本發(fā)明肝轉(zhuǎn)移瘤構(gòu)建領(lǐng)域，尤其涉及一種用于多模態(tài)成像研究的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

目前，用于結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的動物模型主要有種植性結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型和誘發(fā)性腫瘤模型，種植性結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型又分為原位種植性和異位種植性結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，異位種植性模型又分為門靜脈異位種植法、肝臟異位種植法、尾靜脈異位種植法。

原位種植性模型是指將腫瘤細胞懸浮液或腫瘤組織塊接種到盲腸或者結(jié)腸部位,該方法的優(yōu)點是能夠模擬結(jié)直腸癌在人體內(nèi)的擴散過程，更接近結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生及發(fā)展過程。而局限性在于“原發(fā)性”腫瘤生長和轉(zhuǎn)移需要的時間過長，原位注射手術(shù)難度較大，肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率相對較低，接種部位腫瘤組織生長過大，腸梗阻致死率高，因此限制了這種模型的應(yīng)用。

門靜脈注射法是通過直接把腫瘤細胞懸液直接注射到門靜脈形成結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，實驗動物發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的比例更高。門靜脈異位接種模型的優(yōu)勢在于(1)經(jīng)門靜脈接種腫瘤細胞株的動物模型可以模擬腫瘤通過血管擴散的過程，該模型更準(zhǔn)確地模擬了腫瘤的自發(fā)轉(zhuǎn)移過程，并能在理論上限制腹腔內(nèi)其他部位的腫瘤生長速度；(2)可重復(fù)性高，幾乎在所有動物實驗中都能產(chǎn)生肝轉(zhuǎn)移，且與原位移植模型比較，可以在更短的時間內(nèi)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。該模型缺點是：(1)未能模擬腫瘤轉(zhuǎn)移的全過程，減少了原發(fā)瘤最初侵襲周圍組織和穿入血管等步驟；(2)實驗動物生存時間相對較短；(3)不能注入過多的腫瘤細胞，否則容易出現(xiàn)肝血管栓塞而導(dǎo)致裸鼠死亡。

結(jié)腸癌肝臟異位種植模型是將結(jié)直腸癌細胞或組織塊直接種植于肝臟而形成轉(zhuǎn)移瘤。該方法成瘤率高且具有可重復(fù)性，并且并發(fā)癥概率在可接受的范圍內(nèi)，但是大部分裸鼠僅在注射部位成瘤，而周圍很少有轉(zhuǎn)移的衛(wèi)星結(jié)節(jié)，不符合臨床肝轉(zhuǎn)移瘤多發(fā)轉(zhuǎn)移的特征，不能夠準(zhǔn)確反映人體內(nèi)的真實情況，因此對于治療性干預(yù)會出現(xiàn)不同的反應(yīng)。

尾靜脈注射法直接取一定體積的結(jié)直腸癌細胞懸浮液經(jīng)裸鼠尾靜脈注入，一段時間后，觀察成瘤情況和肝轉(zhuǎn)移情況。研究表明，尾靜脈注射結(jié)直腸癌細胞懸液不能產(chǎn)生肝轉(zhuǎn)移，一般不采用這種方法造模。

轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型是應(yīng)用分子生物學(xué)手段，對實驗動物基因進行改造或修飾，從而培育出相應(yīng)腫瘤的動物模型。在轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型中，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展在理論上與原發(fā)腫瘤是一致的，且可對任何動物進行建模，但由于目前對癌基因及抑癌基因本身的研究還有待深入，建立的模型還不夠理想，短期內(nèi)很難普及，目前只能作為一種發(fā)展方向。

誘發(fā)性腫瘤模型是人為地運用各種致癌因素作用于實驗動物的特定組織或器官，從而產(chǎn)生相應(yīng)腫瘤的動物模型。目前，常用的結(jié)腸癌化學(xué)誘導(dǎo)劑有二甲肼(DMH)、乙基-亞硝基尿素(ENU)、氧化偶氮甲烷(AOM)、肼的衍生物、芳香族胺等，均可通過喂食、注射、肛門放置栓劑等途徑給藥，化學(xué)誘導(dǎo)的腫瘤屬實驗動物的原發(fā)腫瘤，其發(fā)病機制及腫瘤生長環(huán)境接近于人體原發(fā)腫瘤，建立方法相對簡單，實驗重復(fù)性好。但該方法誘導(dǎo)周期較長，肝轉(zhuǎn)移成瘤率與移植法相比也有一定差距。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種用于多模態(tài)成像研究的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型構(gòu)建方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)上述目的：

