。因此，本發明不限于上述實施例，本領域技術人員根據本發明的揭示，不脫離本發明范疇所做出的改進和修改都應該在本發明的保護范圍之內。