本發明涉及一種豬瘟-豬圓環二聯亞單位疫苗及其制備方法和應用，屬于動物疫苗與獸用生物制品技術領域。

背景技術：

豬瘟是由豬瘟病毒(classicalswinefevervirus,csfv)引起的一種急性、熱性、致死性疾病。豬瘟具有高度接觸傳染性、發病急、高熱稽留和小血管壁變性引起廣泛出血、梗塞和壞死等病變特征。家養豬和野生豬是其唯一的天然宿主。世界動物衛生組織(oie)將其定為a類傳染病，我國《動物防疫法》將其列為一類傳染病。豬瘟是目前危害我國養豬業發展的主要疫病之一。

豬瘟病毒屬于黃病毒科、瘟病毒屬成員，為單鏈線狀rna病毒。病毒粒子略呈圓形，具有脂蛋白囊膜，病毒粒子表面有脆弱的纖突結構。csfv基因組全長約12.5kb，僅含有1個大的開放性閱讀框(orf)，此orf編碼約3898個氨基酸殘基、分子量約438kda的多聚蛋白。此多聚蛋白在翻譯的同時和在翻譯后經病毒與宿主細胞蛋白酶加工成12種成熟蛋白，依次為npro,c,erns,e1,e2,p7,ns2,ns3,ns4a,ns4b,ns5a,ns5b，其中c,erns,e1和e2為結構蛋白,其余為非結構蛋白。e2是csfv最主要的免疫原性蛋白，能夠誘導機體產生中和抗體并且能夠保護豬抵抗csfv強毒株的攻擊，也是研究豬瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。

豬圓環病毒2型(porcinecircovirus,pcv-2)被認為是仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征(pmws)、豬增生性壞死性肺炎(pnp)、豬皮膚與腎病綜合征(pdns)、豬呼吸系統疾病綜合征(prdc)、豬繁殖障礙、豬先天性震顫及腸炎等疾病的主要病原，統稱為豬圓環病毒2型相關疾病，而且pcv-2感染還會引起免疫抑制，極易導致其它病原混合感染或繼發感染，是目前嚴重危害我國養豬業的病原之一。在我國，目前幾乎100％的豬場為豬圓環病毒2型陽性。

pcv2是目前已知的最小的病毒之一，其基因組是一條共價閉合單鏈dna，約1.76kb～1.77kb。一般認為，pcv2僅有3個開放閱讀框(openreadingframes，orfs)可以編碼蛋白。其中orf2又稱為cap基因，位于互補鏈上，呈逆時針方向，負責編碼唯一的結構蛋白cap蛋白，其氨基酸長度為233～234氨基酸殘基。cap蛋白也是pcv2的主要抗原，能誘導中和抗體的產生并且能夠保護豬抵抗pcv2強毒株的攻擊，也是研究豬圓環病毒2型基因工程疫苗的重要靶蛋白。

在我們規模化養殖的發展中，由于頻繁引種、生物安全防范意識較差、管理不到位、人員專業素質較低等原因導致目前規模化豬場疾病多且雜，疫苗免疫仍是防治這些疾病爆發的首要選擇。因此，目前豬用疫苗很多，一頭商品豬在整個生長周期中，要進行多次免疫接種。在實際操作中，多針次、多劑量、多種疾病免疫程序難以合理安排，這樣既繁瑣、費時、費力、增加成本，而且容易造成遺漏，直接影響免疫效果和豬群的健康。因此，研究能同時預防2種或2種以上疾病的豬用疫苗是豬用獸用制品的一個發展方向。

