本發明涉及生物疫苗制備技術領域，具體涉及一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗及其制備方法和應用。

背景技術：

傳染性造血器官壞死癥（Infectious Hematopoietic Nec-rosis，IHN）是由傳染性造血器官壞死病毒（Infectious Hematopoietic Nec-rosis Virus，IHNV）感染引起的鮭鱒魚類的一種嚴重的急性、傳染性病毒病，該病毒屬于彈狀病毒科諾拉彈狀病毒屬，基因組為不分節段的單股負鏈RNA病毒。根據魚的種類、年齡、病毒株系以及環境條件的不同，IHN的爆發可能導致魚體80%～100%的死亡率，對世界鮭魚養殖業造成了重大損失。目前已成為制約鮭魚養殖發展的重要威脅，由于其發病急、發病率高，已被國際獸醫局OIE列為必須申報的疾病，被我國列為二類疫病。

對健康的魚體進行早期免疫接種是預防病毒病的常用方法。疫苗接種可以刺激魚類免疫系統產生特異性免疫反應，增強魚體抗病力，從而降低疾病的發生率。目前為了控制IHNV已經研制出2種類型的疫苗，即滅活疫苗、減毒疫苗。但由于病毒在體外擴繁效率較低，滅活疫苗生產成本昂貴，以及滅活不徹底而造成散毒的潛在危險等因素的存在，限制了其的廣泛使用。因此，研制安全、高效的新型傳染性造血器官壞死癥分子疫苗顯得非常必要。

活載體疫苗是近年來研究的熱點之一，被認為是一種很有開發前景的疫苗。制苗時往活載體中插入外源保護性目的基因，由于外源基因已經成為作為載體的病毒或細菌的自身結構的一部分，故所產生的免疫應答水平通常不低于完整病毒或細菌相應成分所引起的免疫強度。重組腺病毒載體具有宿主范圍廣，對外界有一定的抵抗力，被認為是基因工程疫苗的優良載體。復制缺陷型腺病毒常缺失對于病毒復制所必需的病毒早期基因E1區，使其在體內不能復制，因此研制重組復制缺陷型腺病毒傳染性造血器官壞死癥疫苗更為安全和有效。

傳染性造血器官壞死癥病毒有6種結構蛋白，其中糖蛋白G與病毒的感染和免疫有密切關系。Anderson et al首次報道了IHNV DNA疫苗的應用，通過使用含有IHNV G蛋白基因的質粒免疫虹鱒魚可以誘導虹鱒魚產生針對IHNV的保護性免疫。2005年7月，IHNV的DNA疫苗CMV啟動子操縱IHNV G蛋白基因的表達，已在加拿大被批準商品化。活載體疫苗具有安全、高效、生產費用低廉等優點，但目前尚未有傳染性造血器官壞死癥活載體疫苗上市。

技術實現要素：

本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種利用腺病毒載體表達傳染性造血器官壞死癥傳染性造血器官壞死癥病毒G蛋白制備傳染性造血器官壞死癥活載體疫苗的方法，獲得了安全、高效的傳染性造血器官壞死癥傳染性造血器官壞死癥疫苗。

為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為：一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗的制備方法，將傳染性造血器官壞死癥病毒抗原蛋白G基因插入到復制缺陷型腺病毒穿梭載體的特異性啟動子和終止子之間，構建得到含有G基因的重組復制缺陷型腺病毒穿梭載體，再將重組復制缺陷型腺病毒穿梭載體與腺病毒骨架載體通過同源重組得到重組腺病毒質粒，用重組腺病毒質粒產生基因組結構均一的重組腺病毒，即得到防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗。

進一步的，上述的一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗的制備方法，所述傳染性造血器官壞死癥病毒抗原蛋白G基因是通過PCR方法擴增出的，擴增引物序列分別為SEQ ID No.1（GF）和SEQ ID No.2（GR）。

SEQ ID No.1（GF）：5’GCAGATCTGCCACCgccaccatgtacaccatg 3’ （含有BglⅡ酶切位點）；

SEQ ID No.2（GR）：5’ GCGTCGttaggaccggtttgccagg 3’ （含有SalⅠ酶切位點）。

進一步的，上述的一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗的制備方法，所述重組復制缺陷型腺病毒穿梭載體的構建過程中，腺病毒載體啟動子為CMV，終止子為PolyA；

