本發明涉及中藥領域、飼料添加劑和水產疾病防控領域，具體涉及一種由純中藥制成用于防治肝膽疾病的飼料預混劑及其制備方法。
背景技術：
隨著現代農業的發展和農業科技的進步，水產養殖業也取得了迅猛發展。但是隨著高密度，集約化養殖模式的出現，養殖水體環境日趨惡化，加大了水產疾病的誘發幾率，同時由于飼料營養不均衡，藥物濫用等原因，進一步導致水產病害的暴發，其中以肝膽疾患最為典型，即肝膽綜合征，該類疾病是水產養殖中最常見危害較大的非傳染性、非寄生性因素引起的肝臟損傷、肝功能障礙性疾病。在集約化高密度養殖模式下，一旦發生肝損傷及肝膽綜合征等疾病，便會出現大規模和整體性死亡現象，死亡率高達80％～90％。由于該類疾病大多為累積性損傷引發的慢性病，在早期很容易被忽略。但隨著病情的發展，出現一些肝膽腫大變色，體表發炎，腮絲變色，潰爛，內臟出血并出現死亡現象時，則說明病情已經非常嚴重，此時再實施治療難度相當大。
目前用于治療水產動物肝膽系統疾病的藥物種類很多，其中大部分均為西藥，根據臨床應用情況，西藥對肝膽疾病有一定的治療作用，但作用單一，容易出現副作用和抗藥性等問題。而中藥利用辨證施治的治療方法對整體進行調理，以到達防病治病的目的，有效避免了上述問題。但是由于市場中中藥產品多為中藥原料經過粉碎后復配而成，藥物的消化吸收率低，有效成分不能充分利用，導致臨床使用療程長，見效慢。為此有些廠家將中藥和西藥以組合的形式進行使用，固然提高了治療效果，但仍然無法規避耐藥性方面的問題。
本發明以中醫藥理論為指導，對肝膽疾病治療有顯著效果的傳統處方進行精簡優化，篩選出一個由8味中藥材組成的一種對水產動物肝膽損傷有顯著修復效果的中藥處方，并從中藥的有效成分入手，利用高溫回流提取、膜過濾純化技術和低壓濃縮技術，將中藥的有效成分充分解離出來，再通過固體吸附工藝和烘干粉碎工藝，制備成飼料預混劑。有效克服了中藥材中有效成分被纖維物質包裹而無法被充分吸收利用的弊端，減少了用藥量，保證水產動物的適口性，更加具有針對性。目前該產品已經開始車間大規模生產，并在水產養殖市場中推廣應用，市場反饋良好，并得到廣大養殖戶的廣泛認可。
技術實現要素：
本發明提供了一種防治水產動物肝膽疾病的飼料預混劑，用于水產動物肝膽疾病的防控和治療，避免因肝損傷而引發的其他疾病，減少水產動物病害的發生。
本發明還提供了一種防治水產動物肝膽疾病的飼料預混劑的制備方法，其特征在于：該產品的處方組分主要由以下成分構成，大青葉40-60份，甘草10-20份，大黃20-40份，連翹10-20份，茵陳10-20份，白芍10-20份，牡丹皮10-20份，藿香10-20份。
該工藝其特征在于：按照權利要求1中的組方配比，加入8～12倍的50％～80％乙醇溶液，回流提取2～3次，每次1～3h，回流溫度50℃～80℃。對提取溶液在線高速離心，棄去沉淀，離心溶液經微孔濾膜與超微濾膜過濾，50℃～80℃減壓濃縮至與原藥材同等份量，加入1～3倍量的米糠對濃縮液進行吸附，于70℃～90℃烘干箱內烘至干燥，粉碎后即得產品。
工藝步驟如下：
(1)本飼料預混劑先將8種藥材粉碎成粗粉，按照處方比例稱取藥材粗粉，投于回流提取罐內。
(2)將配制完畢的50％～80％的乙醇溶液按照8～12倍量體積注入回流提取罐內，密封，升溫至50℃～80℃，回流提取2～3次，每次1～3h。
