本發(fā)明屬于腫瘤用藥物及其應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種防止胰腺癌的中藥組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：胰腺癌是一種惡性程度極高的腫瘤，其五年生存率迄今仍低于6％。轉(zhuǎn)移是胰腺癌發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，早期轉(zhuǎn)移是其中的重要特點，腫瘤的轉(zhuǎn)移是多因素調(diào)節(jié)的動態(tài)的復(fù)雜過程。迄今為止，低毒高效的抗胰腺癌藥物仍是抗癌藥物中的研究熱點之一。中醫(yī)藥具有千百年的應(yīng)用基礎(chǔ)，具有許多潛在的高效抗癌藥物，但天然藥物具有多靶點及成分復(fù)雜等特點，活性成分的篩選及作用機制的研究或可進(jìn)一步提高其作用降低其毒性。中藥可作用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，擁有安全性高、價格低廉、不良反應(yīng)少等優(yōu)點，在抗腫瘤方面取得了可喜的成就。中藥治療惡性腫瘤，無論是在減輕臨床癥狀、防止復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、延長生存期、提高生存質(zhì)量，還是在與放化療配合、增效減毒等方面都呈現(xiàn)出較好的療效。對于惡性腫瘤的治療，西醫(yī)以外科手術(shù)、放療、化療目前為三大基本手段。然而外科手術(shù)不但給病人帶來巨大的生理和心理上的痛苦，而且其遠(yuǎn)期療效也不盡人意。放療和化療的非特異性殺滅腫瘤細(xì)胞的作用導(dǎo)致正常細(xì)胞和臟器損害無法避免，以至于有些患者并非死于癌癥本身，而是間接的死于放療和化療藥物所帶來的毒副反應(yīng)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種治療惡性腫瘤的中藥組合物及其應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：本發(fā)明的一種防治胰腺癌的中藥組合物，所述中藥組合物按質(zhì)量份數(shù)30-40份北豆根、15-25份地龍、30-50份黃芪、10-20份西洋參及15-25份五靈脂制成。本發(fā)明的一種防治胰腺癌的中藥組合物的應(yīng)用，它用于防治胰腺癌。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果是：(1)本發(fā)明的組合物全方具有清熱解毒、通絡(luò)平喘、利尿固表、抗毒排膿、補氣養(yǎng)陰、活血止痛的功效，經(jīng)臨床驗證療效滿意；(2)北豆根清熱解毒、消腫止痛，地龍清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿；黃芪補氣固表、利尿生肌、抗毒排膿；西洋參補氣養(yǎng)陰、清熱生津；五靈脂活血止痛、化瘀止血、消積解毒，諸藥配伍共奏具有清熱解毒通絡(luò)平喘利尿；補氣固表抗毒排膿；補氣養(yǎng)陰活血止痛之效。(3)通過研究該中藥組合物對體外腫瘤模型的抗腫瘤作用及作用機制，為進(jìn)一步研發(fā)治療惡性腫瘤的中藥新藥提供客觀依據(jù)，為研發(fā)出作用機制明確安全有效的抗腫瘤中藥新藥奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景；附圖說明圖1為高劑量中藥組合物對胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡率的影響圖；圖2為低劑量中藥組合物對胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡率的影響圖；圖3為5-FU對胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡率的影響圖；圖4為對照組的胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡率情況圖；圖5為高劑量中藥組合物對胰腺癌PANC-1細(xì)胞周期的影響圖；圖6為低劑量中藥組合物對胰腺癌PANC-1細(xì)胞周期的影響圖；圖7為5-FU對胰腺癌PANC-1細(xì)胞周期的影響圖；圖8為對照組的胰腺癌PANC-1細(xì)胞周期的情況圖；具體實施方式下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。具體實施方式一：本實施方式記載的是一種防治胰腺癌的中藥組合物，所述的中藥組合物按質(zhì)量份數(shù)30-40份北豆根、15-25份地龍、30-50份黃芪、10-20份西洋參及15-25份五靈脂制成。具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：本實施方式的一種防治胰腺癌的中藥組合物按質(zhì)量份數(shù)由33-37份北豆根、17-23份地龍、35-45份黃芪、13-17份西洋參及17-23份五靈脂制成。具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式二不同的是：本實施方式的一種防治胰腺癌的中藥組合物按質(zhì)量份數(shù)由35份北豆根、20份地龍、40份黃芪、15份西洋參及20份五靈脂制成。