本發(fā)明包括以下步驟：

(1)選取BALB/C-nu-nu雌性裸鼠50只，每只原始體重在(17±3)g，將其分成實驗組和對照組，實驗組為40只BALB/C-nu-nu雌性裸鼠，對照組為10只BALB/C-nu-nu雌性裸鼠。

(2)模型制作之前一周為穩(wěn)定期，禁止對裸鼠進行一切刺激性的操作，實驗組實驗前裸鼠禁食進水12小時，細胞室制作細胞懸液，濃度為2.5×10⁷/ml。裸鼠用10％的水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉劑劑量0.004ml/g，麻醉后仰臥位固定于手術(shù)板上，左上腹縱形切口，進腹后游離脾臟并拉至切口外，用5號針從脾臟下極進針穿刺脾臟，從脾臟下極穿刺脾臟后針頭向脾臟上極方向推進，進針長度約1cm，緩慢注入結(jié)腸癌細胞0.1ml不等，可見脾包膜鼓起變白，注射時間約3min，注射結(jié)束后待脾臟顏色轉(zhuǎn)紅，快速拔出針頭后用75％的酒精按壓止血，并用生理鹽水沖洗，確保無明顯出血及癌細胞溢出，盡量避免腹腔內(nèi)的種植轉(zhuǎn)移，最后把脾臟放回腹腔內(nèi)，縫合傷口；

(3)對照組脾臟內(nèi)注射無菌PBS，余操作同實驗組。

(4)模型制作完畢后，繼續(xù)在SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，并定期測量裸鼠的體重及觀察裸鼠的精神狀況，飼養(yǎng)七周后，實驗組中的裸鼠即成為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明是一種用于多模態(tài)成像研究的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型構(gòu)建方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明為肝轉(zhuǎn)移瘤動物模型的構(gòu)建提供了一種與現(xiàn)有技術(shù)不同構(gòu)思的新方法。

2、實驗表明(見實施例2、實施例3)，所構(gòu)建的裸鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型經(jīng)脾種植經(jīng)門靜脈轉(zhuǎn)移到肝臟，組織病理學(xué)與人結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤相似，為肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)：具有典型肝轉(zhuǎn)移瘤臨床特征，如：黃疸、乏力、納差等癥狀。

3、由于本發(fā)明所述方法構(gòu)建的裸鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型很好的模擬了人肝轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，因而可以用于研究人的肝轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)病機制。

4、將本發(fā)明所述方法構(gòu)建的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型采用CT、磁共振、超聲和PET成像等多種模態(tài)成像，可觀察肝轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，肝轉(zhuǎn)移瘤不同發(fā)展階段的多種模態(tài)成像成像特點：評估藥物及其他治療措施對脾原發(fā)灶及其轉(zhuǎn)移灶的預(yù)防作用和療效。

5、由于所用的人結(jié)直腸癌細胞(HT29)其濃度為2.5×10⁷/ml，所用劑量為0.1ml，只需一次性將細胞懸液注入脾臟既可以得到肝轉(zhuǎn)移模型，因而本發(fā)明所述方法操作簡單，造模成功率高，具有一定的經(jīng)濟和實用價值，值得推廣。

附圖說明

圖1本發(fā)明所述方法的裸鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型的超聲圖像，圖1A、圖1B是肝臟超聲掃查，肝內(nèi)見強回聲結(jié)節(jié)及腫塊，大小不等，邊界清楚，部分周邊可見聲暈；

圖2本發(fā)明所述方法的裸鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型的CT圖像，肝內(nèi)血管和肝實質(zhì)均明顯強化，而肝內(nèi)癌結(jié)節(jié)無強化，在此時間內(nèi)掃描，可以將肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)與肝內(nèi)血管影進行鑒別。早期肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)和脾原位結(jié)節(jié)的增強Micro-CT圖像(紅箭頭所示腫瘤結(jié)節(jié))；