目前，豬瘟疫苗主要是弱毒活疫苗，主要有3種，即豬瘟細胞活疫苗(細胞苗)、豬瘟乳兔組織活疫苗(組織苗)、豬瘟脾淋活疫苗(脾淋苗)。這些疫苗普遍存在生產工藝復雜、批間差異大、易受外援病毒污染等缺點，另外，由于長期使用活疫苗，導致無法從根本上凈化豬瘟。目前，圓環疫苗主要有全病毒滅活苗和桿狀病毒表達cap蛋白的滅活疫苗。由于目前豬瘟疫苗是活疫苗，若與其他疫苗配制聯苗，可能會導致豬瘟病毒與其他病毒的基因組或其他疫苗中殘留的核酸重組，易引起豬瘟病毒的變異，存在極大的生物安全隱患，不利于豬瘟與其他疾病研究聯苗；再次，活疫苗與其他疫苗聯用，可能會存在免疫干擾的問題，最后，有的將活疫苗與其他疫苗在制備聯苗時分開包裝，使用時再混合在一起，這樣一會造成包裝成本升高，二來不方便終端用戶使用。由于亞單位疫苗是病毒的抗原蛋白組成，不存在病毒重組和變異的隱患，也不存在免疫干擾的問題，更不用分開包裝并在使用時混合，因此是研究豬用聯苗一個非常好的方向。豬瘟病毒e2蛋白的等電點是6.3，而豬圓環病毒2型cap蛋白的等電點是9.4，在中性緩沖液中(如pbs、生理鹽水等)，豬瘟病毒e2蛋白帶正電荷，豬圓環病毒2型cap蛋白帶負電荷，因此兩種蛋白在同一體系中存放時間較長時，可能會結合從而沉淀，從而會影響聯苗的保存期和免疫效果。因此，在豬瘟和豬圓環二聯亞單位疫苗的研究中需要克服這一影響穩定性的重要問題。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題：一是開發一種可大規模工業化生產、質量好、無免疫干擾且能夠同時預防豬瘟病毒和豬圓環病毒2型感染的疫苗，二是克服目前規模化豬場存在的多針次、多劑量、多種疾病免疫程序難以合理安排的問題；三是克服利用豬瘟活疫苗研制聯苗時可能導致豬瘟病毒與其他病毒的基因組或其他疫苗中殘留的核酸重組，引起豬瘟病毒的變異，從而存在極大的生物安全隱患以及可能存在的免疫干擾的問題；四是避免使用豬瘟活疫苗制備二聯苗時需要將豬瘟病毒和其他疾病抗原分開包裝并在使用時混合的麻煩。

本發明提供了一種豬瘟-豬圓環二聯亞單位疫苗，所述疫苗包含豬瘟病毒e2蛋白、豬圓環病毒2型cap蛋白以及藥學上可以接受的佐劑；所述疫苗中每頭份含豬瘟病毒e2蛋白7.5～140μg，所述疫苗中每頭份含豬圓環病毒2型cap蛋白25～200μg。

本發明的技術方案中，所述豬瘟病毒e2蛋白為全長的豬瘟病毒e2蛋白、或截斷的豬瘟病毒e2蛋白。

本發明的技術方案中，所述豬圓環病毒2型cap蛋白為全長的豬圓環病毒2型cap蛋白、或截斷的豬圓環病毒2型cap蛋白。

本發明的技術方案中，所述疫苗中每頭份含豬瘟病毒e2蛋白為30μg。

本發明的技術方案中，所述疫苗中每頭份含豬圓環病毒2型cap蛋白為60μg。

本發明的技術方案中，所述藥學上可以接受的佐劑為水包油佐劑(如10號白油等)、水包油包水佐劑(如isa201vg佐劑、isa206vg佐劑等)、油包水佐劑(如isa15avg、isa35vg佐劑等)、水佐劑(如鋁膠佐劑、ims251cvg佐劑等)，優選的為montanidegel01pr佐劑。

本發明的技術方案中，所述疫苗還含有防腐劑，優選的防腐劑為硫柳汞，優選的硫柳汞的含量為2μg/頭份。

本發明還提供了一種制備豬瘟-豬圓環二聯亞單位疫苗的方法，該方法包括以下步驟：1)制備豬瘟病毒e2蛋白和豬圓環病毒2型cap蛋白；2)將1)中制備的豬瘟病毒e2蛋白和豬圓環病毒2型cap蛋白制備成抗原液；其中，每頭份含豬瘟病毒e2蛋白7.5～140μg，每頭份含豬圓環病毒2型cap蛋白25～200μg；3)將抗原液與montanidegel01pr佐劑按照質量比10:1混合攪拌。

本發明的技術方案中，優選的制備疫苗的抗原液中還含有防腐劑。

本發明的動物免疫實施例中，發現無論是豬瘟e2蛋白還是豬圓環病毒2型cap蛋白，表達全長蛋白制備的疫苗與表達截短的蛋白制備的疫苗在免疫原性方面相當。

本發明的動物免疫實施例中，發現，發現無論是豬瘟e2蛋白還是豬圓環病毒2型cap蛋白，二免前不同劑量的疫苗產生的抗體效價有差異，免疫高劑量的疫苗比免疫低劑量的疫苗產生的抗體效價要高，但是在二免后效價基本無差異。

