專利名稱：一種抗RNA病毒siRNA分子的設計方法
技術領域：
本發明屬于RNA干擾技術領域，特別涉及一種抗RNA病毒siRNA分子的設計方法。
背景技術：
RNA類病毒種類很多，分布廣泛，水生和陸生動物以及人類均有感染。如對水生養殖蝦類造成嚴重威脅的桃拉病毒(TSV)、羅氏沼蝦諾達病毒(MrNV)、傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)和對陸生動物包括人類危害巨大的流感病毒(Flu virus)、人甲型肝炎病毒(HAV)、艾滋病毒(HIV)，以及各種冠狀病毒如嚴重急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)等。由于RNA病毒在RNA的復制過程中，其錯誤修復機制的酶的活性很低，幾乎是沒有的，所以其變異很快；而疫苗是要根據病毒的固定基因或蛋白進行開發制作的，所以RNA病毒疫苗較難開發！RNA干擾技術，作為一種以短雙鏈RNA(SiRNA)代替傳統反義核酸的轉錄后基因沉默機制，自2002年被《Science》評為年度10大突破以來，已經被迅速而廣泛地應用到了基因功能、基因表達調控機制等熱門領域，并為疾病基因治療、抗病毒感染開辟了新的途徑。相對于傳統基因治療對基因水平上的敲除，整個流程設計更簡便，作用更迅速，效果更明顯，成為研究人員公認的高效特異、經濟便捷的研究工具，在細胞水平和動植物體內均表現出高效特異的抗病毒能力。由于RNA干擾技術是轉錄后基因沉默機制，直接靶標是病毒轉錄產生的mRNA，那么對于RNA病毒尤其是正鏈RNA病毒而言，RNA干擾技術就可直接降解病毒基因，因此RNAi技術對于RNA類病毒的防治而言無疑是一個上佳之選。許多研究結果也證實，RNA干擾技術抗病毒領域取得了預期的成果。但是，由于抗病毒用siRNA僅僅是21個堿基對的短小序列，根據常規的小RNA設計原則，多數病毒基因組將產生成百上千個候選siRNA。尤其是像冠狀病毒科成員那樣的基因組巨大的RNA病毒，根據常規設計原則將需要花費大量的人力、物力，用來篩選在實際應用中能高效抗病毒的siRNA(由于目標RNA的空間結構等原因，導致許多理論上符合“有效”原則的siRNA在實際應用中無效或低效)。因此，如何有效縮小高效siRNA的篩選范圍一直是RNA干擾技術研究人員探究的熱點問題，也是關系到能否有效降低RNA干擾技術的研究與應用成本，使其最終能在生產實踐中得到推廣、應用的關鍵問題。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種抗RNA病毒siRNA分子的設計方法，該方法設計的siRNA分子，將在保證獲得高效抗病毒siRNA的前提下，大幅縮小RNA分子篩選范圍，顯著降低抗病毒研究和應用成本，有利于RNA干擾技術在抗RNA病毒領域的推廣和應用。本發明中一種抗RNA類病毒siRNA分子的設計方法，包括(I)在RNA病毒的基因組中選擇序列保守的病毒酶的編碼基因作為siRNA的靶標；
(2)利用siRNA設計軟件生成抗RNA類病毒的小RNA分子；(3)根據siRNA設計規則，篩選理論上高效的siRNA用于實驗研究。所述步驟(I)中的序列保守的RNA病毒酶為RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)。所述步驟(3)中的小RNA分子的抗病毒應用形式為，把小RNA分子構建成含RNA聚合酶III啟動子U6的表達質粒。表I是shRNA在TGEV不同結構基因和RdRP基因上的靶向序列。其中，shPl和 shP2靶向TGEV RdRP基因，而shSl、shS2、shM、shNl和shN2分別靶向TGEV的不同結構基因；shT靶向與TGEV基因沒有同源性的一段任意序列，用作顯示shRNA干擾特異性的對照。表I