圖3本發(fā)明所述方法的裸鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型的MRI圖像，圖3A是T2WI序列橫斷面，圖3B是T2WI序列冠狀位。肝臟可見多發(fā)異常信號，病灶邊界尚清晰，T2WI序列呈略高信號，其內(nèi)信號略不均勻；脾臟內(nèi)亦可見高信號原位腫瘤；

圖4本發(fā)明所述方法的裸鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型的PET圖像，圖4A是裸鼠¹⁸F-FDG PET圖像可見肝臟多發(fā)高攝取區(qū)域，圖4B¹⁸F-FB-NGA PET圖像可見肝臟內(nèi)充盈缺損；

圖5是本發(fā)明所述方法構(gòu)建的裸鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型經(jīng)腹部縱行正中切口剖腹后，腹腔內(nèi)的情況，肝臟內(nèi)可見多個占位，脾臟內(nèi)亦可見原位腫瘤；

圖6是將本發(fā)明所述方法構(gòu)建的裸鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型的肝轉(zhuǎn)移瘤完整取下，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為10％的福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色(10×10)和大體病理圖像。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明：

實驗動物與材料

實驗動物：BALB/C-nu-nu裸鼠，雌性，5周齡，飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級動物實驗室。

腫瘤細胞：HT-29細胞株。

實驗所用的PBS及胰蛋白酶消化液均自行配置且經(jīng)無菌處理。

本發(fā)明包括以下步驟：

(1)選取BALB/C-nu-nu雌性裸鼠50只，每只原始體重在(17±3)g，將其分成實驗組和對照組，實驗組為40只BALB/C-nu-nu雌性裸鼠，對照組為10只BALB/C-nu-nu雌性裸鼠。

(2)模型制作之前一周為穩(wěn)定期，禁止對裸鼠進行一切刺激性的操作，實驗組實驗前裸鼠禁食進水12小時，細胞室制作細胞懸液，濃度為2.5×10⁷/ml。裸鼠用10％的水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉劑劑量0.004ml/g，麻醉后仰臥位固定于手術(shù)板上，左上腹縱形切口，進腹后游離脾臟并拉至切口外，用5號針從脾臟下極進針穿刺脾臟，從脾臟下極穿刺脾臟后針頭向脾臟上極方向推進，進針長度約1cm，緩慢注入結(jié)腸癌細胞0.1ml不等，可見脾包膜鼓起變白，注射時間約3min，注射結(jié)束后待脾臟顏色轉(zhuǎn)紅，快速拔出針頭后用75％的酒精按壓止血，并用生理鹽水沖洗，確保無明顯出血及癌細胞溢出，盡量避免腹腔內(nèi)的種植轉(zhuǎn)移，最后把脾臟放回腹腔內(nèi)，縫合傷口；

(3)對照組脾臟內(nèi)注射無菌PBS，余操作同實驗組。

(4)模型制作完畢后，繼續(xù)在SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，并定期測量裸鼠的體重及觀察裸鼠的精神狀況，飼養(yǎng)七周后，實驗組中的裸鼠即成為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型。

實施例1

實驗動物與材料、設(shè)備

實驗動物：實施例1構(gòu)建的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的動物模型。

無水乙醚:天津市富宇精細化工有限公司。

超聲設(shè)備：型號：PHILIPS HD15，荷蘭philips公司生產(chǎn)。

實驗方法

對本發(fā)明構(gòu)建的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型進行肝臟超聲掃查，操作如下：

(1)檢查者帶無菌手套，用無水乙醚對實驗組裸鼠進行麻醉，麻醉好后用醫(yī)用膠帶將裸鼠固定于自制的檢查板上。

用超聲設(shè)備對裸鼠進行掃查，所用探頭為L15-7io淺表探頭，對肝臟異常回聲記錄，并測量大小后采集圖像。

超聲檢查顯示，肝內(nèi)見強回聲結(jié)節(jié)及腫塊，大小不等，邊界清楚，部分周邊可見聲暈。(見圖1A-圖1B)。

實施例2

實驗動物與材料、設(shè)備

實驗動物：實施例1構(gòu)建的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的動物模型。

異氟烷：上海雅培制藥有限公司；氧氣：無錫市蠡園醫(yī)用氧氣有限責(zé)任公司。小動物麻醉機：美國Stoelting Kopf/50262；Micro-CT：德國西門子公司。