本發明的動物免疫實施例中，發現免疫該豬瘟-豬圓環二聯亞單位疫苗與單獨免疫豬瘟亞單位疫苗或豬圓環亞單位疫苗相比，在免疫后存在一定的協同刺激作用，即在免疫后，聯苗的效價滴度較單獨免疫豬瘟亞單位疫苗或豬圓環亞單位疫苗效價滴度高，且基本上能夠達到甚至優于單獨免疫豬瘟亞單位疫苗或豬圓環亞單位疫苗的保護效果。

本發明繼續跟蹤了實施例中制備的疫苗的穩定性，發現實施例中制備的4批二聯疫苗與單獨的豬瘟e2亞單位疫苗和單獨的豬圓環病毒2型亞單位疫苗都能在4℃存放一年以上，這能夠滿足疫苗在規模化生產中的應用，能克服背景介紹中提及的二聯亞單位疫苗可能存在的穩定性較差的問題。

本發明提供了一種能同時預防豬瘟和豬圓環二聯亞單位疫苗，該疫苗具備免疫原性強、安全性好、不存在免疫干擾、不會導致病毒變異的生物安全隱患、能夠從根本上凈化豬瘟病毒和豬圓環病毒2型等優點；通過該疫苗進行免疫接種，可有效預防和保護豬免受豬瘟病毒和豬圓環病毒2型的感染，能夠達到“一針兩防”的效果，省時、省力、節約成本，能克服目前規模化豬場存在的多針次、多劑量、多種疾病免疫程序難以合理安排的問題、也能避免分開包裝和使用時混合的麻煩；同時，本發明制備的豬瘟、豬圓環二聯亞單位疫苗至少能夠在4℃儲存一年以上，能夠滿足產業化應用。

與現有技術相比，本發明首次明確提出了一種豬瘟-豬圓環二聯亞單位疫苗及其制備方法和應用。本發明的疫苗具有免疫原性強、安全性好、不存在免疫干擾、不會導致病毒變易的生物安全隱患、能夠從根本上凈化豬瘟病毒和豬圓環病毒2型等優點；且通過該疫苗進行免疫接種，可有效預防和保護豬免受豬瘟病毒和豬圓環病毒2型的感染，能夠達到“一針兩防”的效果，省時、省力、節約成本，能克服目前規模化豬場存在的多針次、多劑量、多種疾病免疫程序難以合理安排的問題、也能避免分開包裝和使用時混合的麻煩。

附圖說明

圖1a表示idexx豬瘟抗體檢測試劑盒檢測結果。

圖1b表示韓國金諾豬圓環抗體檢測試劑盒檢測結果。

具體實施方式

以下將結合附圖和實施例對本發明做進一步說明，本發明的實施例僅用于說明本發明的技術方案，并非限定本發明。

本發明試劑均是市售產品。

montanidegel01pr佐劑購自法國賽比克公司。

實施例1：豬瘟病毒e2蛋白和豬圓環病毒2型cap蛋白的制備

1.1豬瘟病毒e2蛋白制備：參照申請號為200810178235.4或200310103408.3或200810150304.0或201310300549.8或200810178235.4或201610625392.x或201510187995.1的發明專利中豬瘟e2蛋白的制備方法或者其他專利或文獻中的制備方法制備豬瘟e2蛋白，可根據實際需要制備全長的豬瘟e2蛋白或截短的豬瘟e2蛋白。

1.2豬圓環病毒2型cap蛋白制備：參照申請號為201310050003.1或201210270504.6或201110100331.9或201110053536.6或201010618223.6的發明專利中豬圓環病毒2型cap蛋白的制備方法或其他專利或文獻中的制備方法制備豬圓環病毒2型cap蛋白，可根據實際需要制備全長的豬圓環病毒2型cap蛋白或截短的豬圓環病毒2型cap蛋白。

實施例2：豬瘟-豬圓環二聯亞單位疫苗的制備(以制備1ml/頭份，共220g為例說明)