具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一不同的是：本實施方式的一種防治胰腺癌的中藥組合物按質(zhì)量份數(shù)由30份北豆根、15份地龍、30份黃芪、10份西洋參及15份五靈脂制成。具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一不同的是：本實施方式的一種防治胰腺癌的中藥組合物按質(zhì)量份數(shù)由40份北豆根、25份地龍、50份黃芪、20份西洋參及25份五靈脂制成。具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一不同的是：本實施方式的一種防治胰腺癌的中藥組合物制成水煎劑，具體方法是：按下述質(zhì)量份數(shù)取30-40份北豆根、15-25份地龍、30-50份黃芪、10-20份西洋參及15-25份五靈脂將上述原料藥用蒸餾水浸泡1h后，煎煮2次，每次加入1L蒸餾水且每次煎煮30min，兩次水煎藥液混勻后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至100mL，制成水煎劑，并用4℃保存。具體實施方式七：本實施方式記載的是一種防治胰腺癌的中藥組合物的應(yīng)用，它用于防治胰腺癌。本發(fā)明中的各原料藥粉碎后加入制劑成型所需的輔料，按照藥物制劑常規(guī)方法還可以做成臨床上適宜的各種制劑，譬如膠囊劑、丸劑、顆粒劑、片劑或口服液。上述制劑的制備方法屬于常規(guī)制劑方法，在此無需贅述。實施例1：臨床研究所用的中藥組合物按照以下方法制備：按以下質(zhì)量份數(shù)稱取各原料藥：30-40份北豆根、15-25份地龍、30-50份黃芪、10-20份西洋參及15-25份五靈脂。將上述原料藥用蒸餾水浸泡1h后，煎煮2次，每次加入1L蒸餾水且每次煎煮30min，兩次水煎藥液混勻后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至100mL，制成水煎劑，并用4℃保存，用于以下研究：1.資料與方法1.1入選標(biāo)準(zhǔn)：62例病人均為2014年5月-2015年4月在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院住院治療的消化道惡性腫瘤病人。全部病例患者就診時絕大多數(shù)為西醫(yī)診斷確切，手術(shù)、化療后復(fù)發(fā)者。1.2一般資料：設(shè)置對照組和治療組。見表1表1兩組臨床資料1.3臨床分期：按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)1987年關(guān)于惡性腫瘤的TNM標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期。62例惡性腫瘤患者中，多數(shù)是中期(占83％)，并有不同情況的轉(zhuǎn)移，如淋巴結(jié)腫大，胃、腦、腹腔轉(zhuǎn)移，伴胸、腹水及發(fā)燒，出血，疼痛等。1.4臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢查，凡為陽性者可確診腫瘤：①胸片、x線、cr、MRI、干板等儀器檢查陽性(+)；②纖維支氣管鏡檢查陽性(+)；③活體組織取材經(jīng)病理組織檢查陽性(+)；④分泌物脫落細(xì)胞學(xué)檢查陽性(+)；⑤體腔積液抽水檢查陽性(+)；⑥凡遠(yuǎn)端器官或部位有轉(zhuǎn)移者；⑦臨床癥狀表現(xiàn)與上述有關(guān)診斷相結(jié)合的明確診斷。1.5治療方法：治療組應(yīng)用中藥組合物1劑/日，20天為一療程，共3個療程；對照組未用中藥組合物。兩組均同時進(jìn)行輔助治療，如祛胸水、腹水、止痛、止血、增進(jìn)食欲和通便等。1.6療效標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)病情進(jìn)行血、尿、便常規(guī)化驗和特異性指標(biāo)化驗，x線拍片、B超、CT等檢查，觀察臨床癥狀，如體重、咳嗽、進(jìn)食、疼痛、出血、體溫、呼吸、心率、胸水、腹水、腫瘤大小等。2.觀察結(jié)果，見表2表2兩組患者臨床總療效比較經(jīng)Ridit分析，兩組間有顯著性差異(P＜0.05)。實施例2：藥理學(xué)實驗所用的中藥組合物按照以下方法制備：按以下質(zhì)量份數(shù)稱取各原料藥：30-40份北豆根、15-25份地龍、30-50份黃芪、10-20份西洋參及15-25份五靈脂。