(3)將回流提取液迅速冷卻至室溫，以4000～10000rpm在線高速離心，離心液經膜過濾，50℃～80℃低壓濃縮體積至與原藥材同等份量。
(4)利用1～3倍量的米糠為輔料吸附濃縮液，于混料罐中充分混合后置于70℃～90℃烘干箱內烘至干燥，粉碎后即得產品。
其中，步驟(3)離心液經膜過濾，首先將離心液進行孔徑大小為0.5～0.9μm微膜過濾，過膜壓力為0.1～0.3MPa，微膜過濾的作用在于：除去不溶性的微顆粒雜質，純化提取液，提高活性物質純度，保護后面的超濾膜。該工藝中所使用的超濾膜的截留分子量為50000～100000道爾頓，主要目的在于截留分子量高于50000～100000道爾頓的高分子雜質(如高分子蛋白和多糖等)，提高提取物活性物質的純度，結果表明經超濾膜過濾后的提取產品在臨床試驗效果明顯好于未過濾的產品。
本發明與現有的防治水產動物肝膽疾病的中藥工藝相比具有以下優勢：
1.首次將大青葉、甘草、大黃、連翹、茵陳、白芍、牡丹皮、藿香混合提取物應用到水產動物肝膽疾病的防治領域，尤其是增加牡丹皮和藿香后對藥物的防治效果更顯著。
2.利用回流醇提技術，顯著提高大黃酸、靛玉紅和甘草酸等活性成分的提取得率，保證產品在市場中的應用效果。
3.利用微濾膜和超濾膜分級純化，顯著提高活性物質純度，增強產品藥效，降低養殖應用成本。
4.本產品能夠預防水產動物肝膽疾病的發生，顯著降低肝膽疾病暴發后的死亡率。
5.本產品為純中藥植物飼料預混劑，安全無毒副作用，不產生耐藥性。
附圖說明
附圖為本發明提取生產中藥飼料預混劑的工藝流程圖
具體實施方式
下面結合具體的實施例對本發明作進一步說明，但并不僅局限于此。
實施例1
處方配比：大青葉60份，甘草10份，大黃20份，連翹20份，茵陳10份，白芍10份。
將配制完畢的65％的乙醇溶液按照10倍量體積注入提取罐內，密封后，升溫至80℃，回流提取3次，每次1h。將回流提取液迅速冷卻至室溫，以8000rpm在線高速離心，50℃低壓濃縮體積至與原藥材同等份量。利用1倍量的米糠為輔料吸附濃縮液，于混料罐中充分混合后置于70℃烘干箱內烘干，粉碎后即得產品。
實施例2
處方配比：大青葉50份，甘草10份，大黃30份，連翹20份，茵陳10份，白芍10份，牡丹皮10份，藿香10份。
將配制完畢的65％的乙醇溶液按照10倍量體積注入提取罐內，密封后，升溫至80℃，回流提取3次，每次1h。將回流提取液迅速冷卻至室溫，以8000rpm在線高速離心，離心液于50℃低壓濃縮體積至與原藥材同等份量。利用1倍量的米糠為輔料吸附濃縮液，于混料罐中充分混合后置于70℃烘干箱內烘干，粉碎后即得產品。
實施例3
處方配比：大青葉40份，甘草20份，大黃40份，連翹20份，茵陳10份，白芍10份，牡丹皮10份，藿香10份。
將配制完畢的65％的乙醇溶液按照10倍量體積注入提取罐內，密封后，升溫至80℃，回流提取3次，每次1h。將回流提取液迅速冷卻至室溫，以8000rpm在線高速離心，離心液經0.5μm微膜過濾，再經截留分子量50000超濾膜純化，50℃低壓濃縮體積至與原藥材同等份量。利用1倍量的米糠為輔料吸附濃縮液，于混料罐中充分混合后置于70℃烘干箱內烘干，粉碎后即得產品。
實施例4
處方配比：大青葉40份，甘草20份，大黃20份，連翹20份，茵陳20份，白芍20份，牡丹皮20份，藿香20份。