構建過程具體包括以下步驟：

1）將擴增得到的目的基因G經BglⅡ、SalⅠ雙酶切，形成帶有粘性末端的目的基因片段；

2）同時，將腺病毒穿梭載體PAdTrack-CMV經BglⅡ、SalⅠ雙酶切，得到線性化的載體；

3）使用T4 DNA連接酶對步驟1）和2）的產物進行粘端連接；

4）按常規方法將連接產物轉化大腸埃希氏菌，在含卡那抗性的瓊脂平板上篩選，挑選克隆后，提取質粒；

5）采用酶切、PCR擴增方法鑒定，得到陽性重組質粒，命名為PAdTrack-CMV/G；

鑒定方法是指采用PCR和限制性內切酶鑒定，進行瓊脂糖凝膠電泳分析檢測的方法，來確定抗原蛋白G基因是否已經整合到腺病毒載體中。

進一步的，上述的一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗的制備方法，重組腺病毒質粒的獲得包括以下步驟：

1）將重組復制缺陷型腺病毒穿梭載體PAdTrack-CMV/G用Pme I單酶切以線性化；

2）取PAdEasy-1與步驟1）得到的線性化后的重組復制缺陷型腺病毒穿梭載體混合，高壓電轉化大腸桿菌BJ5183；

3）電轉后將細胞在培養液中復蘇，取細胞涂入含卡那霉素的培養板中，培養；

4）挑選卡那霉素抗性克隆，小量提取質粒DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳遷移率分析，并進行限制性內切酶圖譜分析；

5）將所得的重組腺病毒質粒高壓電轉化入宿主菌，從此宿主菌中獲得的大量高質量質粒中挑選目的克隆，所述宿主菌為DH10B。

進一步的，上述的一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗的制備方法，重組腺病毒質粒產生基因組結構均一的重組腺病毒，包括以下步驟：

1）將重組腺病毒質粒，用Pac I酶切，完全消化以切去包括Ori和Kan抗性基因在內的質粒構件，并暴露其反轉末端重復序列；

2）脂質體介導的轉染，在組織培養皿中接種293細胞進行轉染；

3）取病毒上清接種293細胞，以含2%小牛血清的完全DMEM培養液于培養箱中培養，逐日觀察細胞病變，至293細胞完全病變；

4）收集病毒感染的病變細胞，檢測抗原蛋白G基因的表達，再連同上清液凍存；檢測抗原蛋白G基因表達的方法為：利用倒置顯微鏡觀測細胞病變和熒光顯微鏡觀測報告基因綠色熒光蛋白的表達來確定抗原蛋白G-基因是否獲得表達。

進一步的，上述的一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗的制備方法，所述步驟2）中脂質體介導的轉染，包括以下步驟：

a）稀釋Pac I酶切線性化的重組腺病毒質粒至DMEM培養液中；

b）再將脂質體懸液加至DMEM培養液中，充分將二者混勻，室溫下溫育；

c）在此期間吸棄細胞原培養液，用DMEM培養液洗細胞一次；

d）往每平皿中加DNA/脂質體復合物，在5%CO₂培養箱中溫育后吸棄含DNA/脂質體復合物的培養液；

e）補加含10%小牛血清的DMEM完全培養液，繼續培養，脂質體轉染后收集細胞，反復凍融。

本發明的第二個目的是提供了上述一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗的制備方法制備得到的含有抗原蛋白G基因的傳染性造血器官壞死癥病毒活載體疫苗。

本發明的第三個目的是提供了上述含有抗原蛋白G基因的傳染性造血器官壞死癥病毒活載體疫苗在制備預防或治療虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的藥物中的用途。

本發明的有益效果為：

本發明將傳染性造血器官壞死癥毒G蛋白基因構建得到含有傳染性造血器官壞死癥傳染性造血器官壞死癥毒G基因的重組腺病毒質粒，進而得到基因組結構均一的重組腺病毒。本發明方法制備得到的傳染性造血器官壞死癥傳染性造血器官壞死癥活載體疫苗，其以傳染性造血器官壞死癥病毒蛋白G為基礎，可誘導機體產生免疫應答，獲得免疫效果。