將上述原料藥用蒸餾水浸泡1h后，煎煮2次，每次加入1L蒸餾水且每次煎煮30min，兩次水煎藥液混勻后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至100mL，制成水煎劑，并用4℃保存，用于以下研究：對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，以中藥組合物終濃度為80μg/ml、40μg/ml(中藥組合物高劑量組、低劑量組)，5-FU終濃度為50μg/mL(5-FU組)的培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)，對照組(對照組)用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)，進(jìn)行以下實驗：四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測PANC-1細(xì)胞增殖的抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測PANC-1細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期的情況；Real-timePCR法檢測PANC-1細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和VimentinmRNA的表達(dá)，以此探討中藥組合物抗腫瘤作用機理，具體通過以下實驗進(jìn)行：體外實驗：1.實驗材料中藥組合物由北豆根、地龍、黃芪、西洋參、五靈脂組成，按常規(guī)方法濃縮煎液成2g/mL的生藥濃度，滅菌后冷藏備用制備水煎液，4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ嗽灰认侔┘?xì)胞株P(guān)ANC-1，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。噻唑藍(lán)(MTT)(美國sigma公司)，改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(青霉素100μg/mL及鏈霉素100μg/mL)、消化胰酶(美國HyClone公司)，Trizol試劑盒、DEPC(上海生工生物工程)，ExScriptTMRT-PCRkit、RNAisoReagent(TAKARA公司)。2.主要儀器設(shè)備CO2培養(yǎng)箱(TC2323型)，超凈工作臺，數(shù)顯電熱恒溫干燥箱(202-2A型)，倒置相差顯微鏡(LH50A型)，酶聯(lián)免疫檢測儀(DG3022A型)，高速臺式離心機(TGL-16C型)，離心機(LD42型)，研究用顯微鏡(BH-2型)，ABI7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；2700型PCRSystem擴增儀(AppliedBiosystems公司)；UV-2550型紫外分光光度計(日本島津)。3實驗方法3.1藥物干預(yù)與分組取對數(shù)生長期的人胰腺癌PANC-1細(xì)胞，胰蛋白酶消化，1640培養(yǎng)液終止消化并反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105個/mL，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24h后，棄去原培養(yǎng)基，分別加入含中藥組合物終濃度為80μg/mL、40μg/mL的培養(yǎng)基(中藥組合物高、低劑量組)，含5-FU終濃度為50μg/mL的培養(yǎng)基(5-FU組)，以及正常培養(yǎng)基(對照組)，置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。3.2MTT法檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期PANC-1細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板。在規(guī)定時間加入MTT(5mg/mL)及DMSO，用酶標(biāo)儀在波長為490nm處檢測各孔的吸光度值(OD)。以上實驗重復(fù)3次。收集收據(jù)，計算藥物對PANC-1細(xì)胞抑制率。3.3FCM法檢測胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1的細(xì)胞凋亡將處于對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞株濃度調(diào)至2×105/mL，分別移入25cm2的培養(yǎng)瓶。每瓶均加入4mL，并放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)一天。分別給藥：中藥組合物高劑量組為終濃度48μg/mL的中藥組合物培養(yǎng)液；中藥組合物低劑量組為終濃度24μg/mL的中藥組合物培養(yǎng)液；5-FU組為終濃度50μg/mL的5-FU培養(yǎng)液；Control組為常規(guī)培養(yǎng)液。給藥后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中兩天，取出后PBS洗兩遍。胰蛋白酶消化3-5分鐘后，加培養(yǎng)液終止反應(yīng)。以1500rpm離心5分鐘，之后由PBS洗滌兩次。每管加AnnexinV-FITC試劑5μL，混合后進(jìn)行10min的室溫(20～25℃)避光孵育。再以1000rpm離心5分鐘，除去上清后，每管加結(jié)合緩沖液190μL。每管加10μL的碘化丙啶(Propidiumiodide，PI)進(jìn)行染色，混合后冰浴，同時注意避光。