將配制完畢的65％的乙醇溶液按照10倍量體積注入提取罐內，密封后，升溫至80℃，回流提取3次，每次1h。將回流提取液迅速冷卻至室溫，以8000rpm在線高速離心，離心液經0.5μm微膜過濾，再經截留分子量50000超濾膜純化，50℃低壓濃縮體積至與原藥材同等份量。利用1倍量的米糠為輔料吸附濃縮液，于混料罐中充分混合后置于70℃烘干箱內烘干，粉碎后即得產品。
實施例5
處方配比：大青葉60份，甘草20份，大黃20份，連翹20份，茵陳10份，白芍10份，牡丹皮10份，藿香10份。
將配制完畢的65％的乙醇溶液按照10倍量體積注入提取罐內，密封后，升溫至80℃，回流提取3次，每次1h。將回流提取液迅速冷卻至室溫，以8000rpm在線高速離心，離心液經0.5μm微膜過濾，再經截留分子量50000超濾膜純化，50℃低壓濃縮體積至與原藥材同等份量。利用1倍量的米糠為輔料吸附濃縮液，于混料罐中充分混合后置于70℃烘干箱內烘干，粉碎后即得產品。
實施例6
處方配比：大青葉50份，甘草20份，大黃20份，連翹20份，茵陳20份，白芍20份，牡丹皮20份，藿香20份。
將配制完畢的65％的乙醇溶液按照8倍量體積注入提取罐內，密封后，升溫至60℃，回流提取2次，每次1.5h。將回流提取液迅速冷卻至室溫，以4000rpm在線高速離心，離心液經0.5μm微膜過濾，再經截留分子量50000超濾膜純化，60℃低壓濃縮體積至與原藥材同等份量。利用1倍量的米糠為輔料吸附濃縮液，于混料罐中充分混合后置于70℃烘干箱內烘干，粉碎后即得產品。
實施例7
處方配比：大青葉40份，甘草20份，大黃40份，連翹20份，茵陳20份，白芍20份，牡丹皮20份，藿香20份。
將配制完畢的65％的乙醇溶液按照10倍量體積注入提取罐內，密封后，升溫至100℃，回流提取2次，每次2h。將回流提取液迅速冷卻至室溫，以10000rpm在線高速離心，離心液經0.5μm微膜過濾，再經截留分子量50000超濾膜純化，80℃低壓濃縮體積至與原藥材同等份量。利用1倍量的米糠為輔料吸附濃縮液，于混料罐中充分混合后置于70℃烘干箱內烘干，粉碎后即得產品。
1.產品對水產動物肝損傷疾病防治試驗研究：
1.1試驗設計和試驗飼料
本試驗在基礎日糧中添加本發明產品，由北京生泰爾科技股份有限公司提供。飼喂基礎日糧為對照組；發明產品添加量設定為0.2％，具體飼料營養水平和試驗設計見表1、2。
表1飼料組分及營養水平表
表2臨床試驗設計表
1.2試驗動物及飼養
試驗魚來自重慶市榮昌縣梅石壩漁場的1齡草魚魚種。在室內水泥池進行馴養1周，使用空白組混合飼料進行投喂。試驗開始前24h停飼，選取體格健壯、規格均勻的個體，稱重后隨機放入各自魚缸中并編號，每缸30尾。每組設3個平行，生長試驗持續56d，每天早中晚投喂3次，投餌率為3-5％。
1.3指標測定
增重率＝(每尾終試平均體重-每尾始試平均體重)/每尾始試平均體重×100％
餌料系數＝魚總增重量/總投餌量×100％
蛋白效率＝(體重增加量/飼料攝取量×蛋白質含量)×100％
成活率＝成活的數量/總數量×100％
魚靜脈取血注入EP管，離心(4000r/min，10min)，取血清用于各指標測定。超氧化物歧化酶(SOD)活性(參照Misra和Fridovich方法)測定；過氧化氫酶(CAT)活性(參照Aebi方法)；丙二醛含量(參照Mertens方法)，谷草轉氨酶(谷草轉氨酶檢測試劑盒)，谷丙轉氨酶(谷丙轉氨酶檢測試劑盒)。