構建重組腺病毒工作中的限速步驟是將目的基因整合入腺病毒基因組，目前這一關鍵過程中大都是以哺乳動物細胞中同源重組方式實現的，有一定的難度。同時，因重組效率不高，所得的重組病毒常常需要空斑純化，故實驗周期較長，而且也不能保證重組腺病毒基因組結構的均一性。本發明利用生長周期快，操作簡便的大腸桿菌細菌實現質粒間同源，從而很快的獲得均一的重組腺病毒載體。

綜上所述，本發明得到的重組復制缺陷型腺病毒傳染性造血器官壞死癥傳染性造血器官壞死癥疫苗較之現有傳染性造血器官壞死癥傳染性造血器官壞死癥疫苗更為安全和有效，且制作周期較短。

附圖說明

圖1為重組穿梭載體PAdTrack-CMV/G-酶切及PCR鑒定圖。

其中，1為5000marker，2為雙酶切，3為PCR結果。

圖2為重組腺病毒質粒鑒定圖。

其中，1為λ-EcoT14 I digest marker，2為Pac I 酶切，3為PCR結果。

圖3為利用倒置顯微鏡觀測細胞病變圖和利用熒光顯微鏡觀測綠色熒光蛋白的表達圖。

其中，左圖為普通顯微鏡觀察結果，右圖為熒光顯微鏡觀察結果。

圖4為表達重組腺病毒穿梭載體的構建圖。

具體實施方式

實施例1：

傳染性造血器官壞死癥活載體疫苗的制備：

用本實施例方法可以制備得到用于直接接種動物的復制缺陷型腺病毒傳染性造血器官壞死癥傳染性造血器官壞死癥活載體疫苗。包括以下過程，參照圖4：

一、制備目的基因

設計引物，通過PCR的方法擴增出傳染性造血器官壞死癥病毒(Infectious Hematopoietic Nec-rosis Virus，IHNV)抗原蛋白G基因；所設計的抗原蛋白基因G的擴增引物為：

GF：5’GCAGATCTGCCACCgccaccatgtacaccatg 3’ （含有BglⅡ酶切位點）

GR：5’ GCGTCGttaggaccggtttgccagg 3’ （含有SalⅠ酶切位點）

其中，ATG為起始密碼子；傳染性造血器官壞死癥病毒G基因以傳染性造血器官壞死癥毒aG毒株為模板使用引物對GF/GR進行擴增。

GF位于傳染性造血器官壞死癥毒aG株全序列3318處；GR位于傳染性造血器官壞死癥毒aG株全序列4893處；

二、構建重組復制缺陷型腺病毒穿梭載體

將擴增得到的傳染性造血器官壞死癥毒G基因插入到復制缺陷型腺病毒穿梭載體特異性啟動子CMV和終止子之間PolyA，構建成含有基因G的重組復制缺陷型腺病毒穿梭載體，命名為PAdTrack-CMV/G；

具體包括以下操作步驟：

1)將回收得到的目的基因G經BglⅡ、SalⅠ雙酶切，形成帶有粘性末端的目的基因；

2)同時，將腺病毒穿梭載體PAdTrack-CMV經BglⅡ、SalⅠ雙酶切，得到線性化的載體；

3)使用T4 DNA連接酶對上述產物進行粘端連接；

4)按常規方法將連接產物轉化大腸埃希氏菌JM109，在含卡那抗性的瓊脂平板上篩選，挑選克隆后，提取質粒；

5)采用酶切、PCR擴增方法鑒定，得到陽性重組質粒PAdTrack-CMV/G。

所述的檢測G基因已經整合到腺病毒載體中，采用PCR和限制性內切酶鑒定，進行瓊脂糖凝膠電泳分析。將所獲得的含有目的基因G的重組穿梭載體PAdTrack-CMV/G經BglⅡ、Xba I雙酶切鑒定可切出約3.0KB的目的片段，同時PCR鑒定也可擴增出大小相符的G基因目的片段(圖1左)；將所獲得的含有目的基因G-通過與標準分子量對比可判斷。