使用流式細(xì)胞儀檢測，在488nm激發(fā)波長處檢測紅色熒光，以及光散射的數(shù)據(jù)。以細(xì)胞儀自帶的軟件(CellQuest)收集所有數(shù)據(jù)，并進(jìn)行處理和分析。3.4FCM法檢測PANC-1細(xì)胞的細(xì)胞周期每組取對數(shù)生長期的胰腺癌PANC-1細(xì)胞以2×105/mL，4mL接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24小時后，給藥組加入中藥組合物終濃度為80μg/mL、40μg/mL的培養(yǎng)基，陽性對照組加入含5-FU終濃度為50μg/mL的培養(yǎng)基，空白對照組補足等體積的培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。PBS清洗2次，胰酶消化3～5min，加入二倍體積培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞于15mL離心管中，1500rpm離心5min，PBS洗兩遍，制成單細(xì)胞懸液。1500rpm離心取去除細(xì)胞碎片，用-20℃預(yù)冷70％乙醇固定，4℃過夜，1500rpm離心5min，棄上清液，每管加入碘化丙啶染色液至終濃度為50mg/L，避光，37℃孵育30min，用流式細(xì)胞儀檢測，用氬離子激光激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長為488nm，發(fā)射光波波長為650nm，每個樣本計數(shù)20000個細(xì)胞，應(yīng)用Multicycle軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。3.5熒光實時定量PCR檢測Snail、E-cadherinmRNA表達(dá)3.5.1抽提總RNA：按照RNAisoReagent操作說明書進(jìn)行提取，紫外分光光度計分析及瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的純度、濃度及其完整性。3.5.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在PCR擴增儀上，按ExScriptTMRT-PCRKit反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒方法操作，反應(yīng)參數(shù)：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42℃、15min，反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)95℃、2min。3.5.3PCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)采用SYBRPremixExTaq(PerfectRealTime)kit試劑，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物由TaKaRa公司設(shè)計合成，引物序列如下：PCR反應(yīng)條件如下：第一步是預(yù)變性，95℃，10s(1個循環(huán))。第二步是PCR反應(yīng)，95℃，5s；60℃，31s(40個循環(huán))。反應(yīng)結(jié)束后，使用SequenceDetectionsoftwareversion1.2.3軟件分析PCR過程各檢測樣本的Ct值。3.5.4統(tǒng)計學(xué)處理以β-actin為內(nèi)參校正，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)運用SPSS13.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間差異的顯著性分析用單因素方差分析。p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。4實驗結(jié)果4.1中藥組合物對胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖的影響表3中藥組合物對PANC-1細(xì)胞增殖的影響注：與對照組比較，P＜0.05表示為*，P＜0.01表示為**。結(jié)果如表3所示，中藥組合物高劑量組、中藥組合物低劑量組和5-FU組的細(xì)胞增殖抑制率分別為72.53％、44.62％、44.17％。與對照組比較，中藥組合物高、低劑量組的細(xì)胞增殖抑制率均有顯著性差異(P＜0.01)，有統(tǒng)計學(xué)意義。中藥組合物高劑量組的抑制作用高于5-FU組，中藥組合物低劑量組的抑制作用低于5-FU組。4.2中藥組合物對胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡率的影響表4中藥組合物對胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡率的影響組別給藥劑量(μg/ml)細(xì)胞凋亡率(％)中藥組合物高劑量組8036.51±2.70**中藥組合物低劑量組4027.03±4.60*5-FU組5013.21±0.34*對照組-5.63±2.31注：與對照組比較P＜0.05表示為*，P＜0.01表示為**。