1.4注射感染
養殖試驗結束后，每缸取20尾草魚，以腹腔注射的方式使草魚感染腸型點狀產氣單孢菌。試驗菌株取自上海海洋大學農業部漁業動植物病原庫，菌株號：ST 78-3-3。將腸型點狀產氣單孢菌涂布于營養瓊脂上，28℃下培養過夜，以制備菌懸液。梯度稀釋制備菌懸液：用0.9％的無菌生理鹽水將腸型點狀產氣單孢菌從營養瓊脂平板上洗下菌落，采用活菌直接鏡檢計數法計數菌數，推算出菌懸液的活菌數，并將上述懸液稀釋得到107cfu/ml。空白對照每尾魚注射0.1mL無菌生理鹽水，原試驗缸的各組魚為空白對照，并對最終死亡率作折算。
1.5試驗結果與統計分析
1.5.1產品對草魚生長性能的影響
按照臨床試驗設定試驗流程和觀察指標進行試驗，具體試驗結果見表3。
表3產品對草魚生長性能的影響(平均值±標準誤)(％濕重)
從表3可知，在草魚飼料中添加0.2％的實施例產品后，各檢測指標均有明顯好轉，其中實施例1的試驗效果相比于其他實施例組較差，同時在實施例1組配方中增加牡丹皮和藿香后的各試驗組對草魚生長性能的改善作用顯著，在此基礎上經過膜過濾后的實施例組產品，在增重率、餌料系數和蛋白效率與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)，成活率均達到96％以上。說明專利產品在防治肝膽綜合征疾病時對生長性能未造成副作用影響，相反，對草魚的快速生長起到一定的促進作用，有效降低死亡率。
1.5.2產品對草魚抗氧化指標的影響試驗結果
本試驗對飼喂專利產品后的草魚抗氧化指標進行了檢測，主要檢測了超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、丙二醛含量，具體檢測結果見表4。
表4草魚抗氧化指標檢測結果
從表4結果中可以看出，在草魚飼料中添加實施例1-7產品后，各個免疫指標均呈現較明顯的改善趨勢，相對于空白對照組，各實施例組在增強機體抗氧化性方面起到積極作用，尤其是超氧化物歧化酶和丙二醛指標表現出顯著性差異(P<0.05)；同時，實施例3-7的作用效果較為明顯，增強了肝臟解毒排毒的功能，說明在原配方基礎上增加牡丹皮和藿香兩味中藥并經膜過濾后的實施例組產品更充分的發揮其藥效作用。總體說明，在飼料中添加專利產品有助于加強抗氧化機能，增強機體免疫力，同時降低肝膽綜合征疾病的出現幾率。
1.5.3產品對草魚抗病能力的影響
對飼喂專利產品后的草魚進行攻毒試驗，持續觀察死亡情況，統計死亡數據，并檢測各試驗組魚血清中谷草轉氨酶活性和谷丙轉氨酶活性，比較各組之間的差異，具體試驗結果見表5。
表5攻毒后草魚的存活率％
草魚感染腸型點狀產氣單孢菌后第1d各組均無草魚死亡，第2d開始表現出明顯的發病癥狀，腸道充血，體表有出血點。到第14d，空白對照組感染腸型點狀產氣單胞菌的最終存活率為60.0％；而各實施例組的存活率均高于空白對照組，說明在飼料中添加實施例產品能夠有效降低由腸型點狀產氣單孢菌感染導致的肝膽綜合征疾病造成的死亡率。同時對各試驗組剩余草魚血清中GOT和GPT酶活性進行檢測，發現飼喂了實施例組產品的草魚血清中兩種酶活性要比空白對照組低，其中實施例2～7組差異明顯(P<0.05)，說明在魚體中感染了腸型點狀產氣單孢菌后對草魚的肝臟造成一定的損害，使得此兩種酶活水平較高；而飼喂了實施例組產品后，兩種酶活性降低，說明產品對緩解草魚的肝臟損傷起到明顯作用。