shRNA靶向序列
shPl5--GTACTGGGATCGCACATAT-3 ’
shP2 5'-GGCAAGAGCTCGTACAGTA-3， shS I 5'-CCAGTGGAATCTC ATTGAA-3 ’shS25'-CTAGTTCTGACTTTGTTCA-3J
shM 5'-GAAGTTGAAAGCAAGTAGT-3， shNl 5'-CAAGAAGGATGACAGTGTA-3 ’ shN2 5'-GGATGACAGTGTAGAACAA-3， shT5'-GACTTCATAAGGCGCATGC-3，我們通過對RNA病毒一TGEV進行細胞水平的RNA干擾研究發現，在分別靶向病毒RdRP基因和結構蛋白基因的siRNA中，兩個靶向RdRP的小RNA表現出遠遠高于其他siRNA的抗病毒效果。隨后在小型豬體內水平進行的抗病毒應用研究，進一步證實了這兩個siRNA分子抗病毒的高效性和特異性。有益效果本發明把siRNA的作用靶標鎖定在RNA依賴的RNA聚合酶，有兩個意義(I)RdRP保守程度高，對于容易變異的RNA病毒而言很重要，因為根據Genbank中的序列設計的siRNA，有可能靶向的病毒本身在該處出現了序列變異，而研究表明，即使I個堿基的變化都會導致siRNA的抗病毒效果大幅降低。(2)部分RNA病毒如冠狀病毒基因組巨大。以TGEV為例，得到的理論上“有效”的siRNA將大于1000個。如果把這些siRNA全部在細胞水平進行篩選研究，無疑將耗費大量的人力、物力。而根據本發明設計的siRNA分子，將在保證獲得高效抗病毒siRNA的前提下，大幅縮小RNA分子篩選范圍，顯著降低抗病毒研究和應用成本，有利于RNA干擾技術在抗RNA病毒領域的推廣和應用。


圖I是CPE分析不同shRNA表達載體對TGEV的抑制作用。其中，m表示孔中部細胞，s表示孔邊緣細胞；normal是陰性對照(未處理的正常細胞)；mock是陽性對照(只感染TGEV);圖2是MTS法分析不同shRNA表達載體對ST細胞的保護作用。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。 實施例I 小RNA分子的設計與合成(I)分別選取TGEV結構蛋白和RdRP的編碼基因；(2)利用軟件生成抗TGEV的siRNA分子。(3)按照已公布的小RNA序列設計規則，選擇理論上高效的siRNA分子，并構建成發卡型小RNA(shRNA)分子(表I)。(4) shRNA分子插入載體構建成含U6啟動子的質粒表達載體。實施例2shRNA表達質粒轉染ST細胞(I) ST細胞(2-3 X IO4個/孔)接入48孔板于完全DMEM中培養；(2)向轉染試劑 TransFast transfection reagent 中加入 400 μ I 無 DNase 水，漩渦震蕩溶解，_20°C保存；(3)溶解質粒DNA1. 2 μ g溶于300 μ I無血清無雙抗培養基中；(4)室溫溶化轉染試劑并渦旋，取3. 6 μ I加入DNA/DMEM混合物中，渦旋混勻；室溫孵育10-15分鐘，形成轉染復合物；(5)移去ST細胞中的培養基，加入轉染復合物100 μ I/孔，繼續于37°C 5% CO2培養箱中孵育I小時；向ST細胞中加入400 μ I無雙抗完全培養基(含5% NBS);在37°C,5% CO2的培養箱中繼續培養。實施例3TGEV感染ST細胞shRNA表達質粒轉染ST細胞28h后移去細胞培養基，按200CCID5(I的量接種TGEV。40h后，分析細胞病變、細胞毒性(MTS)或抽提病毒RNA做定量RT-PCR檢測。。實施例4細胞病變(CPE)分析因為TGEV復制增殖而導致的細胞病變非常典型，在普通顯微鏡下即可清楚顯示是否出現了細胞病變以及病變的程度。