所用制備疫苗的耗材和材料都需預先經過無菌處理，制備過程是在生物安全柜或其他可以保證整個制備過程都無菌的儀器或環境中完成。

1.montanidegel01pr(佐劑)準備：根據抗原液和佐劑質量比為10:1，稱取佐劑質量為20g(約20ml)置于預先準備好的試劑瓶中，封口，待用。

2.根據抗原液和佐劑質量比為10:1，抗原液總質量為200g(約200ml)。根據豬瘟病毒e2蛋白濃度和豬圓環病毒2型cap蛋白濃度以及疫苗中各蛋白的含量，計算e2蛋白和cap蛋白取用的體積；用pbs緩沖液或其他緩沖液將抗原液總質量補充至200g(約200ml)，混勻，待用。其中，豬瘟病毒e2(csfv-e2)蛋白和豬圓環病毒cap(pcv2-cap)蛋白的濃度均為0.5mg/ml，疫苗中豬瘟病毒e2蛋白和豬圓環病毒cap蛋白含量分別為30μg/頭份(1ml/頭份)和60μg/頭份(1ml/頭份)，。具體配置如下表1所示：

表1

3.攪拌：將準備好的抗原液置于預先準備好的燒杯(根據制備量選擇大小合適的燒杯，如制備220ml選擇500ml的燒杯即可)中，調整好攪拌機的高度和速度，再將準備好的佐劑加大抗原液中，繼續攪拌20-30min。一般根據制備體積選擇攪拌速度和攪拌時間，如制備220ml疫苗，一般選擇500rpm/min攪拌20min即可。

4.分裝：穩定好的疫苗根據需要分裝并寫上標簽。

實施例3：豬瘟-豬圓環二聯亞單位疫苗免疫實驗

3.1疫苗制備：按照實施例1和2的方法制備蛋白和疫苗，具體疫苗信息見下表2所示：

表2

3.2免疫實驗：篩選28-35日齡仔豬35頭(csfv和pcv2抗原抗體陰性)，隨機分成7組，每組5頭，一組作為空白對照組，其他6組分別免疫疫苗1至疫苗6。空白對照組每次肌肉注射1ml生理鹽水，另外6組免疫組每次肌肉注射1ml相應的疫苗，初免三周后加強免疫一次，免疫前、二免前和二免后21天采集血清，檢測抗體效價。

實驗結果如圖1a所示，idexx豬瘟抗體檢測試劑盒檢測結果顯示：免疫豬瘟-豬圓環二聯亞單位疫苗(疫苗2)的豬瘟抗體效價在二免前較單獨免疫豬瘟病毒e2蛋白亞單位疫苗(疫苗5)的豬瘟抗體阻斷率較高，約高5％-10％，但在二免后兩組免疫組阻斷率基本保持一致，平均阻斷率均高于80％；不同劑量的豬瘟e2蛋白制備的疫苗，在二免前阻斷率有差異，疫苗中豬瘟e2蛋白含量越高，阻斷率相對要高，但在二免后阻斷率基本一致，均高于80％。

實驗結果如圖1b所示，韓國金諾豬圓環抗體檢測試劑盒檢測結果顯示：免疫豬瘟-豬圓環二聯亞單位疫苗(疫苗2)的豬圓環抗體效價在二免前較單獨免疫豬圓環病毒2型cap蛋白亞單位疫苗(疫苗6)的豬圓環抗體效價較高，s/p值約高0.1-0.2，但在二免后兩組免疫組s/p值基本保持一致，平均s/p值均高于1.5；不同劑量的豬圓環病毒2型cap蛋白制備的疫苗，在二免前s/p值有差異，疫苗中豬圓環病毒2型cap蛋白含量越高，s/p值相對要高，但在二免后s/p值基本一致，平均s/p值均高于1.5。

圖1a和圖1b的結果顯示，疫苗1和疫苗2的豬瘟抗體效價和圓環抗體效價基本一致。因此無論是豬瘟e2蛋白還是豬圓環病毒2型cap蛋白，表達全長蛋白制備的疫苗與表達截短的蛋白制備的疫苗在免疫原性方面相當。

本發明通過上面的實施例進行舉例說明，但是應當理解，本發明并不限于這里所描述的特殊實例和實施方案。在這里包含這些特殊實例和實施方案的目的在于幫助本領域中的技術人員實踐本發明。任何本領域中的技術人員很容易在不脫離本發明精神和范圍的情況下進行進一步的改進和完善，因此本發明只受到本發明權利要求的內容和范圍的限制，其意圖涵蓋所有包括在由附錄權利要求所限定的本發明精神和范圍內的備選方案和等同方法。