實驗方法

對本發(fā)明構(gòu)建的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型進行肝臟掃查，操作如下：

(1)顯像前將裸鼠在小動物麻醉機上用混用3％(體積分數(shù))異氟烷的氧氣麻醉，顯像過程中維持含1％(體積分數(shù))異氟烷的氧氣麻醉，俯臥位頭先進的體位固定于掃描床上。

(2)采用的造影劑為Fenestra LC，造影劑用量為0.4ml/20g，每次掃描采取的增強方式：注入造影劑后1小時、3小時、4小時和24小時進行掃描。

(3)掃描結(jié)束后，將圖像傳至工作站，進行圖像分析。

Micro CT顯示注入造影后1小時—3小時，肝內(nèi)血管和肝實質(zhì)均明顯強化，而肝內(nèi)癌結(jié)節(jié)無強化，在此時間內(nèi)掃描，可以將肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)與肝內(nèi)血管影進行鑒別。(見圖2)

實施例3

實驗動物與材料、設(shè)備

實驗動物：實施例1構(gòu)建的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的動物模型。

異氟烷：上海雅培制藥有限公司；氧氣：無錫市蠡園醫(yī)用氧氣有限責(zé)任公司。

小動物麻醉機：美國Stoelting Kopf/50262；Micro-MRI:型號BRUKER 7.0T Biospec 70/20USR。

實驗方法

對實施例1構(gòu)建的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型進行磁共振肝臟橫斷位及冠狀位掃查，操作如下：

(1)顯像前將裸鼠在小動物麻醉機上用混用3％(體積分數(shù))異氟烷的氧氣麻醉，顯像過程中維持含1％(體積分數(shù))異氟烷的氧氣麻醉，俯臥位頭先進的體位固定于掃描床上。

(2)用MR成像儀對裸鼠進行核磁共振掃描，掃描序列：T2WI橫斷面及冠狀位。掃描結(jié)束后，將核磁共振掃描圖像傳至工作站進行測量。

核磁共振掃描顯示，肝臟可見多發(fā)異常信號，病灶邊界尚清晰，T2WI序列呈略高混雜信號。(見圖3A、圖3B)

實施例4

實驗動物與材料、設(shè)備

實驗動物：實施例1構(gòu)建的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的動物模型。

異氟烷：上海雅培制藥有限公司；氧氣：無錫市蠡園醫(yī)用氧氣有限責(zé)任公司。

小動物麻醉機：美國Stoelting Kopf/50262；Micro-PET：德國西門子/Inveon Dedicate。

實驗方法

對實施例1構(gòu)建的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型進行PET顯像，操作如下：

(1)顯像前將裸鼠在小動物麻醉機上用混用3％(體積分數(shù))異氟烷的氧氣麻醉，顯像過程中維持含1％(體積分數(shù))異氟烷的氧氣麻醉。

(2)麻醉好的裸鼠模型通過尾靜脈注射100μci的同位素0.2ml，俯臥位頭先進的體位固定于掃描床上，于注射藥物的一小時后行掃描(¹⁸F-FDG)，20分鐘(¹⁸F-FB-NGA)。PET顯像結(jié)果通過Siemens Invenon系統(tǒng)采集，顯像時間為十分鐘，所得數(shù)據(jù)用ASIPro VM軟件分析處理掃描結(jié)束后，將PET掃描圖像傳至工作站進行測量。

核磁共振掃描顯示，¹⁸F-FDG PET圖像可見肝臟多發(fā)高攝取區(qū)域(見圖4A),¹⁸F-FB-NGA PET圖像可見肝臟內(nèi)充盈缺損。(見圖4B)

實施例5

實例4結(jié)束后，裸鼠脫臼法處死。術(shù)者帶無菌手套，持手術(shù)剪，鑷子，經(jīng)模型鼠腹部正中切口剖腹，暴露出的肝臟見圖5。

完整取下肝臟，質(zhì)量分數(shù)為10％的福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察，如圖6所示：癌組織形態(tài)不一，多呈橢圓形，胞漿豐富，核大、深染、畸形，核分裂象多見，呈彌漫性、浸潤性生長，癌細胞間有結(jié)締組織浸潤。對照組模型按照實例2、實例3、實例4、實例5和實例6的方法進行操作，各種影像檢查及解剖后組織觀察均未見腫瘤形成。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。