如圖1、圖2、圖3、圖4所示流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞凋亡的細(xì)胞圖分四個象限，分別可以看出機械損傷細(xì)胞或者壞死細(xì)胞(左上象限)，活細(xì)胞(左下象限)，晚期凋亡(右上象限)和早期凋亡細(xì)胞(右下象限)。晚期凋亡細(xì)胞以及早期凋亡細(xì)胞之和(即右上與右下象限細(xì)胞之和)為凋亡率。AnnexinV與PI染液雙染的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，中藥組合物高劑量組細(xì)胞凋亡率為(36.51±2.70)％，P40組細(xì)胞凋亡率為(27.03±4.60)％，5-FU組細(xì)胞凋亡率為(13.21±0.34)％，對照組細(xì)胞凋亡率為(5.63±2.31)％。與對照組比較，各組細(xì)胞凋亡率均明顯升高，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，中藥組合物高劑量組細(xì)胞凋亡率有顯著性差異(P＜0.01)，具體見表4、圖1、圖2、圖3、圖4。4.3中藥組合物對胰腺癌PANC-1細(xì)胞周期的影響表5中藥組合物對胰腺癌PANC-1細(xì)胞周期的影響組別G1期(％)S期(％)G2期(％)中藥組合物高劑量組62.7500±1.2537**21.0667±0.5361**16.1867±1.0071**中藥組合物低劑量組47.7333±1.2182**31.2200±0.7049**21.0467±0.5831**5-FU組46.2100±0.7935**40.5833±2.3471**13.2100±1.5623**對照組18.9400±0.702779.8233±2.57051.2333±0.1562注：與對照組比較P＜0.05表示為*，P＜0.01表示為**。如圖5、圖6、圖7、圖8所示利用PI染色及流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，與對照組相比，中藥組合物高劑量組與低劑量組，G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增多至(62.7500±1.2537)％、(47.7333±1.2182)％，S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)減少至(21.0667±0.5361)％、(31.2200±0.7049)％，G2期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)變化增多至(16.1867±1.0071)％、(21.0467±0.5831)％；5-FU組G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增多至(46.2100±0.7935)％，S期細(xì)胞減少至(40.5833±2.3471)％，G2期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增多至(13.2100±1.5623)％；與空白對照組相比，各期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均有顯著性差異(P＜0.01)，具體見表5、圖5、圖6、圖7、圖8。4.4中藥組合物對胰腺癌PANC-1細(xì)胞E-cadherinmRNA表達(dá)的影響表6中藥組合物對胰腺癌PANC-1細(xì)胞E-cadherinmRNA表達(dá)的影響組別E-cadherinCt值β-actinCt值2-ΔΔCt對照組19.07±0.0730.14±0.081.00±0.115-FU組17.90±0.0530.13±0.392.24±0.13*中藥組合物低劑量組17.28±0.2130.12±0.063.41±0.49*中藥組合物高劑量組16.59±0.1430.22±0.065.92±0.66**注：與對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01結(jié)果如表6顯示：與對照組比較，5-FU組、中藥組合物高低劑量組中E-cadherinmRNA表達(dá)顯著上調(diào)(p)；與5-FU組比較，中藥組合物高劑量組E-cadherinmRNA表達(dá)升高(P＜0.05)，表明中藥組合物作用效果優(yōu)于5-FU。4.5中藥組合物對胰腺癌PANC-1細(xì)胞N-cadheri表達(dá)的影響表7中藥組合物對胰腺癌PANC-1細(xì)胞N-cadherin和VimentinmRNA表達(dá)的影響注：與對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01結(jié)果如表7顯示：與模型組比較，5-FU組、中藥組合物高低劑量組中N-cadherin和VimentinmRNA表達(dá)顯著下調(diào)；與5-FU組比較，中藥組合物高低劑量組N-cadherin和VimentinmRNA表達(dá)降低(P＜0.05)，表明中藥組合物的作用效果強于5-FU。當(dāng)前第1頁1 2 3