2.產品對水產動物肝損傷疾病防治的大區臨床應用試驗：
案例1
本試驗在基礎日糧中添加實施例3產品，由北京生泰爾科技股份有限公司提供。
試驗地點為浙江省湖州市某草魚養殖基地，養殖面積10畝，水深1.2米。
魚體病癥：草魚攝食量減少，甚至停食，有死亡情況出現，經剖解發現，腸壁充血發炎、輕按有膿液流出，肝臟腫大并變色，經鑒定可能是由腸型點狀產氣單孢菌致病菌引起的肝膽綜合征。
治療方案：按照每百公斤飼料中添加200g供試產品，1天2次，連續用藥4天，第2天基本無死亡情況，攝食情況正常，4天之后病魚的肝膽癥狀全部消失。
案例2
本試驗在基礎日糧中添加實施例4產品，由北京生泰爾科技股份有限公司提供。
試驗地點為湖南常德市安鄉縣官當鎮某漁場，養殖面積20畝，水深1.4米。
魚體病癥：長期有零星死亡，近期死亡數量上升，鏡檢下頜有輕微出血，尾鰭末端腐爛，鰓絲紅腫，肛門紅腫，解刨肝臟白綠相間色，易碎，膽囊腫大，腸道有食有膿液。經鑒定有嗜水氣單胞菌感染跡象。
治療方案：按照每百公斤飼料中添加200g供試產品，1天2次，連續用藥5天，第3天死亡情況開始明顯減少，攝食情況正常，第5天未出現死魚情況，剖檢后病魚的肝膽癥狀全部消失。
案例3
本試驗在基礎日糧中添加實施例5產品，由北京生泰爾科技股份有限公司提供。
試驗地點為浙江省紹興市某羅非魚養殖廠，養殖面積35畝，水深1.0米。
魚體病癥：病魚食欲減退，鰓蓋暗紅、眼睛發白渾濁，肛門紅腫，經剖解發現，肝臟腫大充血，呈黃白色、部分綠色，比較脆弱，腸道有輕微充血發炎，經檢測可能是由鏈球菌引起的肝膽綜合征。
治療方案：按照每百公斤飼料中添加200g供試產品，1天2次，連續用藥7天，死亡情況消失，攝食情況也有明顯改善，經剖檢大部分草魚肝膽綜合癥狀消失。
案例4
本試驗在基礎日糧中添加實施例6產品，由北京生泰爾科技股份有限公司提供。
試驗地點為廣東省湛江某漁場，養殖面積24畝，水深1.3米。
魚體病癥：草魚開口變差，攝食量明顯下降，經過解剖未發現明顯器官病灶，個別魚肝臟腫脹，所以初斷魚攝食不佳的原因為本身體質下降，肝臟及腸道出現問題。
治療方案：按照每百公斤飼料中添加200g供試產品，1天2次，連續用藥3天，攝食情況也有明顯改善，后期連續陰雨天也未影響草魚的攝食，池塘水面動靜很大，魚較活躍。
案例5
本試驗在基礎日糧中添加實施例7產品，由北京生泰爾科技股份有限公司提供。
試驗地點為湖北省潛江市某水產養殖服務中心，養殖面積3畝，水深1.5米。
魚體病癥：死魚體表完好、鰓正常、眼球凸出，解剖發現腹內有少量腹水、肝臟蒼白、局部花肝、局部變綠，膽囊腫大，無充血現象，撥開魚皮，肌肉有充血。初步診斷草魚的病癥主要由病毒性引起的。
治療方案：按照每百公斤飼料中添加200g供試產品，1天2次，連續用藥5天，死亡情況有所好轉，但攝食情況不佳，經剖檢發現草魚肝臟仍存在異常，肝膽綜合癥狀未完全消失。
由上述臨床試驗發現，本產品在防治由細菌引起的肝膽綜合征方面能夠起到良好的治療效果，病魚能在短時間內恢復正常；但是在解決由病毒引起的肝膽綜合征方面，治療周期較長，最終治療效果也不太理想。所以本產品在用于防治由細菌引起的肝膽綜合征方面效果最理想。