所以，在對細胞轉染shRNA表達載體并感染TGEV后，我們即可通過對細胞病變的觀察，比較不同shRNA表達載體抑制病毒復制、抵抗細胞病變的能力。從圖I中，我們可以看出，在接毒40h后，靶向RdRP基因的shP2和shPl表達質粒轉染孔未出現細胞病變或只在培養孔邊緣呈現微弱的疑似“病變”(說明=TGEV病變一般從孔邊緣開始向孔中部漫延)，而其他靶向TGEV結構基因的shRNA干擾孔均出現了 TGEV特征性病變，只是病變程度不同。其中，shSl和shNl表達質粒的抗病變能力稍強，只在孔的邊緣出現不同程度的病變，而shS2、shM和shN2干擾孔的病變程度較重，幾乎整孔細胞出現病變。而且，shS2和shN2干擾孔的病變與非特異干擾孔shT的情況接近。CPE分析結果表明，大多設計的shRNA均顯示了對TGEV在ST細胞中增殖的抑制作用，但是，靶向RdRP基因的shRNA對TGEV的抑制效果明顯好于靶向結構基因的shRNA。實施例5
細胞毒性(MTS)試驗ST細胞(1-1.5X104個/孔)按48孔板同樣的方法在96孔板進行質粒轉染和病毒感染試驗，每孔質粒和病毒量分別為48孔板的一半。接毒36h后，按MTS試劑說明，向100μ I/孔培養基中加入20μ I/孔MTS后繼續在37°C，5%C02的培養箱中孵育4小時。最后在492nm處測定各孔液體吸光值。通過MTS試驗準確測量TGEV感染后各干擾孔的活細胞數量，可以準確顯示各shRNA表達載體對ST細胞的保護程度，反映各自抗TGEV感染的能力。圖2縱坐標表示不同shRNA干擾孔的吸光值。我們可以清楚地看出，靶向病毒RdRP基因的兩個shRNA干擾孔的吸光值僅次于陰性對照(正常細胞)孔，而遠遠高于其他shRNA干擾孔的值。也就是說，靶向病毒RdRP基因的兩個shRNA干擾孔中活細胞最多。顯而易見，各shRNA表達載體干擾孔中活細胞的數量關系與CPE分析的結果基本一致。CPE和MTS的分析結果均證明，靶向病毒RdRP基因的shRNA的抗病毒效果顯著好于靶向病毒結構基因。
權利要求
1.一種抗RNA病毒SiRNA分子的設計方法，包括 (1)在RNA病毒的基因組中選擇序列保守的病毒酶的編碼基因作為siRNA的靶標； (2)利用siRNA設計軟件生成抗RNA病毒的小RNA分子； (3)根據siRNA設計規則，篩選理論上高效的siRNA用于實驗研究。
2.根據權利要求I所述的一種抗RNA病毒siRNA分子的設計方法，其特征在于所述步驟(I)中的序列保守的RNA病毒酶為RNA依賴的RNA聚合酶。
3.根據權利要求I所述的一種抗RNA病毒siRNA分子的設計方法，其特征在于所述步驟(3)中的小RNA分子的抗病毒應用形式為把小RNA分子構建成含RNA聚合酶III啟動子U6的表達質粒。
全文摘要
本發明涉及一種抗RNA類病毒siRNA分子的設計方法，包括(1)選擇RNA病毒內部、序列保守的RNA依賴的RNA聚合酶作為siRNA的靶標；(2)利用siRNA設計軟件生成抗RNA病毒的小RNA分子；(3)根據siRNA設計規則，篩選理論上高效的siRNA用于實驗研究；(4)小RNA分子的抗病毒應用形式為含RNA聚合酶III啟動子U6的表達質粒。運用本方法選擇抗病毒靶標序列可顯著提高獲得高效抗病毒小RNA分子的幾率，大幅縮小RNA干擾靶點的選擇范圍，提高工作效率，顯著降低RNA干擾技術研究和應用成本。
文檔編號C12N15/113GK102643815SQ20121006323
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月12日 優先權日2012年3月12日
發明者華修國, 周俊芳, 崔立, 房文紅 申請人:中國水產科學研究院東海水產研究所