三、獲得復制缺陷型腺病毒質粒

將獲得的重組復制缺陷型腺病毒穿梭載體PAdTrack-CMV/G與腺病毒骨架載體PAdEasy-1通過在大腸桿菌中質粒間同源重組從而得到重組腺病毒質粒，具體包括以下操作步驟：

1)將重組穿梭載體分別用Pme I單酶切以線性化；

2)取0.1mg PAdEasy-1與1.0mg線性化重組穿梭載體混合，高壓電轉化大腸桿菌BJ5183；

3)電轉后將細胞在LB培養液中于37℃復蘇30min，取細胞涂入含50mg/Ml卡那霉素的培養板中，于37℃培養16～20h；

4)挑選卡那霉素抗性克隆，小量提取質粒DNA，用0.8％瓊脂糖凝膠進行電泳遷移率分析，并進行限制性內切酶圖譜分析，結果如圖2所示，從圖2可以看到同源重組后檢測目的基因已經整合入腺病毒載體，通過瓊脂糖凝膠電泳分析可見重組質粒明顯落后于骨架載體，限制性內切酶酶切后可見約4.5KB和33KB的條帶，其結果與預期相符；得到的陽性重組質粒命名為PAdEasy-G；

5)將所得的重組腺病毒質粒以高壓電轉化入宿主菌DH10B(Rec A，End A)，在此宿主菌中可獲得大量高質量的質粒，挑取目的克隆。

四、用重組腺病毒質粒產生基因組結構均一的重組腺病毒，包括以下操作：

1)酶切，取從DH10B中提取的各重組腺病毒質粒PAdEasy-G 4μg，用Pac I酶切，完全消化以切去Ori和Kan抗性基因等質粒構件，并暴露其反轉末端重復序列ITR；

2)轉染，脂質體介導的轉染，在35mm組織培養皿中接種293細胞進行轉染，所述的脂質體介導的轉染包括以下分操作：

①稀釋Pac I酶切線性化的重組腺病毒質粒4μg至250ul DMEM培養液中；

②然后將脂質體LipofectAMINE2000懸液10μl加至250ul DMEM培養液中，充分將二者混勻，室溫下溫育20min；

③在此期間吸棄細胞原培養液，用DMEM培養液洗細胞一次；

④往每平皿加500ul DNA/脂質體復合物，在37℃，5％CO₂培養箱中溫育3～5h后吸棄含DNA/脂質體復合物的培養液，

⑤補加3ml含10％小牛血清的DMEM完全培養液，繼續培養7天，脂質體轉染后，收集細胞，反復凍融3次。

3)接種，取病毒上清接種293細胞，以含2％小牛血清的完全DMEM培養液于37℃、5％CO2培養箱中培養，逐日觀察細胞病變CPE，至293細胞完全病變；

4)凍存，收集病毒感染的病變細胞，連同上清凍存于-20℃，構建得到的含有抗原蛋白G基因的重組腺病毒，命名為Ad-IHN-G。

檢測G基因是否獲得表達，采用觀測綠色熒光蛋白表達的辦法包括利用倒置顯微鏡觀測細胞病變，可見對照細胞正常生長，而轉染細胞出現明顯的細胞病變。利用熒光顯微鏡可直接觀測到報告基因綠色熒光蛋白的表達。其結果圖3所示。

將經檢測合格的重組腺病毒制成傳染性造血器官壞死癥活載體疫苗，直接注射動物進行免疫。

最后應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。

序 列 表

<110> 蘭州威特森生物科技有限公司

<120> 一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗及其制備方法和應用

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 擴增引物序列（GF）

<400> 1

gcagatctgc caccgccacc atgtacacca tg 32

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 擴增引物序列（GR）

<400> 2

gcgtcgttag gaccggtttg ccagg 25

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<120> 一種防治虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的活載體疫苗及其制備方法和應用

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<211> 32

<212> DNA

<213> 擴增引物序列（GF）

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<212> DNA

<213> 擴增引物序列（GR）

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